耐鎘細菌不同配施方式對煙葉鎘含量及品質的影響

何聲寶, 劉 楠，羅安娜，馮曉民,王英元,張 威

(國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心,河南 鄭州 450001)

耐鎘細菌不同配施方式對煙葉鎘含量及品質的影響

何聲寶, 劉 楠，羅安娜，馮曉民,王英元,張 威*

(國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心,河南 鄭州 450001)

為明確從鎘污染植煙土壤中篩選得到的耐鎘細菌TU菌及其不同配施方式對煙葉鎘含量及品質的影響，進一步揭示其對土壤鎘污染的修復效果，設置對照(CK)、TU菌(T1)、TU菌+腐殖酸(T2)、TU菌+尿素(T3)、TU菌+磷酸鉀(T4)5個處理進行大田試驗，比較5個處理煙葉鎘含量、外觀質量、化學成分及評吸質量的差異。結果表明：與CK比較，T1、T2、T3、T4處理烤后煙葉的鎘含量分別降低了32.79%、44.75%、-18.20%、32.46%；不同處理煙葉外觀質量表現為T2>T4>T1>CK>T3；化學成分以T2和T1處理最為協(xié)調，T3處理最差；評吸質量得分表現為T2>T4>T1>CK>T3。因此，生產過程中施用TU菌對煙葉有降鎘提質作用，腐殖酸對TU菌降低煙葉鎘含量和提高煙葉質量的功效具有加成作用。

耐鎘細菌； 煙葉； 鎘含量； 品質

隨著吸煙與健康課題的深入探討，重金屬研究逐漸成為煙草減害的熱點之一。鎘具有毒性大、易積累、在煙氣中遷移比例高等特點[1-2]，是煙草控制框架公約(FCTC)優(yōu)先披露的有害成分之一。煙葉中的鎘主要來源于土壤[3]，在煙株生長過程中經根部吸收最終富集在煙葉中。有研究表明，鎘污染導致烤煙煙葉化學成分不協(xié)調，不利于煙葉吃味的形成，大大降低煙草品質[4]。

隨著人類對鎘危害意識的增強，對植煙土壤中鎘修復方法的研究更為廣泛。目前，土壤鎘修復方法主要有物理法、化學法和生物法等。物理方法是指利用物理機械治理重金屬污染土壤[5]，但該方法能耗大、修復周期長?；瘜W方法是指利用酸/螯合劑等達到修復的目的，但對土壤破壞嚴重，存在二次污染[6-8]。有研究表明,腐殖酸、磷酸鉀、尿素均對鎘有一定的鈍化功能[9-11]，但是前人研究僅處于實驗室階段，并未結合生產實際進行大田試驗。生物修復方法是指利用一些微生物，通過胞外絡合[12-15]、胞外沉淀[16]、胞內積累[17]等方式，降低重金屬在土壤中的有效濃度，達到修復的目的[18]，該方法不存在二次污染，具有對土壤破壞性小、修復周期短等特點，近年來得到廣泛關注。Lebeau等[19]研究發(fā)現，細菌ZAN-044在一定條件下對鎘的吸附率為69%；劉紅娟等[20]研究顯示，蠟樣芽胞桿菌通過細胞內外的沉積作用來降低土壤中鎘的有效含量；畢娜等[21]篩選出2株對鎘具有吸附能力的革蘭氏陰性細菌。目前該類技術也只是處于實驗室研究階段，并未進行大田試驗驗證，而且針對植煙土壤鎘的生物修復方法還未見報道。鑒于此，基于在前期試驗中從鎘污染的植煙土壤中篩選出1株特定耐鎘細菌TU菌的基礎上，將TU菌分別與腐殖酸、尿素、磷酸鉀配施進行大田試驗，比較了不同處理對煙草各生育時期鎘含量、煙葉外觀質量、化學成分及評吸質量的差異，旨在揭示TU菌及其不同配施方式在煙草生產過程中對植煙土壤的生物修復效果，為有效控制煙葉中鎘含量提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況及供試材料

試驗地為百色市煙草公司試驗田，多年用于煙草重金屬相關試驗研究，共3 400 m2。供試土壤基本理化性狀[22]：全氮3.22 g/kg、有機質43.70 g/kg、有效鉀16.00 mg/kg、速效鉀98.00 mg/kg，土壤 pH值為8.02；鎘含量達到3.62 mg/kg，遠高于Ⅲ級土壤標準[23]，屬于重金屬鎘中重度污染土壤。

供試煙草品種為云煙97。TU菌的來源：選取鎘污染植煙土壤，由清華大學研究人員通過液相富集法進行分離、篩選、優(yōu)化、培養(yǎng)后，得到1株耐鎘、耐鹽的突變細菌菌株，該菌株由北京協(xié)和醫(yī)院提取其DNA用于菌種鑒定，菌株16S rDNA 序列與陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)的16S rDNA序列同源性為100%，故該菌株為陰溝腸桿菌，命名為TU。結合標準方法[24-25]鑒定其生理生化特性，通過鎘脅迫試驗發(fā)現，TU菌分泌的細胞外多糖能夠與可交換態(tài)鎘絡合，降低鎘的活性。腐殖酸(原粉，有機質含量≥95%)由山西億豐腐植酸廠生產。尿素(總氮≥46.4%)由山東瑞星化工有限公司提供。磷酸鉀(分析純)購自南京化學試劑股份有限公司。

1.2 試驗設計

試驗共設對照(CK，即不做任何處理，同當地正常生產方法)、TU菌(T1)、TU菌+腐殖酸(T2)、TU菌+尿素(T3)、TU菌+磷酸鉀(T4)5種處理。根據預試驗結果：隨著TU菌劑(光密度OD600值為75)加入量的增加，土壤交換態(tài)鎘含量呈下降趨勢，當1 m2土壤中(深度為30 cm)加入菌劑10 mL以后，土壤交換態(tài)鎘含量趨于穩(wěn)定，故選擇100 L/hm2作為TU菌(光密度OD600值為75)的用量；同樣，結合文獻[9-11]進行預試驗，結果表明，當1 m2土壤中(深度為30 cm)施用腐殖酸、尿素、磷酸鉀用量分別在75.0、37.5、75.0 g/m2時，土壤中鎘含量最低，故本試驗選取750、375、750 kg/hm2分別作為腐殖酸、尿素、磷酸鉀的大田試驗用量。

各處理中的TU菌、腐殖酸、尿素、磷酸鉀均在煙苗移栽前24 h均勻施入土壤表層，隨后翻耕混勻。每個試驗處理小區(qū)面積為667 m2左右。4種處理和CK的田間施肥(基肥、追肥)水平及管理完全一致，參照百色市2015年特色優(yōu)質煙葉生產技術方案執(zhí)行。

1.3 方法

1.3.1 取樣 煙苗移栽后，依據實際生長情況分別在苗期、伸根期、旺長期、成熟初期、成熟采收期取煙葉樣品。每次取樣每個處理分10個點各取1株(第1次每個點取3株，確保檢測量)，要求10個點均勻分布在處理小區(qū)內(每個點都進行GPS定位)。對所取煙葉用去離子水洗凈，烘干，粉碎，過0.15 mm篩，用于測定重金屬鎘含量。煙葉成熟采收后，統(tǒng)一烘烤。每個處理取C3F煙葉樣品3 kg進行鎘含量、外觀質量、化學成分、評吸質量檢測與分析，重復3次取樣。

1.3.2 鎘含量測定 按照YC/T 380—2010[26]進行重金屬鎘含量的測定，所用儀器為電感耦合等離子體質譜儀。

1.3.3 外觀質量評價 根據中國煙葉質量白皮書[27]中煙葉外觀質量的評價標準對烘干后煙葉樣品進行外觀質量評價，評價工作在國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心標準分級實驗室進行，由煙葉等級檢驗委員會委員進行評價。

1.3.4 化學成分含量測定 煙葉中總糖(TS)、還原糖(RS)、煙堿(Nic)、氯(Cl)、總氮含量參照YC/T 159～162—2002[28-31]測定，鉀(K)含量參照YC/T 217—2007[32]測定。所用儀器為AA3型連續(xù)流動分析儀(英國 SEAL公司)。

1.3.5 感官評吸 取各處理煙葉樣品，放入恒溫恒濕實驗室回潮至含水率18.0%～21.0%，去梗、切絲(寬度0.8 mm)。然后在GB/T 16447—2004[33]規(guī)定的條件下調節(jié)溫濕度，使煙絲含水率達到12.5%左右，制成卷煙。由國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心評吸委員會委員進行感官評吸，評吸依據九分制打分。

1.4 數據處理

采用 Excel 2010和DPS 7.05軟件進行數據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理煙株各生育時期煙葉的鎘含量

圖1所示，苗期，煙葉鎘含量表現為T1、T2處理低于CK，T3、T4處理稍高于CK，煙苗移栽后，還苗成活還需一段時間，各處理的作用效果還未完全體現在煙葉鎘含量上；伸根期，煙葉鎘含量以T2處理最低，其次為T4、T1處理，均明顯低于CK，而T3處理明顯高于CK，各處理與CK差異最大；旺長期、成熟初期、成熟采收期，除T3處理外，其他處理煙葉鎘含量均低于CK。

圖1 不同處理煙株各生育時期煙葉鎘含量的差異分析

2.2 不同處理烤后煙葉的鎘含量

由表1可見，與CK相比，T1、T2、T3、T4處理煙葉鎘含量分別降低32.79%、44.75%、-18.20%、32.46%。除T3處理高于CK外，其他處理烤后煙葉鎘含量均顯著低于CK，尤以T2處理最低。T1處理為TU菌劑單一處理，煙葉鎘含量為4.10 mg/kg，顯著低于對照(6.10 mg/kg)，分析原因可能是,TU菌分泌的細胞外多糖(前期預試驗發(fā)現)能與土壤中可交換態(tài)鎘絡合，降低隔的活性，間接減少了煙株對隔的吸收；T2處理煙葉鎘含量最低，只有3.37 mg/kg，腐殖酸作為生物有機物質，本身對重金屬有一定鈍化作用[34]；T4處理效果與T1處理相當，說明化學試劑磷酸鉀對TU菌鈍化土壤鎘的效果影響較小；鈍化效果最差的為T3處理，其煙葉中鎘含量高于CK，且顯著高于其他3個處理，這可能與尿素能提高土壤中交換態(tài)鎘含量[35]，進而促進作物對鎘的吸收有關。不同處理烤后煙葉鎘含量的變異系數以T2處理最高，但小于15%，說明所有測定數據不存在異常，均能準確反映煙葉實際鎘含量。

表1 不同處理烤后煙葉鎘含量差異分析

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，下同。

2.3 不同處理烤后煙葉的外觀質量

由表2可見，顏色得分以T4處理最高，其次為T1、T2處理，三者均高于CK且顯著高于T3處理；成熟度得分以T2處理最高，其次為T4處理，二者均高于CK，但差異不顯著，T1處理與CK相當且顯著高于T3處理；在葉片結構、身份、油分、色度得分上均以T2處理最高，T3處理最低，其中T3處理的色度得分顯著低于T2、T4處理，其余指標各處理間均無顯著差異；各處理烤后煙葉外觀質量總分表現為T2>T4>T1>CK>T3，其中T2、T4處理顯著高于T3處理。

表2 不同處理烤后煙葉的外觀質量 分

2.4 不同處理烤后煙葉的化學成分

由表3可見，煙堿含量以T3處理最高，且顯著高于T1處理，T1、T2處理均低于CK，但無顯著差異；總糖含量T2處理最高，其次為T1、T4處理，三者均顯著高于CK，T3處理則顯著低于CK和其他處理；還原糖含量表現為T1、T2、T4處理高于CK，但差異不顯著，T3處理顯著低于CK和其他處理；氯含量以T2處理顯著高于其他處理，T3處理最低，但與CK無顯著差異；鉀含量以T3處理顯著高于其他處理和CK，其他處理間無顯著差異；總氮含量各處理與CK均無顯著差異，但T3處理顯著高于T1、T2、T4處理。

表3 不同處理烤后煙葉的常規(guī)化學成分 %

2.5 不同處理烤后煙葉的評吸質量

由表4可以看出，T1、T2、T4處理在香氣質、雜氣、刺激性、余味得分和總分上均高于CK，尤其是香氣質得分顯著高于CK，而濃度和勁頭得分低于CK，但差異均不顯著；除濃度、勁頭、灰分外，T3處理評吸質量各指標得分均最低，香氣質、余味得分和總分均顯著低于CK和其他處理。各處理總體評吸質量表現為T2>T4>T1>CK>T3。

表4 不同處理烤后煙葉的評吸質量 分

3 結論與討論

本研究結果表明，與CK比較，T1、T2、T3、T4處理烤后煙葉的鎘含量分別降低32.79%、44.75%、-18.20%、32.46%，即各處理對土壤鎘的最終鈍化效果為T2>T1>T4>CK>T3；煙葉外觀質量為T2>T4>T1>CK>T3；化學成分以T2和T1處理最協(xié)調，T3處理最差；評吸質量得分表現為T2>T4>T1>CK>T3。

本研究選用的TU菌在有效降低煙葉鎘含量的同時，能提高烤后煙葉整體質量，適合用于鎘污染較輕的植煙土壤。單獨施用TU菌的鈍化效果在煙株伸根期表現較明顯，后期隨根系生長降低，生產上可考慮通過提前施用TU菌以及增加TU菌在土壤中施用深度等措施來改善最終的鈍化效果。腐殖酸對TU菌在降低煙葉鎘含量和提高煙葉質量方面均有加成作用，腐殖酸作為生物有機物質，不僅自身對重金屬有一定的鈍化作用，還能進一步改良土壤性狀，具有使肥料增效、刺激作物生長的功能[34]，生產上針對鎘污染偏重的植煙土壤，應在施用TU菌的基礎上配施腐殖酸。磷酸鉀雖對煙葉質量有一定改善，但對TU菌鈍化鎘的作用效果不明顯，結合生產成本考慮不推薦磷酸鉀與TU菌配施方法；尿素對TU菌鈍化鎘污染的效果有抑制作用，煙葉鎘含量顯著提高，煙葉質量明顯下降，這可能與尿素能促進作物對鎘的吸收，易造成煙葉貪青晚熟[35]有關。前人在實驗室內的研究表明，尿素對土壤有一定的降鎘作用[11]，但這并不能準確反映在大田試驗中，栽培上應以大田試驗效果為主。另外，本研究因前期破壞性取樣量較大，缺乏對煙葉產量的分析，下一步將補充完成相關試驗分析，綜合考察TU菌對煙葉的作用效果。

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Effects of Different Combined Application Modes of Cadmium-Resistant Bacteria on Cd content and Quality of Tobacco Leaves

HE Shengbao,LIU Nan,LUO Anna,FENG Xiaomin,WANG Yingyuan,ZHANG Wei*

(National Tobacco Quality Supervision and Test Center,Zhengzhou 450001,China)

In order to clear the effects of TU and its different combined application modes on Cd content and quality of tobacco leaves,to further reveal its remediation effect，we set up the treatments:control(CK),TU(T1),TU+humic acid(T2),TU+urea(T3),TU+potassium phosphate(T4) to conduct the field experiment.The differences of Cd content of tobacco,tobacco appearance quality,chemical composition and smoking quality among 5 kinds of Cd application mode were studied.The results showed that compared with CK,Cd contents of tobacco leaves in T1,T2,T3,T4 treatments were decreased by 32.79%,44.75%,-18.20%,32.46% respectively；the order of appearance quality of the tobacco leaf was T2 >T4>T1>CK>T3；chemical composition in T2 and T1 treatments were the most harmonious,T3 treatment was the worst；the order of smoking quality of the tobacco leaf was T2>T4>T1>CK>T3.So applying TU during production could reduce the Cd content and improve the quality of tobacco leaf.Humic acid could enhance the efficacy of TU.

cadmium-resistant bacteria; tobacco leaf; cadmium content; quality

2016-09-07

廣西區(qū)煙草公司科技項目(532014D16)

何聲寶(1984-)，男，安徽霍山人，工程師，碩士，主要從事煙葉外觀質量評價及常規(guī)化學檢驗工作。 E-mail:272234895@qq.com

*通訊作者：張 威(1974-)，男，河南鄭州人，高級工程師，碩士，主要從事煙草化學檢測工作。 E-mail:zhangw_jh@163.com

S182;S572

A

1004-3268(2017)03-0047-05