C18柱串聯(lián)冠醚手性柱高效分離3種芳香族氨基酸對(duì)映體

劉育堅(jiān)　劉智敏　許志剛

摘要將C18柱與手性冠醚柱串聯(lián)，建立了一種反相高效液相色譜法用于3種芳香族氨基酸對(duì)映體同時(shí)拆分的方法?？疾炝朔聪嗌V流動(dòng)相的組成、pH值、柱溫、流速對(duì)對(duì)映體拆分的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 當(dāng)流動(dòng)相為HClO4乙腈溶液（86∶14， V/V， pH 2.0）、柱溫20℃、流速0.4 mL/min時(shí)，3種氨基酸對(duì)映體可獲得基線(xiàn)分離。進(jìn)一步對(duì)比了C18柱、冠醚手性柱和串聯(lián)順序不同的4種分離模式，結(jié)果表明，C18柱不能拆分氨基酸對(duì)映體，僅能分離不同種類(lèi)氨基酸； 冠醚手性柱可分離氨基酸映體，但不同種類(lèi)氨基酸色譜峰出現(xiàn)重疊； 串聯(lián)模式能實(shí)現(xiàn)3種氨基酸對(duì)映體的基線(xiàn)分離，實(shí)現(xiàn)雙柱優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，而串聯(lián)順序?qū)Ψ蛛x影響不大，僅影響色譜峰的峰形。

關(guān)鍵詞手性分離； 芳香族氨基酸； 對(duì)映體； 冠醚柱

1引言

手性是自然界的基本屬性，手性分子對(duì)映異構(gòu)體因其結(jié)構(gòu)的差異而具有不同的光學(xué)性能和生物活性[1～3]。氨基酸是蛋白質(zhì)最基本的組成單元，大多數(shù)的氨基酸都存在手性中心，故在臨床診斷和食品分析等領(lǐng)域均涉及氨基酸的手性分離與分析[4，5]。常見(jiàn)的α氨基酸大多是L構(gòu)型，是人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)； 而如阿爾茨海默癥等某些重要的生理疾病則與D構(gòu)型的氨基酸的濃度變化息息相關(guān)[6]。芳香族氨基酸是指含有芳香環(huán)的氨基酸，包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等[7]。在蛋白質(zhì)化學(xué)和臨床診斷與研究中，對(duì)芳香族氨基酸定量分析有著重要意義[8]。

手性化合物的拆分通常以正相色譜居多，可以獲得較好的分離效果。然而，反相手性色譜具有毒性小、成本低的優(yōu)點(diǎn)，并與實(shí)際樣品具有更好的相容性。近年來(lái)，反相手性色譜固定相和反相手性色譜拆分都得到了快速發(fā)展[9]，出現(xiàn)了一些適用于含水樣品中外消旋體分離的反相色譜分析方法[10～12]。然而，單一色譜柱常不能有效解決復(fù)雜樣品的手性分離分析問(wèn)題， 色譜柱串聯(lián)技術(shù)的提出，使這一問(wèn)題得到一定程度的解決[13]。

C18柱與手性柱進(jìn)行串聯(lián)，可同時(shí)發(fā)揮兩類(lèi)色譜柱的作用，有助于進(jìn)一步提升色譜分離效能。目前，已有C18柱串聯(lián)手性柱拆分外消旋體的報(bào)道。Sardella[14]等利用C18柱與奎寧手性柱串聯(lián)，同時(shí)拆分了甲狀腺素和三碘甲狀腺氨酸對(duì)映體。Perera等[15]將C18柱分別與3種手性柱串聯(lián)，對(duì)16種手性藥物進(jìn)行了拆分，手性化合物之間得到了較好分離，結(jié)果也表明手性柱和流動(dòng)相的選擇是影響串聯(lián)分離的重要因素。目前還未見(jiàn)此串聯(lián)技術(shù)用于手性氨基酸的分離。氨基酸的分離常需使用專(zhuān)用的氨基酸柱，對(duì)色譜分離條件有特定的要求，有時(shí)還需要柱前衍生[16]或使用手性添加劑[17]。本研究以3種芳香族氨基酸（結(jié)構(gòu)如圖1所示）外消旋體為拆分對(duì)象，建立了C18柱串聯(lián)手性冠醚柱同時(shí)拆分多種氨基酸對(duì)映體的反相色譜方法，實(shí)現(xiàn)了多種氨基酸對(duì)映體的高效分離，也為多種手性化合物的同時(shí)分離提供了新思路。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司），配備DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器； Innoval ASB C18色譜柱（50 mm × 4.6 mm， 5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）； CROWNPAK CRI（+）（150 mm × 3.0 mm， 5 μm，大賽璐藥物手性技術(shù)上海有限公司）； PS20潔康超聲波清洗機(jī)（東莞潔康超聲波設(shè)備有限公司）。

苯丙氨酸（99%）、乙腈（北京百靈威科技有限公司）； 色氨酸（99%，阿拉丁試劑上海有限公司）； 酪氨酸（98%，薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司）； HClO4（分析純，天津市鑫源化工有限公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品，以流動(dòng)相為溶劑，配制成50 mg/L的3種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將C18柱與CRI（+）柱串聯(lián)，C18柱在前、手性冠醚柱在后，通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行手性拆分。流動(dòng)相為HClO4乙腈溶液（pH 2.0），檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm，進(jìn)樣量為20 μL，拆分中分別對(duì)流動(dòng)相的配比、pH值、流速和柱溫進(jìn)行優(yōu)化，其中t1和t2分別為氨基酸兩個(gè)對(duì)映體的保留時(shí)間， Rs為分離度。

3結(jié)果與討論

3.1流動(dòng)相比例對(duì)拆分的影響

流動(dòng)相的種類(lèi)對(duì)手性分離的影響最為重要。冠醚柱CROWNPAK CRI（+）在HClO4溶液和乙腈組成的流動(dòng)相中對(duì)手性氨基酸具有較好的分離效果，并結(jié)合文獻(xiàn)所采用的流動(dòng)相[18，19]，以HClO4乙腈溶液（pH 1.5）為基礎(chǔ)，通過(guò)改變流動(dòng)相的比例，研究3種氨基酸混合物在串聯(lián)柱上的手性分離效果，C18柱在前，手性冠醚柱CRI（+）在后，結(jié)果如表1所示。在所選條件下，3種氨基酸對(duì)映體均得到基線(xiàn)分離，酪氨酸最先被洗脫出來(lái)，色氨酸則保留時(shí)間最長(zhǎng)； 隨著流動(dòng)相中乙腈比例的增多，對(duì)映體在兩根色譜柱上的保留時(shí)間減少，分離度降低。兼顧3種氨基酸同時(shí)分離的分離度和分析效率，選擇HClO4乙腈溶液（86∶14， V/V， pH 2.0）。

3.2HClO4溶液pH值對(duì)拆分的影響

流動(dòng)相中pH值會(huì)影響分析物的存在形態(tài)，進(jìn)而影響對(duì)映體在串聯(lián)柱上的保留行為。分別調(diào)節(jié)HClO4溶液的pH值為1.5、2.0、2.5，HClO4溶液與乙腈的體積比為86∶14， 3種氨基酸對(duì)映體在3種不同pH值下的分離結(jié)果如圖2所示。在使用pH 1.5和2.0的HClO4溶液為流動(dòng)相時(shí)，所有的氨基酸對(duì)映體得到基線(xiàn)分離； 而HClO4溶液的pH 2.5時(shí)，3種氨基酸對(duì)映體出峰時(shí)間早且分離效果差，酪氨酸和苯丙氨酸兩對(duì)對(duì)映體的4個(gè)色譜峰重疊在一起，在C18柱和手性柱上均沒(méi)有被分離。結(jié)果表明：降低pH值可以得到更大程度的分離，氨基酸上的氨基在HClO4溶液中會(huì)被質(zhì)子化，同時(shí)氨基酸的NH+4在手性聯(lián)萘冠醚空腔內(nèi)的作用增強(qiáng)，使得分析物在色譜柱上的保留時(shí)間增加。 進(jìn)一步降低pH值時(shí)，各色譜峰的分離度增大，但出峰時(shí)間太長(zhǎng)，綜合考慮，選擇流動(dòng)相pH=2.0進(jìn)行分離。