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    高效液相色譜法測定黃芪赤風(fēng)湯提取物中萜類和色酮類成分的含量

    2017-04-05 00:51:52谷雨龍劉斌姜艷艷
    環(huán)球中醫(yī)藥 2017年3期
    關(guān)鍵詞:毛蕊號峰萜類

    谷雨龍 劉斌 姜艷艷

    ·論著·

    高效液相色譜法測定黃芪赤風(fēng)湯提取物中萜類和色酮類成分的含量

    谷雨龍 劉斌 姜艷艷

    目的 建立HPLC法測定黃芪赤風(fēng)湯提取物中萜類和色酮類成分的含量。方法 采用Venusil MP-C18(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈(A)-水(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0~45 min,10%→18% A;45~100 min,18%→45% A);檢測波長:220 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;LCMS-IT-TOF法指認(rèn)萜類和色酮類成分,分別以芍藥苷和毛蕊異黃酮苷為參比計(jì)算兩類成分含量。結(jié)果 芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的線性范圍分別為0.279~6.696 μg和0.192~4.608 μg(r=0.999 8);平均回收率(n=6)分別為98.83%和98.21%,RSD分別為3.06%和3.24%;經(jīng)LCMS-IT-TOF法指認(rèn)萜類成分4個,色酮類成分12個。結(jié)論 所建立的方法快速、簡單、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng),精密度好,可用于黃芪赤風(fēng)湯提取物的質(zhì)量控制。

    高效液相色譜法; 黃芪赤風(fēng)湯提取物; 芍藥苷; 毛蕊異黃酮苷

    經(jīng)典方劑黃芪赤風(fēng)湯源自清代王清任的《醫(yī)林改錯》,由黃芪、赤芍和防風(fēng)組成。其中,黃芪補(bǔ)氣活血、宣通營衛(wèi),為君藥;赤芍清熱涼血、活血祛瘀,助黃芪使氣足血行,周流全身,為臣藥;佐以防風(fēng)祛風(fēng)解表、勝濕解痙止痛?!叭缰沃T瘡、諸病,或因病虛弱,服之皆效。無病服之,不生疾病。此方治諸病皆效者,能使周身之氣通而不滯,血活而不瘀,氣通血活,何患疾病不除?!爆F(xiàn)代研究表明,黃芪皂苷及黃酮部位可以抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖,發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)損傷的作用,黃芪黃酮具有免疫調(diào)節(jié)作用[1-3];赤芍單萜苷具有消炎鎮(zhèn)痛、改善血液流變學(xué)和免疫調(diào)節(jié)的作用[4,5];防風(fēng)色原酮有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎和降低血漿黏度活性[6,7],上述四類成分系該方的主要有效部位或組分。為此,采用大孔吸附樹脂分離純化技術(shù),分離富集了黃芪皂苷與黃酮部位、赤芍單萜苷部位、防風(fēng)色原酮部位,制得黃芪赤風(fēng)湯提取物,先期采用不同方法對該方提取物中主要成分含量進(jìn)行了測定[8-9]。為全面控制該方提取物質(zhì)量,采用LCMS-IT-TOF對其化學(xué)成分進(jìn)行分析(另文發(fā)表),同時以芍藥苷作為萜類(黃芪皂苷、赤芍單萜苷)的指標(biāo)性成分,以毛蕊異黃酮苷作為色酮類(黃芪黃酮、防風(fēng)色原酮)的指標(biāo)性成分,建立HPLC方法同時測定兩類成分的相對含量。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試藥

    LCMS-IT-TOF儀(日本島津公司),SIL-20AC自動進(jìn)樣器,SPD-20A檢測器,LabSolutions工作站;FC104型十萬分之一電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司),KQ-500E超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司),Milli-Q超純水儀(密理博公司)。

    黃芪赤風(fēng)湯提取物(自制)。色譜級乙腈(Fisher Scientific),超純水,其他試劑均為分析純。

    芍藥苷(批號BBT0148-20111122)和毛蕊異黃酮苷(批號20121334)對照品購自天津一方科技有限公司。黃芪(批號120505)產(chǎn)地為內(nèi)蒙古,購自北京亞威中藥飲片有限公司,赤芍(批號120201)、防風(fēng)(批號120301)產(chǎn)地分別為內(nèi)蒙古和黑龍江,購自湖北金貴中藥飲片有限公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定,分別為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根、毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根、傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk.未抽花莖的干燥根。

    1.2 溶液制備

    1.2.1 對照品溶液制備 稱取芍藥苷和毛蕊異黃酮苷對照品適量,加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為490 μg/mL和558 μg/mL的對照品儲備液。分別吸取對照品儲備液2 mL和2.5 mL,用甲醇定容至5 mL,配制成質(zhì)量濃度分別為196 μg/mL、279 μg/mL的芍藥苷、毛蕊異黃酮苷混合對照品溶液。

    1.2.2 供試品溶液 取黃芪赤風(fēng)湯提取物干燥粉末約20 mg,精密稱定,加入70%乙醇(v/v)5 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)60分鐘,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%乙醇(v/v)補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

    1.3 色譜條件

    Venusil MP-C18(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈(A)-水(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0~45 min,10%→18% A;45~100 min,18%→45% A);檢測波長:220 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。在上述色譜條件下,分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣。在混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上,有相同保留時間的色譜峰,且各成分分離良好(見圖1)。

    1.4 方法學(xué)考察

    1.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液1、2、4、8、12、16、24 μL進(jìn)樣,分別以芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的含量為橫坐標(biāo),以其峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行線性回歸,計(jì)算回歸方程。芍藥苷的回歸方程為:Y=347 900X+3 526.7,r=0.999 8;毛蕊異黃酮苷的回歸方程為:Y=1 997 543X-58 026,r=0.999 8。結(jié)果表明:芍藥苷在0.279~6.696 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系;毛蕊異黃酮苷在0.192~4.608 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

    1.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份黃芪赤風(fēng)湯提取物供試品溶液,在“1.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測定峰面積,計(jì)算芍藥苷和毛蕊異黃酮苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.54%和1.32%。

    1.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份黃芪赤風(fēng)湯提取物供試品溶液,分別于制備后0、2、4、6、8、12、24小時注入液相色譜儀,計(jì)算芍藥苷和毛蕊異黃酮苷峰面積的RSD(n=6)分別為3.18%和1.95%。

    1.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批黃芪赤風(fēng)湯提取物干燥粉末6份,每份約20 mg,精密稱定,按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“1.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測定。計(jì)算芍藥苷和毛蕊異黃酮苷平均含量(n=6)分別為97.22 mg/g和40.26 mg/g,RSD分別為2.83%和3.39%。

    1.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批黃芪赤風(fēng)湯提取物干燥粉末6份,每份約10 mg,精密稱定,分別精密加入一定量的芍藥苷(490 μg/mL)和毛蕊異黃酮苷(558 μg/mL)對照品溶液,按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定,分別計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷和毛蕊異黃酮苷平均回收率(n=6)分別為98.83%和98.21%,RSD分別為3.06%和3.24%。

    注:1.氧化芍藥苷;2. 芍藥苷;3. 升麻素苷;4. 毛蕊異黃酮苷;5. 升麻素;6. 5-O-甲基維斯阿米醇苷;7. 芒柄花苷; 8. 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-(6″-乙?;?-葡萄糖苷;9. 9, 10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-葡萄糖苷;10. 亥茅酚苷;11. 異槲皮苷; 12. 毛蕊異黃酮;13. 芒柄花素;14. 黃芪皂苷乙;15. 珊瑚菜素;16. 黃芪皂苷Ⅱ(或異黃芪皂苷Ⅱ)

    圖1 黃芪赤風(fēng)湯提取物中對照品(A)和供試品(B)高效液相色譜圖

    1.5 測定方法

    采用LCMS-IT-TOF法指認(rèn)萜類和色酮類成分,分別以芍藥苷和毛蕊異黃酮苷為參比計(jì)算兩類成分含量。

    2 結(jié)果

    2.1 LCMS-IT-TOF法指認(rèn)萜類和色酮類部位主要色譜峰

    精密吸取黃芪赤風(fēng)湯提取物供試品溶液注入LCMS-IT-TOF,按照“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測,根據(jù)黃芪赤風(fēng)湯提取物總離子流圖各色譜峰的保留時間,結(jié)合各色譜峰的一級、二級質(zhì)譜信息及紫外光譜信息,確定主要色譜峰結(jié)構(gòu)。同時通過對照品質(zhì)譜比對和文獻(xiàn)查閱[10-12],指認(rèn)出16個色譜峰,其中萜類成分4個,分別為氧化芍藥苷(1號峰)、芍藥苷(2號峰)、黃芪皂苷乙(14號峰)和黃芪皂苷Ⅱ(或異黃芪皂苷Ⅱ)(16號峰);色酮類成分12個,分別為升麻素苷(3號峰)、毛蕊異黃酮苷(4號峰)、升麻素(5號峰)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(6號峰)、芒柄花苷(7號峰)、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-(6″-乙酰基)-葡萄糖苷(8號峰)、9, 10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-葡萄糖苷(9號峰)、亥茅酚苷(10號峰)、異槲皮苷(11號峰)、毛蕊異黃酮(12號峰)、芒柄花素(13號峰)和珊瑚菜素(15號峰)。

    2.2 萜類和色酮類成分含量測定

    經(jīng)LCMS-IT-TOF法指認(rèn)的萜類和色酮類成分,分別以芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的含量為參比計(jì)算出相對含量,并計(jì)算出黃芪赤風(fēng)湯提取物中可測總色酮類和可測總萜類成分的相對含量。結(jié)果見表1和表2。

    表1 黃芪赤風(fēng)湯提取物中色酮類成分相對含量測定結(jié)果(n=3)

    表2 黃芪赤風(fēng)湯提取物中萜類成分相對含量測定結(jié)果(n=3)

    2.3 芍藥苷和毛蕊異黃酮苷含量測定結(jié)果

    取3批黃芪赤風(fēng)湯提取物樣品,按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,測定峰面積,計(jì)算芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的含量。結(jié)果見表3。

    表3 黃芪赤風(fēng)湯提取物樣品含量測定結(jié)果(n=3)

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)采用SPD檢測器,分別在203、220、254、280、330 nm波長下考察黃芪赤風(fēng)湯提取物樣品HPLC圖譜,經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)樣品在220 nm下的吸收峰最全、最多,故選擇220 nm下檢測樣品的萜類和色酮類成分。

    經(jīng)LCMS-IT-TOF法指認(rèn)的16個成分中,來源于黃芪的成分9個,分別是毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-(6″-乙?;?-葡萄糖苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-葡萄糖苷、異槲皮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷乙和黃芪皂苷Ⅱ(或異黃芪皂苷Ⅱ);來源于赤芍的成分2個,分別是氧化芍藥苷和芍藥苷;來源于防風(fēng)的成分5個,分別是升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和珊瑚菜素。

    本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-SPD法同時測定黃芪赤風(fēng)湯提取物中芍藥苷和毛蕊異黃酮苷的含量,并以二者為參比,分別計(jì)算樣品中16個萜類和色酮類成分的相對含量,可基本全面反映復(fù)方提取物質(zhì)量,方法簡單,結(jié)果準(zhǔn)確,專屬性強(qiáng),可用于黃芪赤風(fēng)湯提取物的質(zhì)量控制。

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    (本文編輯: 董歷華)

    RP-HPLC analysis of terpenoids and chromones in the extractive ofHuangqiChifengdecoction

    GUYulong,LIUBin,JIANGYanyan.

    KeyLaboratoryofChineseMinorityTraditionalMedicine(MinzuUniversityofChina),StateEthnicAffairsCommissionandMinistryofEducation,Beijing100081,China

    Correspondingauthor:GUYulong,E-mail:guyulong@muc.edu.cn

    Objective To develop an HPLC method for determination of terpenoids and chromones in the extractive ofHuangqichifengdecoction. Methods Venusil MP-C18(4.6×250 mm,5 μm) was used to detect. The mobile phase was composed of acetonitrile(A) and water(B) with gradient elution(0~45 min,10%→18% A;45~100 min,18%→45% A) and the flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 220 nm. The column temperature was 35℃. Terpenoids and chromones were identified by LCMS-IT-TOF method, paeoniflorin and calycosin-7-glucoside was regarded as reference to calculate. Results The linear ranges of paeoniflorin and calycosin-7-glucoside were 0.279~6.696 μg and 0.192 ~ 4.608 μg(r=0.999 8) respectively. The average recovery was 98.83% and 98.21 % (RSD<3.24%,n=6) respectively. Four terpenoids and twelve chromones were identified by LCMS-IT-TOF. Conclusion The method is simple, accurate, repeatable and can be used to control the quality of the extractive ofHuangqichifengdecoction.

    HPLC; Extractive ofHuangqichifengdecoction; Paeoniflorin; Calycosin-7-glucoside

    國家自然科學(xué)基金(81603278);教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”(IRT_13R63);中央民族大學(xué)青年教師科研專項(xiàng)(2016KYQN51)

    100081 北京,中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(谷雨龍);北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(劉斌、姜艷艷)

    谷雨龍(1982- ),博士,實(shí)驗(yàn)師。研究方向:傳統(tǒng)藥物分析。E-mail:guyulong@muc.edu.cn

    R284.1

    A

    10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.009

    2016-09-20)

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