高效液相法同時(shí)測(cè)定銀杏葉中11種成分的含量

呂金麗+楊彪+李孟璇+孟兆青+馬世平+王振中+丁崗+黃文哲+蕭偉

[摘要]為了考察不同產(chǎn)地銀杏葉藥材中黃酮醇苷和雙黃酮的含量差異，本實(shí)驗(yàn)采用Agilent ZORBAX SB- C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，在流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液系統(tǒng)，流速1 mL·min^-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm的條件下進(jìn)行梯度洗脫，建立了同時(shí)測(cè)定銀杏葉中7種黃酮醇苷和4種雙黃酮成分含量的高效液相色譜方法。測(cè)定結(jié)果表明10個(gè)不同產(chǎn)地的銀杏葉藥材中7種黃酮醇苷和4種雙黃酮成分的含量存在差異。

[關(guān)鍵詞] 銀杏葉； 黃酮醇苷； 雙黃酮； 高效液相法； 多成分定量

[Abstract] To study Ginkgo biloba leaves in different producing area， we establish an HPLC method for the simultaneously determination of seven flavonoids glycosides and four biflavonoids in G. biloba leaves. The analysis was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） wich acetonitrile， and 0.4% phosphoric acid as mobile phase at flow rate of 1 mL·min^-1 in a gradient edution， and the detection was carried out at 254 nm.The calibration curves of the seven flavonoids glycosides and four biflavonoids had a good linearitiy with good recoveries. The established HPLC method is simple， rapid， accurate， reliable， and sensitive， and can be applied to the identification and quality control of G. biloba leaves.

[Key words] Ginkgo biloba leaves； flavonoid glycosides； bisflavonoids； high performance liquid chromatography； multi components determination

銀杏葉為銀杏科植物銀杏Ginkgo biobal L.的干燥葉，化學(xué)成分包括黃酮醇苷、雙黃酮、原花青素、銀杏內(nèi)酯、聚戊烯醇、有機(jī)酸等^[1-2]。其中黃酮醇苷類化合物具有改善血液循環(huán)，抑制血栓形成，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，改善心腦功能的作用^[3-4]。近年來(lái)對(duì)銀杏葉中雙黃酮的研究也日益增多，異銀杏雙黃酮具有體內(nèi)外抑制大鼠血栓形成的作用^[5]，金松雙黃酮能夠增強(qiáng)紫杉醇對(duì)A54細(xì)胞的凋亡作用^[6]，銀杏雙黃酮具有抗卵巢腺癌細(xì)胞活性^[7]?？梢婞S酮醇苷和雙黃酮類成分是銀杏葉藥材中有生物活性的重要組成成分，比較具有研究?jī)r(jià)值，對(duì)銀杏葉藥材的質(zhì)量控制具有一定的意義。

近年來(lái)對(duì)銀杏葉中黃酮和雙黃酮類成分的含量測(cè)定多采用超高效液相法^[8-9]，高效液相法^[10]，固相萃取-高效液相色譜法^[11]，及超臨界流體色譜法^[12]等，而同時(shí)測(cè)定銀杏中10種黃酮苷類成分以上的文獻(xiàn)報(bào)道較為少見。本實(shí)驗(yàn)在采用高效液相色譜技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立同時(shí)測(cè)定銀杏葉中7種黃酮醇苷類和4種雙黃酮含量的方法，對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地的銀杏葉藥材進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，該方法精密度，穩(wěn)定性，重復(fù)性，準(zhǔn)確度良好，能夠比較精確地全面反映銀杏葉中黃酮醇苷類和雙黃酮類成分的含量，為銀杏葉藥材的質(zhì)量控制研究提供參考依據(jù)。

1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀（四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和DAD檢測(cè)器，Agilent科技有限公司）；AL204型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Lichrospher C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm） 型色譜柱；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）

甲醇（分析純）、磷酸（分析純）購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司；超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

銀杏葉藥材經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)現(xiàn)代中藥研究所王振中教授鑒定為銀杏科植物銀杏G. biobal 的干燥葉，產(chǎn)地來(lái)源見表1。槲皮素-3-O-蕓香糖苷（Ⅰ，批號(hào)15018），槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Ⅱ，批號(hào)150312），異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（Ⅲ，批號(hào)140622），異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（Ⅳ，批號(hào)150126），山柰酚-3-O-葡萄糖苷（Ⅴ，批號(hào)140524），山柰酚-3-O-蕓香糖苷（Ⅵ，批號(hào)141024），山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷（Ⅶ，批號(hào)150918），去甲銀杏雙黃酮（Ⅷ，批號(hào)150417），銀杏雙黃酮（Ⅸ，批號(hào)150417），異銀杏雙黃酮（Ⅹ，批號(hào)141216），金松雙黃酮（Ⅺ，批號(hào)150520）以上對(duì)照品購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C₁₈色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.4%磷酸（B）；梯度洗脫0～20 min，10～18%（A）；20～50 min，18%（A）；50～60 min，18%～26%（A）；60～80 min，26%～55%（A）；80～95 min，55～100%（A）；95～100 min，100%（A）。流速1 mL·min^-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL注入色譜儀，按上述色譜條件，記錄色譜圖，見圖1。各色譜峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于5 000，說(shuō)明方法適用于同時(shí)測(cè)定銀杏葉中的11種成分。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲銀杏雙黃酮、銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、金松雙黃酮11種對(duì)照品，加甲醇制成含相對(duì)應(yīng)對(duì)照品質(zhì)量濃度為0.010 5，0.053 0，0.015 5，0.090 0，0.050 0，0.101 5，0.106 0，0.150 0，0.110 0，0.110 0，0.120 0 g·L^-1的儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱放置，備用。

2.3 供試品溶液的制備 將銀杏葉粉碎過40目篩，精密稱取銀杏葉藥材1.000 g，精密加入體積分?jǐn)?shù)75%甲醇100 mL，稱重，置水浴中加熱回流提取40 min，取出，放冷，再稱重，用體積分?jǐn)?shù)75%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻后過濾，精密量取濾液50 mL，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?0 mL量瓶中，溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取1 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別置于2，5，10，25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，吸取上述不同濃度的混合對(duì)照品溶液及對(duì)照品初始混合溶液各10 μL，分別進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，見表2，結(jié)果表明在該范圍內(nèi)各對(duì)照品線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算6次峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏（relative standard deviation，RSD），結(jié)果顯示，槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲銀杏雙黃酮、銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、金松雙黃酮11種對(duì)照品RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取四川成都產(chǎn)地的銀杏葉供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果得槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲銀杏雙黃酮、銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、金松雙黃酮峰面積的RSD分別為0.37%，0.62%，0.85%，0.65%，0.73%，0.45%，1.6%，0.29%，0.31%，0.34%，0.28%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取四川成都產(chǎn)地的銀杏葉供試品溶液，平行制備6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果計(jì)算得槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲銀杏雙黃酮、銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、金松雙黃酮平均量分別為0.662 4，0.082 8，0.103 4，0.522 1，0.130 5，0.644 6，0.791 1，0.641 9，0.898 0，0.853 3，0.943 7 mg·g^-1，其RSD分別為0.89%，1.05%，0.93%，0.74%，1.66%，0.83%，0.69%，0.55%，0.53%，0.49%，均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取四川成都產(chǎn)地的銀杏葉供試品溶液，分別精密加入上述混合對(duì)照品溶液（與樣品中各待測(cè)成分的量相當(dāng)），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-2′，6′-二鼠李糖苷、去甲銀杏雙黃酮、銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、金松雙黃酮平均回收率分別為101.1%，100.3%，100.7%，101.3%，100.1%，100.0%，99.42%，101.9%，101.3%，100.3%，100.6%，RSD分別為0.34%，0.34%，0.81%，0.68%，0.58%，0.11%，0.88%，1.5%，0.38%，0.89%，1.1%，RSD均小于2%，結(jié)果表明本方法同時(shí)測(cè)定7種黃酮醇苷類和4種雙黃酮類成分的含量回收率結(jié)果良好。

2.9 樣品含量測(cè)定 按2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，每份供試品溶液分別平行測(cè)3次。用線性回歸方程計(jì)算10個(gè)產(chǎn)地銀杏葉藥材中11種化合物的含量，計(jì)算出平均值及相應(yīng)的RSD，見表3。各個(gè)產(chǎn)地不同化學(xué)成分的含量分布，見圖2。

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中考察了不同提取方法和提取時(shí)間對(duì)樣品提取率的影響。比較了超聲和回流提取的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)回流提取40 min時(shí)，提取效果較好。色譜條件中采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，同時(shí)考慮各組分的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和檢測(cè)靈敏度，選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

從表3及圖2結(jié)果中可以看出，無(wú)論是10種成分的含量總和還是各指標(biāo)成分分別比較，不同產(chǎn)地的銀杏葉存在差異，其中槲皮素-3-O-葡萄糖的RSD為49.07%可知地區(qū)間含量差異較大，而從圖2中可以看出產(chǎn)于山東郯城和遼寧錦州的銀杏葉中11種成分的總含量相對(duì)于其他產(chǎn)地較高，其中遼寧錦州產(chǎn)地的銀杏葉藥材中槲皮素-3-O-蕓香糖苷含量比較高，而山東郯城銀杏葉中金松雙黃酮含量較高。不同產(chǎn)地銀杏葉中含量的差異可能與環(huán)境，采集及處理方法有一定的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)相關(guān)影響因素進(jìn)行考察，后續(xù)可針對(duì)上述因素進(jìn)行相關(guān)更深入研究。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相建立的方法實(shí)現(xiàn)了同時(shí)測(cè)定黃酮醇苷和雙黃酮兩大類成分，可以較為全面的反映藥材中黃酮類成分信息，多指標(biāo)成分定量的作用。該方法為銀杏葉藥材及其制劑的質(zhì)量控制，準(zhǔn)確全面地評(píng)價(jià)其內(nèi)在品質(zhì)提供了有力的技術(shù)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]