2株促進(jìn)沉香形成的色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)的生物學(xué)特性研究

陳旭玉,劉洋洋,劉培衛(wèi),彭德乾,魏建和*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所,北京 100193;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所/海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 萬(wàn)寧 570311)

2株促進(jìn)沉香形成的色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)的生物學(xué)特性研究

陳旭玉1,2,劉洋洋1,2,劉培衛(wèi)2,彭德乾2,魏建和1,2*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所,北京 100193;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所/海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 萬(wàn)寧 570311)

從白木香樹(shù)中分離了2株色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)菌株B1和B2；人工接種試驗(yàn)證實(shí)它們能促進(jìn)沉香的形成。本研究結(jié)果表明：色二孢菌株B1和B2菌絲生長(zhǎng)的最適溫度均為30 ℃；B1的最適培養(yǎng)基是PDA,B2的最適培養(yǎng)基是CA；B1、B2菌絲生長(zhǎng)的最適pH值分別是7和8，最適碳源均為可溶性淀粉，最適氮源均為硝酸鈉。

白木香;色二孢;結(jié)香;生物學(xué)特性

白木香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg是國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物,是珍貴國(guó)產(chǎn)藥材沉香的唯一植物資源。沉香是樹(shù)體受傷后分泌出來(lái)的油脂成分和木質(zhì)成分的固態(tài)凝聚物,具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效[1]。健康的白木香很難形成沉香,只有受到傷害(如物理、化學(xué)、微生物、蟲(chóng)等的傷害)后才能形成沉香。目前白木香的物理結(jié)香有打孔、獲烙、砍傷等方法,但結(jié)香時(shí)間長(zhǎng),產(chǎn)量低。目前主要是以化學(xué)方法結(jié)香為主。真菌也被證實(shí)能引起白木香結(jié)香,如黃綠墨耳真菌[2]、鐮刀菌(Fusariumsp.)[3-5]、蒂腐色二孢(Botryosphaeriarhodina)、紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)、里氏木霉(Trichodermareesei)、康氏木霉(Trichodermakoningii)[6]、擬盤多毛孢(Pestalotiopsisvirgatula)[7]、裂褶菌(Schizophyllumsp.)[8]、色二孢菌(Diplodiasp.)、可球二孢菌(Botryodiplodiantheobromae)等,但現(xiàn)今被真正用于結(jié)香的真菌還很少,可能是因?yàn)閷?duì)這些真菌的生物學(xué)特性并未真正了解。為了更好地將真菌菌株應(yīng)用于結(jié)香技術(shù),有必要對(duì)它們的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2株促進(jìn)沉香形成的色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)菌株B1和B2從白木香中分離純化獲得,保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)色二孢菌絲生長(zhǎng)的影響 選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)、察氏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek)和胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA)共5種培養(yǎng)基；接種直徑為5 mm的色二孢菌塊至含不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心,在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng),在培養(yǎng)24、36和48 h后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每處理3次重復(fù)。

1.2.2 不同溫度對(duì)色二孢菌絲生長(zhǎng)的影響 取5 mm的菌塊置于PDA平板中心,然后分別放在15、20、25、28、30、35、40 ℃下恒溫培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、36和48 h后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每處理3次重復(fù)。

1.2.3 不同pH值對(duì)色二孢菌絲生長(zhǎng)的影響 用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA 培養(yǎng)基,分別制成pH值為5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基,滅菌后再重新調(diào)整pH值。將5 mm菌塊置于不同pH值的PDA平板中心上,在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng),在培養(yǎng)24、36和48 h后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每處理3次重復(fù)。

1.2.4 不同碳源對(duì)色二孢菌絲生長(zhǎng)的影響 采用察氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別用甘露醇、D-山梨醇、乳糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖等不同的碳源等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖，制成平板。將5 mm菌塊置于平板中央,在30 ℃下培養(yǎng)24、36和48 h后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每處理3次重復(fù)。

1.2.5 不同氮源對(duì)色二孢菌絲生長(zhǎng)的影響 采用察氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別用牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨等不同的氮源等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉，制成平板。將5 mm菌塊置于平板中央,在30 ℃下培養(yǎng)24、36和48 h后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)色二孢菌株B1和B2菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出：色二孢(L.theobromae)菌株B1在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA上生長(zhǎng)速度最快,2 d生長(zhǎng)速度達(dá)114.75 mm；而在玉米粉瓊脂培養(yǎng)基CMV上生長(zhǎng)最慢。由圖2可見(jiàn)：色二孢菌株B2在胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基CA上生長(zhǎng)速度最快,2 d生長(zhǎng)速度達(dá)44.00 mm；其次是PDA培養(yǎng)基,2 d生長(zhǎng)速度為42.72 mm。 所以B1和B2最適的培養(yǎng)基分別是PDA和CA。

2.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)色二孢菌株B1和B2菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖3～圖4可以看出：色二孢菌株B1和B2在15～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),適宜溫度范圍為28～30 ℃,最適溫度為30 ℃；而在40 ℃下菌絲基本上停止生長(zhǎng)。

圖1 B1菌絲在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

圖2 B2菌絲在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

圖3 B1菌絲在不同溫度下的生長(zhǎng)結(jié)果

圖4 B2菌絲在不同溫度下的生長(zhǎng)結(jié)果

2.3 不同 pH值對(duì)色二孢菌株B1和B2菌絲生長(zhǎng)的影響

色二孢菌株B1的菌絲在pH 5～11范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),適宜的pH值范圍為6～8,最適pH值為7(圖5)。色二孢菌株B2菌絲生長(zhǎng)的適宜pH值為 6～8,最適pH值為8(圖6)。

圖5 B1菌絲在不同pH值下的生長(zhǎng)結(jié)果

圖6 B2菌絲在不同pH值下的生長(zhǎng)結(jié)果

2.4 不同碳源對(duì)色二孢菌株B1和B2菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖7～圖8可見(jiàn)：不同碳源對(duì)色二孢菌株B1菌絲生長(zhǎng)的影響不大,適宜碳源為可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖，最適碳源是可溶性淀粉；B2菌絲生長(zhǎng)的適宜碳源是可溶性淀粉和蔗糖，最適碳源是可溶性淀粉。

圖7 B1菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

2.5 不同氮源對(duì)色二孢菌株B1和B2菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖9～圖10可知，不同氮源對(duì)色二孢菌株B1和B2的菌絲生長(zhǎng)均有一定的影響,最適氮源均為硝酸鈉。

3 討論

我們從白木香樹(shù)分離了2株色二孢B1和B2,并證實(shí)它們能促進(jìn)沉香的形成[9]。張爭(zhēng)等[10]報(bào)道白木香枝枯菌的病原菌色二孢能促進(jìn)沉香的形成；韓曉敏等[11]發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢菌可以誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生3種沉香倍半萜。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)記載,色二孢能為害農(nóng)作物、林木、藥用植物等,常引起桑樹(shù)根腐病[12]、毛葡萄穗軸褐腐病[13]、沙田柚果腐病[14]、花生莖腐病[15]、葡萄潰瘍病[16]、黑木耳“黑皮病”[17]、龍眼焦腐病[18]、高良姜葉枯病[19]、松枯梢病[20]、黃山欒樹(shù)裂皮病[21]等病害,給生產(chǎn)帶來(lái)很大的損失；但色二孢的生物學(xué)特性未見(jiàn)報(bào)道。

圖8 B2菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

圖9 B1菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

圖10 B2菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

本文對(duì)色二孢生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明,色二孢菌株B1和B2在不同的培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng),只是B1的最適培養(yǎng)基是PDA,B2的最適培養(yǎng)基是CA。色二孢B1和B2在溫度15～35 ℃下都能生長(zhǎng),高于40 ℃不利于生長(zhǎng),但30 ℃是菌絲生長(zhǎng)的最適溫度，所以野外溫度高于40 ℃不利于結(jié)香。色二孢B1和B2對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分和酸堿度的要求不是很高，均能生長(zhǎng),說(shuō)明這2個(gè)菌株的生長(zhǎng)能力很強(qiáng)。

本研究明確了色二孢2個(gè)菌株的生物學(xué)特性,可為優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件和利用真菌促進(jìn)沉香的形成提供技術(shù)支撐。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Study on Biological Characteristics of 2 Strains ofLasiodiplodiatheobromaePromoting Agarwood Formation

CHEN Xu-yu1,2, LIU Yang-yang1,2, LIU Pei-wei2, PENG De-gan2, WEI Jian-he1,2*

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Chinese Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Hainan Branch, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Chinese Peking Union Medical College / Hainan Provincial Key Laboratory for Conservation and Development of Southern Medicine Resources, Wanning 570311, China)

Two strains (B1 and B2) ofLasiodiplodiatheobromaewere isolated fromAquilariasinensis. The artificial infection experiment proved that these two strains could promote the formation of agarwood. The results of this study on the biological characteristics ofL.theobromaeindicated that: the optimum temperature for the mycelial growth of both B1 and B2 was 30 ℃; the optimum culture medium for B1 and B2 was PDA and CA, respectively; the optimum pH-value for the mycelial growth of B1 and B2 was 7 and 8, separately; for both B1 and B2, the best carbon source was soluble starch, and the best nitrogen source was sodium nitrate.

Aquilariasinensis;Lasiodiplodiatheobromae; Agarwood formation; Biological characteristics

2016-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81303312);海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)及示范推廣專項(xiàng)(ZDXM2015059);海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目 (ZDKJ2016004);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)。

陳旭玉(1981─),女,海南臨高人,副研究員,碩士,主要從事白木香微生物結(jié)香和南藥植物保護(hù)研究。*通訊作者：魏建和。

Q939.99

A

1001-8581(2017)03-0095-04