丹參酮ⅡA對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

湯世民++吳詠梅++周雨亭++李欣悅++孟祥寶

[摘要] 目的 觀察丹參酮ⅡA對大鼠心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。 方法 采用隨機(jī)數(shù)表法將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、丹參酮ⅡA 30 mg/kg組、辛伐他汀50 mg/kg組。預(yù)給藥7天，丹參酮ⅡA腹腔注射給藥，辛伐他汀灌胃給藥，假手術(shù)組和MIRI模型組大鼠則灌胃和腹腔注射等量體積的生理鹽水。末次給藥1h后，采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。硫代巴比妥酸（TBA）法檢測血漿和心肌組織的丙二醛（MDA），羥胺法檢測超氧化物歧化酶（SOD），可見光法檢測過氧化氫酶（CAT），比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）；Western bolt法檢測心肌組織Nrf-2、HO-1蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 丹參酮ⅡA 30 mg/kg和辛伐他汀50 mg/kg均能顯著增加MIRI大鼠血清和心肌組織中SOD、CAT和GSH-Px活力（P < 0.01），降低MDA水平（P < 0.01），增加心肌組織Nrf-2和HO-1蛋白的表達(dá)水平（P < 0.05）。 結(jié)論 丹參酮ⅡA對大鼠心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有顯著的抑制作用。

[關(guān)鍵詞] 丹參酮ⅡA；心肌缺血再灌注損傷；氧化應(yīng)激

[中圖分類號] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（a）-0008-04

The protective effect of TanshinoneⅡA on oxidative stress induced bymyocardial ischemia reperfusion injury of rats

TANG Shimin1 WU Yongmei1 ZHOU Yuting2 LI Xinyue1 MENG Xiangbao3 ZHANG Hui1▲

1.College of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，China；3.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of TanshinoneⅡA on oxidative stress induced by myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI） of rats. Methods 40 SD rats were randomly divided into sham group， myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI） group，TanshinoneⅡA 30 mg/kg group andsimvastatin 50 mg/kg groupby random number method.All the rats werepretreated for 7 days.TanshinoneⅡA was given by abdominal injection，and simvastatin was given by gastric perfusion，while the sham and model groups were given equal volume of saline solution by abdominal injection and gastric perfusion.After 1h of the last administration，the model of MIRI was establised by ligatingthe left anterior descending branch of coronary artery.Malondialdehyde（MDA）in serum and myocardial tissue was detected by thiobarbituric acid（TBA）method，Superoxide Dismutase（SOD）was detected by hydroxylamine method，Catalase （CAT） was detected by Visible light， Glutathione peroxidase（GSH-Px） by colorimetric method. The expression of Nrf-2 and HO-1 protein were measured by Western blot. Results TanshinoneⅡA and simvastatin couldincrease the activity of SOD，CAT，GSH-Px（P < 0.01），reduce the MDAin serum and myocardial tissue（P < 0.01），and increase the expression level of Nrf-2 and HO-1 proteinin myocardial tissueof MIRI rats（P < 0.01）. Conclusion TanshinoneⅡAhas significant inhibitory effect onoxidative stress induced by MIRI of rats.

[Key words] TanshinoneⅡA；Myocardialischemia reperfusion injury；Oxidative stress

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指缺血的心肌在恢復(fù)供血后，不僅功能未得到恢復(fù)，反而損傷加重，出現(xiàn)心律失常、梗死面積擴(kuò)大、舒縮功能降低等現(xiàn)象[1]。MIRI發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其中由于再灌注引起的氧自由基大量積累所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是重要的機(jī)制之一[2]。MIRI是臨床缺血性心臟病治療過程中的難題[3]，目前仍沒有較好的防治方法。

中藥防治冠心病有獨(dú)特的療效[4-5]。丹參（Salvia？鄄miltorrhiza Bge.）為唇形科多年生草本植物，以根入藥，具有活血化淤、通經(jīng)止痛、清心除煩等功效[6]，臨床廣泛用于心腦血管疾病的治療。丹參酮（tanshinone）為丹參的有效活性組分，其中丹參酮ⅡA為丹參酮中含量最高的活性成分[7]，在心血管疾病以及抗炎、抗腫瘤等方面有較好效果[8-11]。本研究采用大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎[12]所造成的急性心肌梗死模型，以丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），和Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)水平為考察指標(biāo)[13-14]，探討丹參酮ⅡA對MIRI氧化應(yīng)激的作用，以期為冠心病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體重260～280 g（2月齡），無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號為SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物到達(dá)之后，在SPF級動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為室溫18～25℃，環(huán)境相對濕度為50%～80%，自由飲食飲水，每組均給予正常飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司，20160403）。辛伐他汀片（美國默沙東公司，M013303）。戊巴比妥鈉（Sigma公司，P3761）。羧甲基纖維素鈉（Amresco公司，BS0308）。MDA（批號：20160826）、SOD（批號：20160723）、CAT（批號：20160902）和GSH-Px（批號：20160622）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。Tissue Protein Extraction Kit（批號：01434/40116）、BCA Protein Assay Kit（批號：30134）、SDS-PAGE Gel Kit（批號：20118）和eECL Western Blot Kit（批號：00081508）均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Nrf2、HO-1、β-actin抗體均購自Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的二抗購自中杉生物有限公司。

1.3 儀器

電子天平（AL104-IC型，Mettler Toledo公司）。多導(dǎo)（16道）生理記錄儀（MP150型，BIOPAC公司）。小動(dòng)物呼吸機(jī)（ALS-V8S型，上海奧爾科特生物科技有限公司）。酶標(biāo)儀（Tecan Infinite M1000 PRO型，Tecan公司）。離心機(jī)（L550型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。Bio-rad ChemiDoc XRS+ System，（Bio-Rad公司）。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)表法將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、丹參酮ⅡA 30 mg/kg組、辛伐他汀50 mg/kg組。MIRI前連續(xù)給藥7d，丹參酮ⅡA腹腔注射給藥，辛伐他汀灌胃給藥，假手術(shù)組和MIRI模型組大鼠則灌胃和腹腔注射等量體積的生理鹽水。

1.5 大鼠心肌缺血再灌注模型制備

3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)口氣管插管，連接呼吸機(jī)，仰臥固定，記錄心電。左胸部脫毛，消毒，于3～4肋間切皮鈍性分離開胸。在肺動(dòng)脈圓錐左側(cè)與左心耳交界下緣2～3 mm處，以6-0無創(chuàng)縫合針絲線，進(jìn)針深度1.5～2.0 mm，寬2～3 mm，絲線經(jīng)套管套入，收緊絲線以止血鉗固定套管，進(jìn)行心肌缺血，肉眼觀查心臟左室壁出現(xiàn)變暗變紫，且心電圖呈示ST段明顯抬高（> 0.25 mV）為結(jié)扎成功。缺血30 min后，松開止血鉗，取下套管恢復(fù)心肌供血再灌注。取出結(jié)扎線，關(guān)閉胸腔，縫合傷口，充分排空左側(cè)胸腔內(nèi)氣體，待大鼠麻醉清醒后撤出呼吸插管，恢復(fù)自主呼吸[15]。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，其他操作與模型組相同。再灌注8 h后取材，收集相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.6 血漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)（MDA、SOD、CAT和GSH-Px）檢測

腹主動(dòng)脈取血5 mL，肝素抗凝，3000 r/min（r=156.25 mm）離心10 min取血清。南京建成試劑盒檢測血清MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平。

1.7 心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

取大鼠心臟梗死區(qū)域心肌組織，勻漿，3000 r/min（r=156.25 mm）離心10min取上清。南京建成試劑盒檢測MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平。

1.8 Western blot 檢測心肌組織Nrf2、HO-1表達(dá)

取梗死區(qū)心肌組織，按說明書分別進(jìn)行全細(xì)胞、胞核和胞漿蛋白的提取，BCA法測定蛋白含量，取蛋白樣品與5×還原loading buffer混合后沸水煮沸5 min，使蛋白變性。SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉，再分別與兔抗大鼠β-actin抗體（1∶1000）、Nrf2抗體（1∶500）、HO-1抗體（1∶500）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，然后與HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔（1∶1000）室溫孵育，以高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒 eECL Western Blot Kit顯影，通過Bio-rad ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用非配對的t檢驗(yàn)和One-way ANOVA對計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P < 0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組血清中的MDA水平顯著升高（P < 0.01），SOD、CAT和GSH-Px活力顯著下降（P < 0.01）。與模型組相比，丹參酮ⅡA（30 mg/kg）組和辛伐他?。?0 mg/kg）組均能夠降低血清中的MDA水平（P < 0.01），增加SOD、CAT和GSH-Px活力（P < 0.01）。見表1。

2.2 心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織中的MDA水平顯著升高（P < 0.01），SOD、CAT和GSH-Px活力顯著下降（P < 0.01）。與模型組相比，丹參酮ⅡA 30 mg/kg組和辛伐他汀50 mg/kg組均能夠降低心肌組織中的MDA水平（P < 0.01），增加SOD、CAT和GSH-Px活力（P < 0.01）。見表2。

2.3 各組心肌組織Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

如圖1所示，與假手術(shù)組比較，模型組胞漿和胞核Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高（P < 0.01），Nrf2核轉(zhuǎn)位率顯著增加（P < 0.01）。與模型組比較，丹參酮ⅡA 30 mg/kg和辛伐他汀50 mg/kg組胞漿Nrf2蛋白表達(dá)量顯著降低（P < 0.01），胞核Nrf2蛋白表達(dá)量顯著升高（P < 0.01），Nrf2核轉(zhuǎn)位率顯著增加（P < 0.01）。與假手術(shù)組比較，MIRI模型組心肌組織中的HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P < 0.01）。與模型組相比，丹參酮ⅡA 30 mg/kg和辛伐他汀50 mg/kg組的HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P < 0.01）。

3 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多，清除能力降低，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引起的氧化損傷過程[16]。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[17]。在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核[18]，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE）[19]結(jié)合，啟動(dòng)ARE調(diào)控的第Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對氧化應(yīng)激和親核化合物的抗性。ARE調(diào)控的抗氧化基因HO-1[20]等表達(dá)增加，保護(hù)機(jī)體免受活性氧的侵害。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，丹參酮ⅡA 30 mg/kg組和辛伐他汀50 mg/kg組血清和心肌組織中的MDA水平顯著下降（P < 0.01），SOD、CAT和GSH-Px活力顯著增加（P < 0.01）；心肌組織胞核 Nrf2 蛋白表達(dá)量顯著升高（P < 0.01），Nrf2核轉(zhuǎn)位率顯著增加（P < 0.01）；HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P < 0.01）。表明丹參酮ⅡA 30 mg/kg和辛伐他汀50 mg/kg均能顯著抑制MIRI誘導(dǎo)的大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力。

綜上所述，丹參酮ⅡA 30 mg/kg可抑制MIRI誘導(dǎo)的大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機(jī)制可能與增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力，抑制脂質(zhì)過氧化，激發(fā)Nrf2調(diào)控的抗氧化反應(yīng)，增加抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)水平有關(guān)。

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（收稿日期：2016-10-27 本文編輯：杜雪）