金銀花肌動(dòng)蛋白基因LjActin的克隆及在花發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析

亓希武,徐道華,于 盱,房海靈,李維林,梁呈元

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院 植物研究所,江蘇 南京 210014)

金銀花肌動(dòng)蛋白基因LjActin的克隆及在花發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析

亓希武,徐道華,于 盱,房海靈,李維林,梁呈元

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院 植物研究所,江蘇 南京 210014)

本研究在藥用植物金銀花中克隆得到1條肌動(dòng)蛋白(Actin)基因序列,命名為L(zhǎng)jActin(GenBank登錄號(hào):KY114518)。序列分析表明其全長(zhǎng)1536 bp,其中編碼框1134 bp,編碼377個(gè)氨基酸殘基,理論分子量為41.7 kDa,理論等電點(diǎn)為5.31。序列比對(duì)結(jié)果表明金銀花的Actin和其它植物的Actin在序列上高度保守。進(jìn)化分析結(jié)果表明金銀花的Actin與擬南芥的AtACT7和水稻的OsACT2聚為一支。RT-PCR結(jié)果顯示LjActin在金銀花5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花中表達(dá)穩(wěn)定。

金銀花;肌動(dòng)蛋白；基因;克隆;表達(dá)

肌動(dòng)蛋白(Actin)最早在脊椎動(dòng)物骨骼肌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),是真核生物中普遍存在的一種蛋白質(zhì),具有重要的生物學(xué)功能。閻隆飛等首次證明了肌動(dòng)蛋白在高等植物中的存在[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,許多植物的肌動(dòng)蛋白基因相繼被克隆,氨基酸序列的比對(duì)分析表明植物的肌動(dòng)蛋白在長(zhǎng)度和序列上高度保守,暗示其在植物生命過(guò)程中具有重要的功能[2]。已有研究表明,植物肌動(dòng)蛋白參與植物細(xì)胞形狀控制、細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、頂端生長(zhǎng)、有絲分裂、重力感應(yīng)等諸多生命過(guò)程[3-6]。此外,作為一個(gè)管家基因,肌動(dòng)蛋白在不同的組織和發(fā)育時(shí)期中表達(dá)穩(wěn)定,因而常被用作基因表達(dá)研究中的內(nèi)參基因[7]。

金銀花又稱忍冬(LonicerajaponicaThunb.),是忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物。金銀花是一種重要的藥用植物,臨床應(yīng)用非常廣泛,據(jù)統(tǒng)計(jì)有超過(guò)500種中藥制劑含有金銀花成分[8]。金銀花富含多種活性成分,如綠原酸[9]、木犀草苷[10]、黃酮[11]、揮發(fā)油[12]等。現(xiàn)代生化和醫(yī)學(xué)研究表明金銀花具有重要的生物學(xué)活性,包括抗氧化、抗炎癥、抗病毒、抗癌等[13]。長(zhǎng)期以來(lái),對(duì)金銀花的研究主要集中于活性成分的分離鑒定和活性分析。近年來(lái),其分子生物學(xué)研究也逐步開展,尤其是活性成分生物合成相關(guān)基因的研究[14-17]。但是,金銀花肌動(dòng)蛋白基因至今鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

供試金銀花品種為“四季樹型”,保存于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所種質(zhì)資源圃。根據(jù)花的發(fā)育程度將其分為5個(gè)時(shí)期,分別是:幼蕾期(綠色花蕾,長(zhǎng)度小于1.5 cm);綠蕾期(綠色花蕾,長(zhǎng)度為2～3 cm);白蕾期(白色花蕾,長(zhǎng)度為3.5～4.5 cm);銀花期(白色花,長(zhǎng)度為5.0 cm左右)和金花期(黃色花,長(zhǎng)度為5.0 cm左右)?；ú烧筮M(jìn)行液氮速凍,之后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒為通用植物總RNA提取試劑盒,購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自Promega公司。DNA聚合酶Ex-taq和pMD19-T simple載體購(gòu)自TaKaRa公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物合成和測(cè)序由南京思普金生物科技有限公司完成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 金銀花不同時(shí)期花的RNA提取及cDNA第1鏈的合成

將不同時(shí)期的金銀花材料置于研缽中,用液氮充分研磨至粉狀,參照通用植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取各樣品的RNA。在進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)后,取3 μg嚴(yán)格定量的總RNA,參照M-MLV使用說(shuō)明,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.3 金銀花Actin基因的克隆及序列特征分析

根據(jù)金銀花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中分析得到的候選Actin基因序列,使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物,上游引物為:5’-AACCCTCCATCTACCTCAT-3’,下游引物為:5’- GCCATAGTAAGTCCGCATC-3’。以金銀花不同時(shí)期花的混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為:10×PCR buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl24 μL、20 mmol/L dNTP 4 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、cDNA模板2 μL、Ex-taq 0.4 μL,用去離子水補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下用刀片切取含有目的條帶的膠條,使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0進(jìn)行DNA回收。將回收產(chǎn)物與pMD19-T simple載體進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,涂布含有氨芐抗性的LB平板中。將篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

將測(cè)序驗(yàn)證的基因序列進(jìn)行序列特征分析,其中編碼區(qū)預(yù)測(cè)和氨基酸翻譯用BioEdit完成;理論分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)在ExPASy(http://www.expasy.org/)網(wǎng)站上進(jìn)行;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)網(wǎng)站上進(jìn)行。

1.4 金銀花Actin基因的多重序列比對(duì)和進(jìn)化分析

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載其它植物的Actin的序列,與金銀花的Actin一起進(jìn)行多重序列比對(duì),比對(duì)使用ClustalX軟件進(jìn)行,使用GeneDoc軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行編輯。使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,建樹方法選擇臨近結(jié)合法(Neighbor-Joining, NJ),自舉檢驗(yàn)值設(shè)置為1000。

1.5 金銀花Actin基因在不同發(fā)育時(shí)期花中的表達(dá)分析

根據(jù)已克隆得到的金銀花Actin基因序列設(shè)計(jì)檢測(cè)其表達(dá)水平的特異性引物,上游引物為:5’- TGCCAATCTATGAAGGGTATG-3’,下游引物為:5’- AAGCACTTCCTGTGGACGAT-3’；以金銀花5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:10×PCR buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、20 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、cDNA模板1 μL、Ex-taq 0.2 μL,用去離子水補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花Actin基因的克隆及序列分析

根據(jù)金銀花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中分析得到的候選Actin基因序列設(shè)計(jì)引物,以不同發(fā)育時(shí)期的花的混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到1條大小約為1.5 kb的條帶(圖1)；克隆后進(jìn)行測(cè)序,驗(yàn)證其為所要克隆的目的基因,將其命名為L(zhǎng)jActin,并將序列提交GenBank(登錄號(hào):KY114518)。序列分析表明該基因全長(zhǎng)1536 bp,其中5’-UTR為183 bp,3’-UTR為219 bp,編碼框?yàn)?134 bp,編碼377個(gè)氨基酸殘基(圖2)。ExPASy在線預(yù)測(cè)表明該基因所編碼的蛋白質(zhì)的理論分子量為41.7 kDa,理論等電點(diǎn)為5.31。將該基因所編碼的氨基酸序列在SMART網(wǎng)站上進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，表明其具有典型的ACTIN結(jié)構(gòu)域。在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，顯示金銀花Actin與其它植物的Actin具有很高的序列相似性,如棗樹Actin-7(Ziziphusjujuba,100%)、可可Actin 7(Theobromacacao,100%)、黃瓜Actin-7(Cucumissativus,99%)、棉花Actin-7(Gossypiumraimondii,99%)、獼猴桃ACT1(Actinidiadeliciosa,99%)等。

2.2 金銀花Actin的多重序列比對(duì)和進(jìn)化分析

將金銀花的Actin序列與其它植物[包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatabacum)、玉米(Zeamays)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycinemax)、高粱(Sorghumbicolor)、胡蘿卜(Daucuscarota)和豌豆(Pisumsativum)]的Actin序列進(jìn)行多序列比對(duì),結(jié)果表明金銀花的Actin與其它植物的Actin在序列上高度保守(圖3)。將金銀花的Actin序列與雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻的Actin序列一起構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果表明金銀花的Actin與擬南芥的AtACT7和水稻的OsACT2聚為一支(圖4)。此外,單、雙子葉植物的Actin在進(jìn)化樹中相互交叉,表明被子植物的Actin基因家族起源于單、雙子葉植物分化之前的共同祖先。

圖1 金銀花Actin基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 金銀花Actin基因及其編碼的氨基酸序列

2.3 金銀花Actin基因在不同發(fā)育時(shí)期花中的表達(dá)分析

根據(jù)克隆得到的金銀花Actin基因序列設(shè)計(jì)引物,以5個(gè)發(fā)育時(shí)期的花或花蕾的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR,結(jié)果表明該基因在金銀花5個(gè)發(fā)育時(shí)期的花或花蕾中表達(dá)穩(wěn)定(圖5),因此可作為基因表達(dá)研究中的內(nèi)參基因。

3 討論

肌動(dòng)蛋白是真核生物中普遍存在的一類古老的蛋白質(zhì),參與許多重要的生命活動(dòng)。研究表明肌動(dòng)蛋白基因在核苷酸水平和氨基酸水平上都具有高度的保守性[2]。本研究從藥用植物金銀花中克隆得到1個(gè)肌動(dòng)蛋白基因,序列分析表明其全長(zhǎng)1536 bp,其中編碼框1134 bp,編碼377個(gè)氨基酸殘基,所編碼的蛋白質(zhì)的理論分子量為41.7 kDa,理論等電點(diǎn)為5.31。序列比對(duì)表明金銀花的Actin和其它植物的Actin在序列上高度保守。

高等真核生物的肌動(dòng)蛋白是由多基因家族所編碼的,高等植物中擬南芥中有10個(gè)肌動(dòng)蛋白基因[18],水稻中有4個(gè)[19],豌豆中至少有18個(gè)[20]。本研究將金銀花的Actin序列與雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻的Actin序列一起構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果表明金銀花的Actin與擬南芥的AtACT7和水稻的OsACT2聚為一支。研究表明擬南芥AtACT7基因?qū)χ参锛に?、光、損傷等有強(qiáng)烈反應(yīng)[21],并且在愈傷組織形成、發(fā)芽和根的生長(zhǎng)中都起到重要作用[22]。此外,進(jìn)化分析顯示單、雙子葉植物的Actin在進(jìn)化樹中相互交叉,表明被子植物的Actin基因家族起源于單、雙子葉植物分化之前的共同祖先[23]。

序列在SwissProt中的登錄號(hào)為:AtACT7(P53492)、OsACT1(Q10DV7)、NtActin(Q05214)、ZmACT1(P02582)、GhActin(O81221)、GmActin1(P02581)、SbActin1(P53504)、DcActin(P23343)、PsActin1(P30164)。

圖3 金銀花Actin與其它植物Actin的多序列比對(duì)結(jié)果

圖4 金銀花Actin與擬南芥、水稻Actin的進(jìn)化分析結(jié)果

1:幼蕾期;2:綠蕾期;3:白蕾期:4:銀花期;5:金花期。

內(nèi)參基因是從分子生物學(xué)上研究基因表達(dá)水平的重要參考,主要是選擇表達(dá)穩(wěn)定的管家基因。植物中常用的內(nèi)參基因一般有肌動(dòng)蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、微管蛋白基因(Tubulin)和18S rRNA等[24]。研究表明,不同的內(nèi)參基因只適用于一定的條件,并不存在所有情況下都穩(wěn)定表達(dá)的管家基因[25]。在本研究中,通過(guò)對(duì)金銀花不同發(fā)育時(shí)期的花的RNA嚴(yán)格定量,利用RT-PCR檢測(cè)了LjActin的表達(dá)水平,結(jié)果表明LjActin在5個(gè)發(fā)育時(shí)期的花中表達(dá)穩(wěn)定,可以作為金銀花的花發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Cloning of Actin GeneLjActininLonicerajaponicaand Its Expression at Different Stages of Flower Development

QI Xi-wu, XU Dao-hua, YU Xu, FANG Hai-ling, LI Wei-lin, LIANG Cheng-yuan*

(Institute of Botany, Jiangsu Provincial and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China)

In this study, we cloned an actin geneLjActin(GenBank accession number: KY114518) from medicinal plantLonicerajaponicaThunb. The results of sequence analysis indicated that: the total length ofLjActinwas 1536 bp, and its ORF was 1134 bp encoding 377 amino acids; this actin gene possessed the theoretical molecular weight of 41.7 kDa and the theoretical isoelectric point of 5.31. Multiple sequence alignment showed that the sequence ofLjActininL.japonicawas highly conserved as that in other plants. Phylogenetic analysis showed that theLjActininL.japonicawas clustered into a clade with the AtACT7 inArabidopsisthalianaand the OsACT2 in rice (Oryzasativa). The result of RT-PCR indicated thatLjActincould steadily express in the flowers ofL.japonicaat 5 different developmental stages.

Lonicerajaponica; Actin; Gene; Cloning; Expression

2016-11-14

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31500249);江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目(2015-NY-032);江蘇省中國(guó)科學(xué)院植 物研究所青年基金項(xiàng)目(SQ201401)。

亓希武(1986─),男,山東臨沂人,助理研究員,博士,從事藥用植物資源研究。

梁呈元。

Q943.2

A

1001-8581(2017)03-0090-05