TGEV和PEDV的多重PCR方法在豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)中的應(yīng)用研究

黃紅

（黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

摘要：目的：通過應(yīng)用同時(shí)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法，并對(duì)其進(jìn)行特異性與敏感性試驗(yàn)。方法：對(duì)本地區(qū)150份臨床疑似病毒性腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)了仔豬腹瀉的糞便或小腸組織共150份病料。在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，此方法能檢測(cè)約50 TCID50的混合病毒，能夠擴(kuò)增出3條長度為750 bp（PEDV）、544 bp（TGEV）、275 bp（PARV）特異性片段，而其它病毒無特異性條帶。結(jié)果：PEDV、TGEV陽性率分別為54.67%（82/150）、8.0%（12/150）。PEDV 與TGEV 混合感染率為5.33%。結(jié)論：同時(shí)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法的應(yīng)用對(duì)臨床上進(jìn)行這兩種疾病混合感染的檢測(cè)具有重要意義。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；TGEV；PEDV；PCR檢測(cè)

豬是唯一自然感染的動(dòng)物，任何年齡豬只皆會(huì)感染發(fā)病，此病是通過糞口途徑傳播，好發(fā)于濕冷的天氣，尤其是冬春、秋冬季節(jié)交換之際。感染豬臨床上以嘔吐、水樣下痢及脫水為主征，造成出生仔豬高死亡率[1]，死亡率可高達(dá)100%。豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）中的冠狀病毒屬（Corona virus），為具封套的正股單鏈RNA 病毒[2]。將其感染PD5 細(xì)胞株，以acridine orange 或propidium iodide 染劑將細(xì)胞核染色后，于熒光顯微鏡下觀察可見染色質(zhì)密度增加并有凋亡小體的產(chǎn)生[3]。經(jīng)電泳分析可見其DNA 階梯狀的現(xiàn)象，另以掃描式電子顯微鏡也可見到細(xì)胞表面泡狀化及凋亡小體的產(chǎn)生[4]。豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和目前引起人類非典型肺炎的嚴(yán)重急性呼吸道癥候群（Severe acute respiratory syndrome，SARS）同屬冠狀病毒科（Coronaviridae）中的冠狀病毒屬（Coronavirus）。細(xì)胞凋亡對(duì)多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育、正常細(xì)胞更新、各組織保持正常結(jié)構(gòu)與功能有著積極而重要的意義。[5]而研究細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)與調(diào)控及其信息傳遞機(jī)制，對(duì)基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及某些疾病的診斷和治療都將產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，故有關(guān)細(xì)胞凋亡測(cè)試方法的研究也成為當(dāng)今國內(nèi)外研究的新熱點(diǎn)，這也為細(xì)胞凋亡分析測(cè)試方法的研究提出了一個(gè)更加嚴(yán)峻的課題，這方面的研究有待繼續(xù)深入[6]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)本地區(qū)150份臨床疑似病毒性腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)了仔豬腹瀉的糞便或小腸組織共150份病料，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1病毒與病料

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）CV777 毒株、豬傳染性胃腸炎（TGEV）JSXB2010 毒株，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2檢測(cè)方法

對(duì)本地區(qū)150份臨床疑似病毒性腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)了仔豬腹瀉的糞便或小腸組織共150份病料。在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，此方法能檢測(cè)約50 TCID50的混合病毒，能夠擴(kuò)增出3條長度為750 bp（PEDV）、544 bp（TGEV）、275 bp（PARV）特異性片段，而其它病毒無特異性條帶。

2結(jié)果

2.1多重RT-PCR 的特異性

PEDV、TGEV陽性率分別為54.67%（82/150）、8.0%（12/150）。PEDV 與TGEV 混合感染率為5.33（8/150）。

2.2多重RT-PCR 的敏感性

將兩種病毒混合后提取的RNA 全部反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 按10倍比稀釋，在確定的退火溫度以及引物濃度下，其它條件不變，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。假定所提取的RNA 無降解，全部反轉(zhuǎn)錄，此多重RT-PCR 可檢測(cè)到約50 TCID50的混合病毒量。

討論：通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是在形態(tài)學(xué)上或生化學(xué)檢測(cè)方面，都符合細(xì)胞凋亡的特征，證實(shí)豬傳染性胃腸炎病毒于PD5 豬腎細(xì)胞株可誘發(fā)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，且初步分析病毒感染后細(xì)胞的caspase 的活性，可見caspase-2，-3，-4，-6，-8，-9，-10活性皆有增加，顯示本病毒可能通過細(xì)胞表面死亡受體的外在路徑或通過粒線體調(diào)控的內(nèi)在路徑引發(fā)細(xì)胞凋亡[7]。目前已有研究證明多種病毒、細(xì)菌都可誘發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)轉(zhuǎn)，其中又以病毒最被廣為研究，且亦多種病毒基因被證明與細(xì)胞凋亡有直接的關(guān)系，未來可通過更深入的研究以了解TGEV 誘發(fā)細(xì)胞凋亡的信息傳遞路徑及其分子機(jī)制，以供其它冠狀病毒細(xì)胞凋亡分子模型的參考[8]。方法靈敏度與特異性高，尤其是對(duì)早期凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，但仍需配合細(xì)胞形態(tài)學(xué)的特征而加以判斷。另通過掃描式電子顯微鏡的觀察，也可明顯見到細(xì)胞表面呈現(xiàn)泡狀化的細(xì)胞，及由凋亡細(xì)胞脫落出凋亡小體的現(xiàn)象。本組資料顯示，同時(shí)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法的應(yīng)用對(duì)臨床上進(jìn)行這兩種疾病混合感染的檢測(cè)具有重要意義。

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