益腎通絡(luò)方濃縮合劑的急性毒性實(shí)驗(yàn)※

馬中華張宸銘孫自學(xué)祝莉?qū)O赫宇

益腎通絡(luò)方濃縮合劑的急性毒性實(shí)驗(yàn)※

馬中華1張宸銘1孫自學(xué)2*祝莉1孫赫宇1

（1河南中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生2014級(jí)，鄭州45008；2河南省中醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與男科診療中心，鄭州45002)

目的通過(guò)觀察小鼠灌胃給藥后的中毒反應(yīng)，考察益腎通絡(luò)方濃縮合劑的安全性。方法將益腎通絡(luò)方濃縮合劑以最大濃度(2.5 g/ml)和最大體積（0.4 ml/10 g）24 h內(nèi)3次給藥，連續(xù)觀察14d內(nèi)小鼠的活動(dòng)情況和死亡數(shù)量，小鼠死亡0只，未測(cè)出LD50，測(cè)其最大耐受量。結(jié)果給藥后14 d內(nèi)小鼠生存狀態(tài)良好，活動(dòng)和飲食情況均無(wú)變化，部分小鼠有輕微腹瀉，無(wú)死亡，空白組與給藥組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯差異，血常規(guī)指標(biāo)及生化指標(biāo)也無(wú)明顯差異，對(duì)兩組小鼠的主要臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，兩組小鼠的主要臟器經(jīng)肉眼及鏡檢均無(wú)病理性差異。結(jié)論經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得小鼠灌胃給藥的最大耐受量是300 g/kg，相當(dāng)于臨床成人日劑量的181倍。益腎通絡(luò)方濃縮合劑有較高的安全性。

益腎通絡(luò)方；急性毒性實(shí)驗(yàn)；最大耐受量

男性不育癥不僅影響家庭和睦，甚至影響社會(huì)的穩(wěn)定，引起了全社會(huì)人民的關(guān)注，研究表明，目前全世界受到不育困擾的夫婦約占已婚夫婦的15%[1]。引起男性不育癥的病因病機(jī)復(fù)雜，還有相當(dāng)一部分患者原因不明。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)此類(lèi)疾病尚無(wú)理想的治療藥物，為挖掘中醫(yī)藥在此領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)，諸多中醫(yī)界的同仁進(jìn)行了不懈的探索。益腎通絡(luò)方由菟絲子、熟地黃、淫羊藿、丹參、水蛭、川牛膝、黃芪等藥物組成，為導(dǎo)師孫自學(xué)教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)處方，以補(bǔ)腎填精、活血化瘀為法組方，以之為基礎(chǔ)化裁，臨床應(yīng)用治療精索靜脈曲張性不育癥、特發(fā)性弱精子不育癥，療效顯著。為了解本方濃縮合劑的臨床安全性，我們進(jìn)行了益腎通絡(luò)方濃縮合劑的急性毒性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 藥品菟絲子、熟地黃、淫羊藿、丹參、水蛭、川牛膝、黃芪，其飲片由亳州市先鋒中藥飲片有限公司提供，批號(hào)：160601，經(jīng)河南省中醫(yī)院中藥制劑室煎制成濃縮合劑，每毫升約含生藥2.5 g。

1.2 動(dòng)物SPF級(jí)健康昆明小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半。飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，IVC系統(tǒng)，籠盒溫度22～26℃換氣20次/h，，濕度40%～60%，光照12h明暗交替，自由飲食，混合顆粒飼料（SPF級(jí)），江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)，許可證號(hào)：蘇飼證（2014）01008，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB/T14924.3-2010。小鼠實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2 方法[2]

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)取小鼠10只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，按空腹體重計(jì)算給藥量，單次灌胃益腎通絡(luò)方濃縮合劑(2.5 g/ml)0.4 ml/10 g，劑量為100 g生藥/ kg，給藥后全部皮毛光亮順滑，行為活動(dòng)、神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)正常，小鼠無(wú)死亡。因此單次給藥無(wú)法測(cè)定其LD50，遂改為測(cè)定連續(xù)多次給藥的LD50。經(jīng)序貫法預(yù)實(shí)驗(yàn)，益腎通絡(luò)方濃縮合劑24h內(nèi)連續(xù)三次（7:00，12:00，17:00）灌胃給藥小鼠死亡0只。給藥后連續(xù)觀察3 d。給藥后3 d內(nèi)部分小鼠有輕微腹瀉，未見(jiàn)死亡小鼠。可供灌胃最大藥量沒(méi)有發(fā)生急性毒性反應(yīng)，故不能測(cè)出LD50。

2.2 正式實(shí)驗(yàn)(最大給藥量試驗(yàn))小鼠40只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組，每組20只，雌雄各半。給藥組每5 h給藥1次，連續(xù)3次，空白對(duì)照組灌胃等量蒸餾水，方法同給藥組。給藥2 h后自由飲食，連續(xù)觀察14 d。

2.2.1 觀察與指標(biāo)檢測(cè)每日觀察記錄實(shí)驗(yàn)室情況，觀察記錄動(dòng)物外貌特征、行為活動(dòng)、糞便情況等，如有中毒反應(yīng)的動(dòng)物應(yīng)取出單獨(dú)飼養(yǎng)，重點(diǎn)觀察。小鼠末次給藥后觀察14 d后摘取眼球取血行血液學(xué)檢測(cè)及血清生化指標(biāo)檢測(cè)，血液學(xué)檢測(cè)紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）及分類(lèi)、血紅蛋白（Hb）、血小板(Rt)、凝血酶原時(shí)間(PT)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RC)，生化指標(biāo)檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)。解剖后尸檢，心肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等主要臟器有無(wú)異常變化，取心、肝、脾、肺、腎等臟器用10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，做病理組織切片，光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2.2.2 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件協(xié)助處理。

3 結(jié)果

給藥后14 d內(nèi)小鼠生存良好，無(wú)異?；顒?dòng)，外觀、精神狀況、飲食情況均無(wú)變化，部分小鼠有輕微腹瀉，未見(jiàn)死亡小鼠。小鼠灌胃最大給藥量為300 g/（kg·d），相當(dāng)于臨床70 Kg的成人用藥劑量的181倍，詳見(jiàn)表1、表2。

表1 小鼠最大給藥量結(jié)果

表2 劑量倍數(shù)轉(zhuǎn)換表

給藥組與空白對(duì)比，給藥后第14 d體重?zé)o明顯差異(P>0．05)，血常規(guī)指標(biāo)及生化指標(biāo)也無(wú)明顯差異，對(duì)小鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進(jìn)行力病理組織學(xué)檢查，結(jié)果表明兩組小鼠的心、肝、脾、肺、腎等經(jīng)光鏡檢驗(yàn)均無(wú)病理性改變，表明益腎通絡(luò)方無(wú)明顯的毒性作用。

4 討論

益腎通絡(luò)方主要由菟絲子、淫羊藿、熟地黃、丹參、川牛膝、黃芪、水蛭等十幾味中藥組成。方中菟絲子甘平入腎，可補(bǔ)腎填精，鼓動(dòng)腎氣，提高生精功能；淫羊藿甘溫入腎，補(bǔ)腎助陽(yáng)；二者共為君藥；熟地黃甘、微溫，質(zhì)地柔潤(rùn)，溫而不燥，入肝腎二經(jīng)，有滋血補(bǔ)陰，生精益髓之效；丹參苦微寒，入血分而善活血通經(jīng)，二者共為臣藥；水蛭咸苦平，善于破血逐瘀通經(jīng)，黃芪甘溫，補(bǔ)益元?dú)?，升?yáng)舉陷，氣旺則血行，瘀去絡(luò)通，既可助丹參、水蛭通絡(luò)活血又可防其破新血而不傷正，是為佐藥；川牛膝性味苦平，活血通經(jīng)，消腫止痛，可引藥下行，直達(dá)病所，為佐使之劑。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎填精，活血化瘀通經(jīng)之效。

菟絲子，味微辛，性平，入肝脾腎經(jīng)，稟氣中和，溫而不燥，補(bǔ)陰而不膩滯。其入腎可補(bǔ)腎填精，入肝可養(yǎng)肝明目，入脾則益脾止瀉，為平補(bǔ)肝腎之良藥。具有補(bǔ)腎固精，鼓動(dòng)腎氣，提高生精功能之效。主治肝腎虧虛所致腰痛、遺精、陽(yáng)痿、不育等癥。淫羊藿，味甘、辛，性溫，歸肝、腎經(jīng)，可壯腎陽(yáng)，堅(jiān)筋骨，補(bǔ)腰膝。凡腎陽(yáng)虛所致痹痛，精冷不育，腰膝酸軟，尿頻失禁皆可用之。熟地黃，味甘，微溫，歸肝、腎經(jīng)，質(zhì)地柔潤(rùn)，溫而不燥，故有滋陰養(yǎng)血，益髓生精之效，可治療血虛諸證。丹參，味苦，微寒，歸心包、肝經(jīng)，涼血活血，入血分而善祛瘀止痛、活血行血。主治月經(jīng)前后不定期，閉經(jīng)痛經(jīng)等。水蛭，咸、苦、平，歸肝、腎經(jīng)，功善破血逐瘀通經(jīng)，用生水蛭治療女性血瘀型不孕癥，張錫純建議研末沖服為佳。主要用于血滯經(jīng)閉，跌打損傷等。黃芪，甘溫，歸脾、肺經(jīng)。能補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利水消腫，治療中氣下陷引起的各種癥狀，同時(shí)還能托毒生肌，固表止汗。川牛膝，苦，平，歸肝腎，活血通經(jīng)，消腫止痛，本藥性善下行，直達(dá)病所，是男科治療常用的引經(jīng)藥。

現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為：菟絲子可以保護(hù)機(jī)體的免疫器官而提高機(jī)體的免疫功能，并且有抗衰老的作用[3]。有實(shí)驗(yàn)研究顯示其有直接促進(jìn)精子活力和精子膜功能的作用[4]。淫羊藿可以促進(jìn)核酸蛋白質(zhì)合成，并具有雄性激素樣作用；能促進(jìn)性腺的發(fā)育，提高精子密度及精子活力[5]，淫羊藿水煎液灌胃可升高血漿睪丸酮的含量，增加睪丸和提肛肌的重量，并能有效地修復(fù)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的損傷，維持睪丸曲細(xì)精管上皮正常生精周期，對(duì)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)可明顯提高性功能，增加附屬性器官重量，能增加性腺軸、腎上腺軸及胸腺軸功能。熟地黃對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫功能均有明顯的增強(qiáng)作用，并且可以抗脂質(zhì)過(guò)氧化[6]。另外，有研究學(xué)者認(rèn)為腎藏精主生殖與礦物元素鋅有關(guān)，鋅是人體不可或缺的微量礦物元素之一，是維持性機(jī)能和性器官正常發(fā)育必不可少的物質(zhì)[7]。有藥理學(xué)研究還表明淫羊藿、菟絲子、熟地黃等補(bǔ)腎藥物含有豐富的微量元素Zn、維生素E，丹參素具有清除自由基產(chǎn)生，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)作用，丹參同時(shí)能抑制血小板聚集及血小板的激活，擴(kuò)張微血管，改善微循環(huán)，促進(jìn)血管新生[8]。水蛭別名螞蟥，主要成分有水蛭素、組織胺、肝素，其可以阻止凝血酶對(duì)纖維蛋白的聚合，抑制血小板凝集，溶解血栓，降低血液黏稠度，抗細(xì)胞凋亡，抗炎，抗腫瘤，抗纖維化，改善腎功能等[9]。

成人(70 kg體重)益腎通絡(luò)方水煎合劑臨床生藥日用量為116 g，小鼠灌胃最大給藥量為300 g（kg·d-1），相當(dāng)于臨床成人用藥劑量的181倍，一般認(rèn)為，按體重計(jì)算，最大給藥量相當(dāng)于臨床成人日用劑量的100倍以上則較為安全[10]，本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物不出現(xiàn)死亡，測(cè)不出LD50，表明益腎通絡(luò)方水煎合劑口服用藥短期內(nèi)無(wú)毒、安全可靠。

[1]陳在賢.實(shí)用男科學(xué)[M].2版.北京:人民軍醫(yī)出版社，2013:84.

[2]楊洋，王敏.地麥止咳口服液小鼠連續(xù)多次給藥的急性毒性試驗(yàn)[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2014，34(2)：74-75.

[3]陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].北京:中醫(yī)古籍出版社，1995（10）: 331.

[4]彭守敬，陸仁康，俞麗華，等.菟絲子、仙茅、巴戟天對(duì)人精子體外運(yùn)動(dòng)和膜功能影響的研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，l7(3):145.

[5]梁?jiǎn)?，王云翔，杜晨，?手術(shù)配合中藥聯(lián)合治療精索靜脈曲張引起的男性不育[J].中國(guó)男科學(xué)雜志，2000，14（3）:33-34.

[6]侯家玉.中藥藥理學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003，3:145-235.

[7]趙土亮.補(bǔ)腎活血法治療男子不育癥探討[J].四川中醫(yī)，2002，20(2):18.

[8]閻樂(lè)法，姜梅芳，邵瑞云，等.精靈口服液治療精索靜脈曲張不育手術(shù)后的臨床觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，24(3):222.

[9]郭曉慶，孫佳明，張輝.水蛭的化學(xué)成分與藥理作用[J].吉林中醫(yī)藥，2015，35(1):47-50.

[10]張國(guó)恩，楊德華，錢(qián)玉中，等.痹康飲合劑急性毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥，2005，27(3)：39-40．

Acute Toxicology Experimental Study on Yishen Tongluo Concentrated Decoction

MA Zhonghua1,ZHANG Chenming1,SUN Zixue2,ZHU Li1,SUN Haoyu1
(1.Grade 2014 Graduate,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 45008,China; 2.Diagnosis and Treatment Center of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine and Andrology,Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 45002,China)

Objective We study on the security of Yishen Tongluo concentrated decoction though observing mice's toxic reaction during 14d after given Yishen Tongluo decoction intragastically.Methods The mice were given high dosage(2.5g/ml)and the most volume (0.4ml/10g),and were affused three times during 24h.Then mice's action and the number of deaths were recorded.There was no death. LD 50 could not be determined.We had no other choice to measure the maximal tolerance dose.Results Mice's in good conditions during 14d after administrating,the appetite and activity had no change,and there was no death.The weight,blood count and blood biochemical parameter had no distinct difference.The macroscopic observation and microscopic observation of two sets mice main viscera had no histopathological difference.Conclusion This experiment showed that maximal tolerance dose administration to mice was 300g/kg/d,about 181 times equal to the adult clinical daily dose.Yishen Tongluo concentrated decoction has higher security.

Yishen Tongluo decoction;acute toxicology experiment;maximal tolerance dose

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.07.062

1672-2779（2017）-07-0135-03

：李海燕本文校對(duì)：郝高利

2016-12-27）

國(guó)家自然科學(xué)基金【No：81573981】；國(guó)家自然科學(xué)基金【No：81603632】

*通訊作者：sunhhzx@163.com