麥冬寡糖的提取純化及抑制α—葡萄糖苷酶活性的研究

許定舟+蘇薇薇++王永剛++彭維++吳忠

[摘要] 目的 研究麥冬中寡糖的提取分離純化工藝，并考察其抑制α-葡萄糖苷酶活性。 方法 采用乙醇和水提取麥冬寡糖，以Sephadex G-75柱層析法進(jìn)行脫色脫蛋白，利用基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MASS）檢測其分子量范圍；采用來源于啤酒酵母的α-葡萄糖苷酶和來源于大鼠的具有α-葡萄糖苷酶活性的小腸絨毛提取物，考察麥冬寡糖的抑制α-葡萄糖苷酶活性。 結(jié)果 采用乙醇和水提取得到的麥冬提取液中寡糖含量為86.73%，提取率為69.4%；利用Sephadex-G75柱層析法能有效地純化麥冬寡糖，除去色素和蛋白質(zhì)分子，麥冬寡糖提取物的總寡糖含量達(dá)到97.64%，其分子量范圍在500～2500之間；該麥冬寡糖對α-葡萄糖苷酶活性具有顯著抑制作用。 結(jié)論 本研究提取純化麥冬寡糖的方法是合理、可行的；麥冬寡糖具有顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性。

[關(guān)鍵詞] 麥冬寡糖；提取純化；α-葡萄糖苷酶

[中圖分類號] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（a）-0020-03

Extraction、purification and α-glucosidase inhibitory activity of oligosaccharide from Ophiopogonis japonicas

XU Dingzhou SU Weiwei WANG Yonggang PENG Wei WU Zhong LI Peibo

College of Life Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275， China

[Abstract] Objective To investigate the extraction，purification and α-glucosidase inhibitory activity of oligosaccharide from Ophiopogonis japonicas. Methods In this study，Ophiopogonis japonicas oligosaccharides were extracted with 95% alcohol and water successively， and the extract was purified by Sephadex G-75 chromatography to remove protein and pigment.The molecular weight range was determined by MALDI-TOF-MASS. The α-glucosidases of rat intestines and Saccharomyces cerevisiae were used to evaluate the inhibitory activity of Ophiopogonis japonicus oligosaccharides. Results The content of oligosaccharide extracted with 95% alcohol and water successively was 86.73%，and the extraction rate was 69.4%. After being purified by Sephadex G-75 chromatography， the protein and pigment in oligosaccharide extract was removed effectively and the content of oligosaccharide increased to 97.64%.The molecular weights were in the range of 500-2500. Furthermore，Ophiopogonis japonicas oligosaccharide could significantly inhibit the activity of α-glucosidase. Conclusion The methods of extraction and purification are technically reasonable and feasible；Ophiopogonis japonicus oligosaccharide possess significant α-glucosidase inhibitory activity.

[Key words] Ophiopogonis japonicus oligosaccharide；Extraction and purification；α-glucosidase

麥冬為百合科植物麥冬[Ophiopogon japonicas （L.f） Ker-Gawl.]的干燥塊根，有養(yǎng)陰生津、潤肺清心之功，主要用于肺燥干咳、津傷口渴、內(nèi)熱消渴和腸燥便秘等[1]?！侗静菡x》記載[2]：“凡消谷能食，無非胃火極旺，必以甘寒大劑清胃解渴，麥冬固在必需之列者也”。有研究表明麥冬對四氧嘧啶[3]、鏈脲佐菌素[4-5]誘導(dǎo)的高血糖動(dòng)物和自發(fā)性糖尿病大鼠[6]具有顯著降血糖作用。麥冬中含有皂苷、黃酮、氨基酸和糖類等成分[7-8]。由于我國糖尿病發(fā)病人數(shù)逐年上升[9]，麥冬顯著的降血糖作用引起了越來越多的重視[10-12]。已有研究表明，麥冬多糖具有顯著降血糖作用[3，5，12]。本課題組前期研究表明，麥冬寡糖具有顯著抗2型糖尿病作用[13]，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)研究麥冬中寡糖的提取純化工藝，并考察其抑制α-葡萄糖苷酶活性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 麥冬，購于廣州清平藥材市場，經(jīng)中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院彭維主任藥師鑒定，為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicas（L.f）Ker-Gawl.的干燥塊根；α-葡萄糖苷酶（美國，SIGAMA）；阿卡波糖（中國，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷（美國，SIGAMA）；蒽酮、無水乙醇、無水乙醚、丙酮、D-果糖等試劑均為分析純。

1.1.2 設(shè)備與儀器 常壓蛋白層析儀（美國，BIO-RAD）；自動(dòng)部分收集器（美國，BIO-RAD）；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-19101，北京普析通用公司）；基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MASS；美國，Bruker Daltonics）；酶標(biāo)儀（美國，THERMO公司）；Sephadex G-75（瑞典，Pharmacia公司）。

1.2 動(dòng)物

Wistar大鼠，7周齡，雄性，體重180～200 g，SPF級，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK（粵）2008-0002。

1.3 方法

1.3.1 麥冬寡糖的提取與純化 取麥冬藥材適量，剪碎，加10倍量95%乙醇，回流2 h，過濾，棄濾液，揮干乙醇，加10倍量蒸餾水，水浴提取2次，濾過，合并濾液，減壓濃縮至密度為1.2 g/mL，加乙醇至醇濃度為80%，靜置12 h，沉淀，分別以無水乙醇、無水乙醚、丙酮洗滌，55℃烘干，即得麥冬粗提取物。取麥冬粗提取物，溶于適量蒸餾水中，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心，除去沉淀，Sephadex G-75層析柱（3 cm×80 cm）上樣，以蒸餾水洗脫，流速為0.5 mL/min。每管5 mL，自動(dòng)部分收集器收集，合并洗脫峰，冷凍干燥，得到純化后的麥冬寡糖。硫酸-蒽酮法測定總寡糖含量。將Sephadex G-75柱層析所得麥冬寡糖樣品溶于超純水，配成2 μg/mL溶液，分別取0.5 μL樣品溶液與5mg/mL 的基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸（DHB）互溶揮干溶液，采用MALDI-TOF-MASS進(jìn)樣檢測麥冬寡糖的分子量范圍。

1.3.2 麥冬寡糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響 （1）大鼠小腸α-葡萄糖苷酶提取液的制取，參照文獻(xiàn)方法[14]，取Wistar大鼠，禁食24 h后，脫頸椎處死，立即取出小腸，用冰冷生理鹽水沖洗小腸內(nèi)外，將洗凈的小腸置于冰臺(tái)上，用載玻片輕刮小腸黏膜，稱重后加入5倍量的4 ℃磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），勻漿后于4℃、5000 r/min冷凍離心30 min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法測定上清液蛋白含量，于-20℃下保存?zhèn)溆?。?）樣品溶液配制，稱取麥冬寡糖樣品，用磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）溶解配制成濃度為400 mg/mL、200 mg/mL、100 mg/mL的麥冬寡糖溶液；取阿卡波糖片，以磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）溶解，2000 r/min離心10 min，棄沉淀，使終濃度為50 mg/mL。（3）α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定，參照文獻(xiàn)方法[15-16]，以96孔微板為反應(yīng)載體，經(jīng)改進(jìn)優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：每孔加入67 mmoL/L磷酸鹽緩沖液20 μL、3 mmoL/L谷胱甘肽溶液10 μL、大鼠小腸絨毛α-葡萄糖苷酶提取液或0.04 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液10 μL、受試樣品20 μL，37℃溫孵10 min后，加入0.01 moL/L對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷溶液20 μL，反應(yīng)20 min，用0.1 moL/L Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)，在波長為400 nm的條件下，用酶標(biāo)儀測定吸光值。每組設(shè)三個(gè)平行，每個(gè)濃度測定三次抑制率，取平均抑制率計(jì)算受試樣品和陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

2 結(jié)果

2.1 麥冬寡糖的提取與純化

采用95%乙醇和水提取后，得到的麥冬提取物中寡糖的含量為86.73%，提取率為69.4%。經(jīng)Sephadex G-75柱層析所得樣品的寡糖含量為97.64%，樣品顏色變?yōu)榧儼咨氐玫接行コ?。?jīng)MALDI-TOF-MASS進(jìn)樣檢測，該麥冬寡糖的分子量范圍在500～2500之間。見圖1。

2.2 麥冬寡糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響

麥冬寡糖對來源于啤酒酵母的α-葡萄糖苷酶和大鼠小腸絨毛中提取的α-葡萄糖苷酶的酶活性都具有抑制作用，在濃度為100～400 mg/mL之間，抑制作用具有劑量依賴關(guān)系，當(dāng)濃度為400 mg/mL時(shí)，抑制強(qiáng)度與阿卡波糖相當(dāng)。說明麥冬寡糖具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。見圖2～3。

3 討論

寡糖一般是指由2～10個(gè)單糖以糖苷鍵相連形成的糖分子聚合物。寡糖及其衍生物是一類重要的生物活性物質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、改善菌群結(jié)構(gòu)等多種作用[17-18]。目前，寡糖的制備方法主要有從天然產(chǎn)物直接提取、酶催化合成或酶解天然多糖、酸水解天然多糖和化學(xué)合成等4種[17]。天然寡糖的提取方法主要有水提法、有機(jī)溶劑抽提法、微波提取法、超聲波提取法；常見的寡糖分離和純化方法有薄層層析法、活性炭柱層析法、色譜柱分離法、膜分離技術(shù)等[19-20]。許多中藥含有寡糖，且有些具有較好的藥理活性，但目前對中藥寡糖的研究較少，值得進(jìn)一步深入開發(fā)研究。

本研究采用乙醇和水提取麥冬寡糖，得到的麥冬提取物中寡糖含量為86.73%，提取率為69.4%，說明本方法能較好地提取麥冬寡糖；經(jīng)Sephadex G-75柱層析法除去色素和蛋白質(zhì)分子后，麥冬寡糖提取物的總寡糖含量達(dá)到97.64%，樣品顏色變?yōu)榧儼咨崾驹摲椒梢杂行コ崛∥镏械牡鞍缀蜕?，適宜于麥冬寡糖的純化。經(jīng)MALDI-TOF-MASS檢測，該麥冬寡糖的分子量范圍在500～2500之間。課題組前期研究顯示麥冬寡糖具有顯著抗2型糖尿病作用[13]，本研究結(jié)果表明，該麥冬寡糖能顯著抑制來源于啤酒酵母的α-葡萄糖苷酶和來源于大鼠小腸絨毛的α-葡萄糖苷酶的活性。本研究為麥冬寡糖在糖尿病的預(yù)防和治療方面的應(yīng)用及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-09-28 本文編輯：王雪）