縮骨鯽MSTN基因的克隆與組織表達(dá)分析

楊 揚，許炎坤，舒 琥，李 強，藍(lán)召軍，劉 麗

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006；2.韶關(guān)市水產(chǎn)研究所，廣東韶關(guān) 512006；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣州 510642)

縮骨鯽MSTN基因的克隆與組織表達(dá)分析

楊 揚1，許炎坤1，舒 琥1，李 強1，藍(lán)召軍2，劉 麗3

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006；2.韶關(guān)市水產(chǎn)研究所，廣東韶關(guān) 512006；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣州 510642)

采用同源克隆、生物信息學(xué)方法及熒光定量PCR(Real-time PCR)對縮骨鯽(Carassiusauratussogu var.)肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)基因進(jìn)行克隆，分析和組織表達(dá)狀況研究。結(jié)果顯示：縮骨鯽基因組MSTN基因全長4 737 bp，含有兩個內(nèi)含子和三個外顯子；編碼區(qū)長度為1 128 bp，編碼375個氨基酸，包括信號肽(1aa～23aa)，TGF-β前肽保守區(qū)域(34aa～256aa)，TGF-β功能區(qū)(281aa～375aa)，保守的RXXR蛋白酶酶切位點以及C-端活性區(qū)域9個保守的半胱氨酸殘基，這與其他物種MSTN相似。此外，縮骨鯽與鯽魚(Carassiusauratus)的MSTN氨基酸序列同源性最高，達(dá)到96.1%。以β-actin為內(nèi)參基因，熒光定量PCR分析表明，MSTN在肌肉中表達(dá)量最高；腦、眼、心臟中次之；在肝胰臟、卵巢、腸和腎臟中微量表達(dá)。

縮骨鯽(Carassiusauratussogu var.)；克隆；肌肉生長抑制素基因；組織表達(dá)分布

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)基因，又被稱為生長/分化因子8(growth/differentiation factor，GDF-8)，是Mcpherron于1997年發(fā)現(xiàn)的一種屬于分泌蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的新的生長因子[1]。它的結(jié)構(gòu)具有TGF-β超家族的典型特征：N-端疏水的信號肽序列；氨基酸序列上有4個氨基酸(RXXR)組成的蛋白酶酶切位點；C-端包含9個保守半胱氨酸的活性區(qū)；通過C-端二硫鍵形成二聚體[2]。其主要通過TGF-β/smads通路[3]對生肌決定因子(Myogenic determining factor，MyoD)家族成員轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而控制肌細(xì)胞分裂周期中由G1期到S期的轉(zhuǎn)變，它的表達(dá)量與肌肉的質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)[4]。

MSTN基因敲除后能使骨骼肌質(zhì)量顯著增加，而且不會導(dǎo)致致命缺陷[5]。MSTN突變的小鼠體型顯著大于野生型，主要是由于肌細(xì)胞的過度生長和增殖引起的[6]，MSTN的缺失以及敲除可以引起豬或者牛的雙肌性狀[7,8]。迄今為止，在魚類中，MSTN基因研究已經(jīng)相對普遍，在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[9]、羅非魚(Oreochromismossambicus)[10]、舌齒鱸(DicentrarchuslabraxL.)[11]、鱸(Moronechrysops)[10]、斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)[12]、真鯛(Pagrosomusmajor)[13]、鯉(Cyprinuscarpio)[14]、鯽[15]等中已經(jīng)克隆出MSTN基因。

MSTN的表達(dá)在不同的魚類中存在差異，但是普遍在肌肉中有著較高的表達(dá)，而在其他的組織中表達(dá)譜有所不同。在金頭鯛(Sparusaurata)中，MSTN在腸、腎臟、腦、眼和肌肉中都有較高的表達(dá)，在其他組織中則沒有檢測到[16]；在斑馬魚中，所檢測的10種組織骨骼肌、肝、心臟、胃、鰓、卵巢、精巢、腎、眼和腦中均有表達(dá)[17]；在鯉魚中，只能在肌肉和腦中檢測到MSTN mRNA[14];在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中，腦、心臟、肝、鰓、腸、精巢、卵巢、腎臟、快肌和慢肌中均能檢測到MSTN的存在，其中在腸、精巢、卵巢和肌肉中表達(dá)量較高[18]。

縮骨鯽(Carassiusauratussogu var.)是分布在湖南省綏寧縣的一個特殊的鯽地方種群。其軀體較高，體長約為體高的1.6倍。距背鰭前基部三分之一處的后部脊椎骨呈萎縮狀，尾柄長遠(yuǎn)小于尾柄高。背鰭后基部的兩側(cè)肌肉發(fā)達(dá)，微隆起。這種體型并非病態(tài)，而是純粹的遺傳所致[19]?？s骨鯽的研究主要集中在生物學(xué)、雌核發(fā)育[20]等方面，分子水平的研究甚少，尤其對生長相關(guān)基因研究資料十分匱乏，鑒于MSTN對肌肉生長的調(diào)控功能及其在魚類育種中具有潛在的應(yīng)用價值，本研究對縮骨鯽MSTN基因及其在不同組織的表達(dá)進(jìn)行了分析，可以豐富縮骨鯽的基因信息，并為縮骨鯽肌肉生長和發(fā)育的分子機制研究以及遺傳育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗用縮骨鯽4尾，體質(zhì)量為(100±10) g，均取自廣東韶關(guān)水產(chǎn)研究所。

1.2 實驗試劑

Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生物工程(上海)股份有限公司； Taq酶和RNA keeper購自Vazyme Biotech公司。PMD19-T、大腸桿菌DH5α感受態(tài)、RNAiso、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)、ROX plus 均購自Takara公司。

1.3 引物

本次實驗使用的引物見表1，以鯉魚的MSTN基因組基因為模板共設(shè)計7對引物對縮骨鯽MSTN基因組基因序列進(jìn)行擴增。

表1 用于縮骨鯽MSTN基因克隆和表達(dá)分析的9對引物

1.4 擴增與測序

剪取25 mg縮骨鯽肌肉，使用生工DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。使用上述的引物以縮骨鯽基因組DNA為模板進(jìn)行擴增，然后將產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.5 序列拼接及MSTN基因的生物信息學(xué)分析

將測序獲得的7條MSTN基因片段利用DNAstar軟件中的Seqman對序列進(jìn)行拼接、比對，獲得縮骨鯽MSTN基因組基因全序列。通過NCBI的Spidey對縮骨鯽MSTN基因組基因進(jìn)行內(nèi)含子與外顯子的分析并進(jìn)行拼接，得到CDs區(qū)域，利用ExPASy - ProtParam tool在線分析工具分析縮骨鯽MSTN基因編碼蛋白的理化性質(zhì)。使用在線的SignalP 4.1 service對縮骨鯽MSTN蛋白的信號序列進(jìn)行預(yù)測。使用Mega 5.0軟件對縮骨鯽、鯽、鯉、斑馬魚(Daniorerio)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鳙(Aristichthysnobilis)、南亞黑鯪 (Labeorohita)、喀拉鲃(Catlacatla)、大西洋鯡(Clupeaharengus)、大西洋鮭(Salmosalar)、溪紅點鮭(Salvelinusfontinalis)、網(wǎng)紋鳉(Poeciliareticulate)、青鳉(Oryziaslatipes)、鳡(Elopichthysbambusa)、藍(lán)點馬鮫(Scomberomorusniphonius)、白斑狗魚(Esoxlucius)、美洲狼鱸(MoroneAmericana)、大黃魚(Larimichthyscrocea)、羅非魚、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、鱔(Monopterusalbus)、美國短吻鱷(Alligatormississippiensis)、西部錦龜(Chrysemyspictabellii)、海龜(Cheloniamydas)、原雞(Gallusgallus)、綠頭鴨(Anasplatyrhynchos)、灰雁(Anseranser)、豬(Susscrofa)、小鼠(Musmusculus)和人(Homosapiens)的MSTN氨基酸序列進(jìn)行同源性分析并使用 Neighbor-Joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 縮骨鯽MSTN 在不同組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分布

取3尾縮骨鯽的9個組織：腦、眼、心臟、卵巢、肝胰臟、腸、腎臟、鰓和肌肉迅速放入RNA keeper中，總RNA提取方法如下，將100 mg 組織加入到 1 mL 的RNAiso中并剪碎，置于冰上裂解;加0.2 mL氯仿靜置片刻離心;取500 μL上清液，用0.5 mL異丙醇沉降RNA，再用1 mL 75% 乙醇洗滌沉淀;用DEPC水溶 解RNA；使用1%瓊脂糖電泳檢測RNA質(zhì)量。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用ABI7000熒光定量PCR儀，按照 SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) 試劑盒要求進(jìn)行 Real-time PCR對9種組織的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測，每一個樣品設(shè)置三個重復(fù)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線檢測，并送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，以確定擴增基因為目的基因。本實驗使用β-actin作為內(nèi)參基因，引物β-actinF 和β-actinR(表1)，擴增 157 bp的目的片段，MSTN 特異性引物MSTNQPCRF和MSTNQPCRR，擴增133 bp的目的片段， 以上引物均為跨內(nèi)含子引物，以保證引物對cDNA的特異性。使用2-△△ct法對不同組織的相對表達(dá)量進(jìn)行計算并作圖。使用SPSS19.0的ANOVA進(jìn)行不同組織內(nèi)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 縮骨鯽的MSTN基因組基因的擴增與拼接

以縮骨鯽的基因組DNA為模板，Primer1～7為引物，分別成功擴增出特異的DNA片段(圖1)，得到完整的縮骨鯽MSTN基因組基因序列，其長度為4 737 bp。該基因含有兩個內(nèi)含子和三個外顯子，并且全部遵循GU-AG剪切規(guī)則，蛋白質(zhì)編碼區(qū)長度為1 128 bp，可以編碼375個氨基酸，存在RXXR保守結(jié)構(gòu)和含有9個保守的半胱氨酸殘基的活性區(qū)，具體序列分析如圖2所示。該序列的GenBank登錄號為KX150705。

圖1 縮骨鯽MSTN基因組序列擴增結(jié)果Fig.1 PCR result of MSTN of C.auratus sogu var. 1～7為表1中引物PCR擴增產(chǎn)物，M為DL2000 DNA Marker。

2.2 縮骨鯽MSTN基因序列及其氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 縮骨鯽MSTN基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

將縮骨鯽MSTN編碼的氨基酸序列提交至ExPASy-ProtParam tool在線分析工具，對縮骨鯽MSTN蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，該蛋白預(yù)計相對分子質(zhì)量為42 069.1，等電點為6.17。其氨基酸組成中以亮氨酸(Leu)的含量最高(8.0%)，含量最低的是色氨酸(Trp)，為1.6%，其他氨基酸含量在2.4%～7.2%之間。此蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為50.85，是一種不穩(wěn)定的蛋白。此外，蛋白質(zhì)氨基酸殘基親疏水性總平均數(shù)(GRAVY)為-0.351，說明此蛋白為親水蛋白。

圖2 縮骨鯽MSTN核苷酸序列與推測的氨基酸序列Fig.2 MSTN nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of C.auratus sogu var. 加框表示保守的酶切位點，下劃線表示啟動子原件，加粗表示加尾信號，陰影部分表示加尾信號和polyA之間的保守區(qū)域， 雙直線表示保守的半胱氨酸殘基，星號表示終止密碼子。

2.2.2 縮骨鯽MSTN基因編碼蛋白的預(yù)測分析

使用SignalP 4.1 Server在線信號肽預(yù)測軟件，對縮骨鯽的MSTN基因編碼的蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，該基因1aa～23aa為信號肽區(qū)域，其作用是介導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌和轉(zhuǎn)運，并對其正確折疊有一定的作用。通過NCBI功能軟件Conserved domains分析縮骨鯽MSTN氨基酸序列保守區(qū)域。 結(jié)果顯示，34aa～256aa氨基酸殘基是TGF-β前肽(propeptide)保守區(qū)域，281aa～375aa氨基酸殘基是TGF-β功能區(qū)。

2.2.3 縮骨鯽MSTN的同源性分析

對比29個GenBank中已經(jīng)公布的一些物種的MSTN氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，縮骨鯽MSTN與鯽魚和鯉魚的同源度分別為96.1%和95.8%，在分子系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，親緣關(guān)系最近；與鯉科魚類的同源度為94.4%～96.1%，相對保守；與其他硬骨魚類的同源度為74.3%～85.6%；與陸生動物的同源度僅為58.2%～61.5%。使用neighbor-joining方法對縮骨鯽以及進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，Bootstrap檢驗重復(fù)1 000次，構(gòu)建了縮骨鯽MSTN氨基酸序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，MSTN分子系統(tǒng)發(fā)育樹與形態(tài)學(xué)的系統(tǒng)發(fā)育樹吻合。

圖3 縮骨鯽與其他物種的MSTN氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of MSTN of C.auratus sogu var.and other species

2.3 縮骨鯽 MSTN 在不同組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分布

以縮骨鯽的腦、眼、心臟、卵巢、肝胰臟、腸、腎臟、鰓和肌肉9個組織的cDNA為模板，通過Real-time PCR研究MSTN在不同組織內(nèi)的表達(dá)量。Real-time PCR的擴增產(chǎn)物溶解曲線為單峰，測序結(jié)果表明擴增產(chǎn)物為目的片段。結(jié)果表明，在縮骨鯽肌肉中MSTN含量最高，腦、眼、心臟中次之，肝胰臟、卵巢、腸、腎臟和鰓中微量表達(dá)，其中肝胰臟表達(dá)略高(圖4)。

圖4 縮骨鯽MSTN mRNA在不同組織內(nèi)的表達(dá)Fig.4 Relative expression of MSTN mRNA in tissues ofC.auratus sogu var. 圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

縮骨鯽作為華南地區(qū)特有物種，有著良好的經(jīng)濟價值和重要的研究價值?？s骨鯽的背鰭后基部的兩側(cè)肌肉發(fā)達(dá)，約距背鰭前基三分之一處的后部脊椎骨開始呈萎縮狀，這并非病態(tài)，而是自然選擇的結(jié)果，本研究克隆以及初步分析了與肌肉生長分化密切相關(guān)的MSTN基因，并對推測的縮骨鯽MSTN氨基酸序列與其他物種進(jìn)行了對比。結(jié)果顯示，縮骨鯽與鯽魚的同源性最高，達(dá)到了96.1%，這與劉良國等[21]使用RAPD方法分析鯽品系所得出的結(jié)果相符，證實縮骨鯽是由普通鯽進(jìn)化而來，至于縮骨鯽背部肌肉較為發(fā)達(dá)是否是因為縮骨鯽與鯽魚之間MSTN的差異導(dǎo)致，還需要使用基因敲除技術(shù)或者大幅降低MSTN活性的單核苷酸多態(tài)(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)做進(jìn)一步的研究?？s骨鯽MSTN基因的克隆，為縮骨鯽MSTN基因SNPs的篩選和縮骨鯽MSTN基因SNPs與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[22]奠定了基礎(chǔ)。 至于是否存在大幅降低縮骨鯽MSTN活性的SNPs仍需要做進(jìn)一步的研究。

本實驗顯示，縮骨鯽與爬行類、鳥類、哺乳類的MSTN基因有著較高的同源性，均編碼375或376個氨基酸，并且MSTN基因組基因都由三個外顯子兩個內(nèi)含子組成。比對多種魚類的MSTN氨基酸序列的結(jié)果表明，該蛋白序列在魚類中具有高度的保守性，尤其是在C末端的功能活性區(qū)域，其保守性幾乎達(dá)到99%，而且魚類的MSTN蛋白上均有兩個保守區(qū)域：TGF-β前肽(propeptide)保守區(qū)域和TGF-β功能區(qū)。通過多物種的MSTN氨基酸序列構(gòu)建的分子進(jìn)化樹與形態(tài)學(xué)的進(jìn)化樹基本吻合。

使用實時熒光定量 PCR 分析縮骨鯽MSTN在9種組織內(nèi)表達(dá)，結(jié)果顯示MSTN在肌肉中的表達(dá)量顯著高于其他組織，與在鯉[14]、大西洋鮭[23]、異育銀鯽(Allogyogeneticscruciancarp)[24]和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[25]等魚中研究結(jié)果相符?？s骨鯽MSTN在腦，眼和心臟中有著較為顯著的表達(dá)，這與在大西洋鮭，草魚(Ctenopharyngodonidellus)[26]中的研究相符，值得注意的是，在異育銀鯽中的研究顯示在腦和心臟也有明顯的表達(dá)，但是腦和肌肉的表達(dá)量沒有顯著差異，這可能是因為實驗用魚的年齡不同[27]，也可能是因為物種差異的結(jié)果。MSTN的廣泛表達(dá)，在異育銀鯽、草魚、斑馬魚[17]以及金頭鯛[27]等魚的研究中均有體現(xiàn)。不同于哺乳動物中MSTN的表達(dá)只局限于肌肉和少數(shù)組織中[6]，在魚類中MSTN的表達(dá)非常廣泛，表達(dá)模式也十分多樣。由于MSTN對肌肉生長的調(diào)控作用[5]，已經(jīng)被廣泛研究并應(yīng)用于畜牧業(yè)和漁業(yè)以滿足消費者的需求，其研究對于經(jīng)濟魚類育種有著重要的意義。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Cloning and tissues expression analysis of MSTN gene inCarassiusauratussogu var.

YANG Yang1,XU Yan-kun1,SHU Hu1,LI Qiang1,LAN Zhao-jun2,LIU Li3

(1.SchoolofLifeScience,GuangzhouUniversity,Guangzhou510006,China;2.ShaoguanFisheriesResearchInstitute,Shaoguan,Guangzhou,512006,China;3.SchoolofMarineScience,AgriculturalUniversityofSouthChina,Guangzhou510642,Guangdong,China)

The myostatin (MSTN) gene inCarassiusauratussogu var.was cloned and analyzed through homology-based cloning，bioinformatics technology and Real-time PCR.The result revealed that the length of MSTN ofC.auratussogu var.is 4737bp.It includes 3 exons and 2 introns.The length of coding sequence (CDS) is 1128bp,the gene code 375 amino acids which contain a signal peptide (1aa～23aa),a conserved propeptide domain (34aa～256aa),a functional domain (281aa～375aa),a RXXR proteolysis site and nine conserved cysteine residues of C-terminal functional domain;As other species,the protein of MSTN have a TGF-β superfamily domain inC.auratussogu var.;Compared with other species,the homology of MSTN amino acid sequences betweenC.auratussogu var.andC.auratusis closer.Using Real-Time PCR detected MSTN mRNA expression of 9 tissues,the result suggested that the MSTN gene was highly expressed in muscle,second highly expressed in brain,eyes,heart and weakly expressed in ovary,hepatopancreas and kidneys.

Carassiusauratussogu var;clone;myostatin (MSTN);tissues expression

2016-08-13；

2016-10-11資助項目：國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))重大專項(201303048)；廣東省科技計劃項目(2012A020602063,2014A020208145)。

楊 揚(1992- )，男，碩士研究生，專業(yè)方向為魚類生理與分子生物學(xué)。E-mail:214453598@qq.com 通訊作者：舒 琥。E-mail:shuhu001@126.com

S917.4

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1000-6907-(2017)01-0023-07