蓮霧RNA提取方法的比較

沈 雁,劉 歡,馬華青,陳 萍

(熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南大學(xué) 園藝園林學(xué)院,海南 ?？?570228)

蓮霧RNA提取方法的比較

沈 雁,劉 歡,馬華青,陳 萍*

(熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南大學(xué) 園藝園林學(xué)院,海南 海口 570228)

用蓮霧成熟的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料,選用方法1(試劑盒法)、方法2(改良的CTAB法1)、方法3(改良的SDS法1)等5種不同的方法提取蓮霧果實(shí)的RNA，并且比較了它們的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：方法4(改良的CTAB法2)對(duì)蓮霧果實(shí)RNA的提取效果最好，不僅能夠有效地抑制多糖、多酚以及次生代謝產(chǎn)物對(duì)蓮霧果實(shí)RNA提取的影響，而且所提取的RNA完整性較好且純度較高。

蓮霧；果實(shí)；RNA；提取方法；SDS；CTAB

蓮霧,別名金山蒲桃、洋蒲桃、水蒲桃等,是桃金娘科蒲桃屬熱帶常綠喬木果樹(shù)。原產(chǎn)地為馬來(lái)半島及安達(dá)曼群島。目前,我國(guó)臺(tái)灣、廣東、福建、海南、廣西、云南和四川均有栽培,其中臺(tái)灣栽培最多[1]。蓮霧的用途很廣,其樹(shù)姿優(yōu)美,花期長(zhǎng),是園林綠化、觀光和盆景栽培的優(yōu)良樹(shù)種；而且它的果實(shí)富含多種營(yíng)養(yǎng)成分,有“水果皇帝”之稱。其具有經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)、食用、藥用、保健、觀賞等多種價(jià)值[2]。

國(guó)內(nèi)外在蓮霧種質(zhì)資源遺傳多樣性、異地引種育種、生物學(xué)特性、生理生化特性、營(yíng)養(yǎng)成分及代謝機(jī)制、栽培管理技術(shù)、遺傳特性、病蟲害防治、貯藏保鮮及采后生理代謝等方面的研究均有報(bào)道,目前沒(méi)有對(duì)蓮霧的起源、演變、品種選育、抗病機(jī)理等方面的研究報(bào)道[1]。從蓮霧果實(shí)中提取RNA是進(jìn)行蓮霧分子生物學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)之一,要進(jìn)行Northern(印跡)雜交分析、純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫(kù)、RT- PCR及差示分析等分子生物學(xué)研究[3],都需要高質(zhì)量的RNA。因此,從蓮霧果實(shí)中提取純度高、完整性好的RNA是順利進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵所在。但是蓮霧果實(shí)富含多糖、多酚、次生代謝產(chǎn)物等物質(zhì)[2],而且果實(shí)中水分含量極高,這導(dǎo)致提取RNA難度增大,產(chǎn)率低。針對(duì)蓮霧的這些特點(diǎn),本文比較了改進(jìn)的CTAB法、SDS法、RNA提取試劑盒等5種不同的提取方法。在改良CTAB法的基礎(chǔ)上,針對(duì)蓮霧果實(shí)中富含多酚和多糖的特點(diǎn)加以改進(jìn),獲得了純度和完整性較理想的RNA，可用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建、DDRT-PCR(差示分析)和Northern Blot等研究[4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RNA容易降解，所以提取難度較大,要求所用材料一定要新鮮。本試驗(yàn)所用的是蓮霧的果實(shí),采自海南大學(xué)儋州校區(qū)東門的紅寶石蓮霧果樹(shù)上,果實(shí)較為新鮮,采回后一直放于冰箱中保鮮。在做實(shí)驗(yàn)時(shí),采用-180 ℃液氮將供試蓮霧果實(shí)研磨成粉末狀,現(xiàn)磨現(xiàn)用,能夠滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要用具

剪刀、移液管、蒸餾水桶、燒杯、量筒、容量瓶、試劑瓶、2 mL Eppendorf管、藥匙、玻璃棒、離心管架、電泳槽,1～10、1～40、20～200、40～200、100～1000 μL移液槍及其配套移液槍吸嘴,中號(hào)研缽及研棒、液氮罐、一次性PE手套、一次性口罩、稱量紙等。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器

TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);核酸蛋白分析儀(美國(guó)GE, NanoVue); HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司);格蘭仕WD750型微波爐(佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司);電泳儀(Germany)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)DBT-2000W)；101-3型干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠)；HVE-50型立式全自動(dòng)高壓滅菌鍋(Japan)；純水機(jī)(WP-UP-|||-20，四川，沃特爾)；電子天平(PB 303-N，梅特勒-托利多儀器有限公司)；冰箱(Hair BCD-241WE)；攪拌機(jī)(HJ-6多頭磁力加熱攪拌器)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑

EDTA、Tris-HCl、Tris堿、PVP、β-巰基乙醇、酚、氯仿、異戊醇、75%酒精、氯仿、無(wú)水乙醇、2% CTAB、NaCl、SDS、NaAc、Tris-苯酚、氯仿、冰乙酸、異丙醇、濃HCl、液氮、KAc、雙蒸水、天根RNAPLANT試劑盒、70%無(wú)水乙醇。

1.5 實(shí)驗(yàn)試劑的配制

1.5.1 常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑在室溫下的配制 1 mol/L的Tris-HCl (pH 8.0):稱取12.11 g Tris堿，加80 mL水溶解,用濃HCl調(diào)節(jié)pH至8.0,加水定容至100 mL,高壓滅菌。1 mol/L的Tris-HCl (pH 7.4):稱取12.11 g Tris堿,加80 mL水溶解,用濃HCl調(diào)節(jié)pH至8.0,加水定容至100 mL,高壓滅菌。0.5 mol/L EDTA (pH 8.0):稱取18.61 g二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2·2H2O),加80 mL水溶解,用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0,定容至100 mL,高壓滅菌。10%SDS:稱取10 g SDS,加80 mL水溶解,再加水定容至100 mL。10%CTAB:稱取10 g CTAB,加80 mL水溶解,再加水定容至100 mL。氯仿-異戊醇(24∶1):按體積比例量取需要的氯仿和異戊醇,相互混合拌勻。酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1):取一定體積的氯仿-異戊醇混合溶液,再和同體積的酚混合。75%乙醇:量取75 mL無(wú)水乙醇,與20 mL水混合,再加水定容至100 mL。3 mol/L KAc (pH 4.8):稱取29.442 g KAc晶體,加入80 mL雙蒸水,再用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4.8,定容至100 mL,高壓滅菌,4 ℃保存。NaCl (5 mol/L):稱取NaCl 29.22 g，加90 mL雙蒸水,加熱80 ℃溶解,冷卻,再用雙蒸水定容至100 mL,高壓滅菌20 min。NaAc (3 mol/L， pH 5.2):稱取NaAc晶體40.824 g，加60 mL雙蒸水,用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為5.2,加雙蒸水定容至100 mL,高壓滅菌20 min,4 ℃保存。NaAc (1 mol/L， pH 5.5):稱取NaAc晶體13.608 g，加60 mL雙蒸水,用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為5.5,加雙蒸水定容至100 mL,高壓滅菌20 min,4 ℃保存。10%PVP-40:稱取10 g PVP，加80 mL水溶解,再加水定容至100 mL。

1.5.2 提取緩沖液的配制

1.5.2.1 方法2(改良的CTAB法1)提取緩沖液 其主要試劑成分為:2%CTAB、0.02 mol/L EDTA (pH 8.0)、1.4 mol/L NaCl、2%PVP、0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)、2%β-巰基乙醇。該提取液的配制：10%的CTAB 5 mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.O) 1 mL、5 mol/L NaCl 7 mL、10%PVP 5 mL、1 mol/L Tri-HCl (pH 8.0) 2.5 mL，加雙蒸水定容到25 mL；β-巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加。

1.5.2.2 方法3(改良的SDS法1)提取緩沖液 其主要試劑成分為:0.1 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)、2%SDS、1.4 mol/L NaCl、2%PVP、0.05 mol/L EDTA (pH 8.0)、2%β-巰基乙醇。該提取液的配制:10%SDS 5 mL、0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2.5 mL、1 mol/L Tris-HCl (pH 7.4) 2.5 mL、5 mol/L NaCl 7 mL、10%PVP 5 mL，加雙蒸水定容至25 mL；β-巰基乙醇為用前加入。

1.5.2.3 方法4(改良的CTAB法2)的提取緩沖液 稱取CTAB 0.5 g、NaCl 2.0445 g,量取0.5 mol/L EDTA 1 mL、1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2.5 mL,先用10 mL雙蒸水溶解,再定容至25 mL；β-巰基乙醇為用前加入。

1.5.2.4 方法5(改良的SDS法2)提取緩沖液 取用1.25 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.7 mL 5 mol/L NaCl、0.5 mL 0.5 mol/L EDTA、5 mL 10%SDS、12.5 mL 10%PVP,加雙蒸水定容至25 mL；β-巰基乙醇為用前加入。

1.6 RNA的提取方法

1.6.1 方法1(改良的天根RNAPLANT試劑盒提取法) 其基本步驟如下:(1)取不多于0.1 g的新鮮的蓮霧果實(shí)粉末,移入無(wú)RNase的2 mL Eppendorf管中,加700 μL提取試劑(4 ℃),再加入20 μL 10%SDS、30 μL 10%PVP,震蕩至徹底混勻;(2)室溫平放離心管5 min;(3)在4 ℃以12000 r/min離心10 min。將上清轉(zhuǎn)入無(wú)RNase離心管;(4)加入150 μL 5 mol/L NaCl,溫和混勻;(5)加入450 μL氯仿/異戊醇(24∶1),上下顛倒混勻;(6)在4 ℃下以12000 r/min離心10 min。取上層水相轉(zhuǎn)入新的無(wú)RNase離心管;(7)加與所得水相等體積的異丙醇,混勻,室溫放置30 min;(8)4 ℃,12000 r/min,離心25 min。棄掉上清。加1 mL 70%無(wú)水乙醇;(9)4 ℃,5000 r/min,離心3 min,倒出液體,不要倒出沉淀。將剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出,室溫晾干2～3 min;(10)加15 μL雙蒸水,反復(fù)吹打、混勻,充分溶解RNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 方法2(改良的CTAB法1) 基于葉開(kāi)玉[5]的方法并有所改動(dòng)。操作步驟:(1)將800 μL 2% CTAB抽提液加入2 mL離心管中,65 ℃水浴預(yù)熱30 min;(2)稱取0.1 g樣品,加入液氮研磨至粉末狀,迅速轉(zhuǎn)入2 mL離心管,加入10 μL β-巰基乙醇,充分混勻,65 ℃水浴1.5 h;(3)4 ℃下以12000 g離心10 min;(4)取上清液于新的離心管中,加入等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，上下顛倒混勻,冰上放置15 min,在4 ℃下以12000 g離心5 min;(5)取上清液于新的離心管中,加入1/20體積5 mol/L KAc (pH 5. 0)、1/10體積的無(wú)水乙醇、等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕混勻,冰上放置15 min,在4 ℃下以12000 g離心10 min;(6)重復(fù)步驟(5),直到上下相之間無(wú)明顯界面為止;(7)取上清液，分裝入新的2 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫放置30 min;(8)以10000 r/min離心25 min,去上清,用70%乙醇洗1次;(9)棄上清液,風(fēng)干,加入15 μL雙蒸水溶解,放入冰箱內(nèi)備用。

1.6.3 方法3(改良的SDS法1) 基于葉開(kāi)玉[5]的方法并有所改動(dòng)。操作步驟:(1)取0.1 g蓮霧組織材料,于液氮中充分研磨成粉末狀,迅速移到2 mL離心管中,加入800 μL提取液,再加入10 μL β-巰基乙醇,充分混勻。冰上靜置5 min,4 ℃下以12000 r/min離心10 min;(2)取上清液于新的離心管中,加入等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，上下顛倒混勻,在4 ℃下以12000 r/min離心10 min;(3)取上清液于新的離心管中,加入1/20體積5 mol/L KAc (pH 5. 0)、1/10體積的無(wú)水乙醇、等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕混勻,冰上放置10 min,在4 ℃下以12000 r/min離心10 min;(4)取上清液于新的離心管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)抽提1次;(5)重復(fù)步驟(4),直到上下相之間無(wú)明顯界面為止;(6)取上清液，分裝入新的2 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫放置30 min;(7)以10000 r/min離心25 min,去上清,用70%乙醇洗1次;(8)棄上清液,風(fēng)干,加入15 μL雙蒸水溶解,放入冰箱內(nèi)備用。

1.6.4 方法4(改良的CTAB法2) 根據(jù)周鵬的CTAB法[6]并有所改動(dòng)?；静襟E如下:(1)取裝有0.1 g蓮霧果實(shí)粉末的2 mL離心管2個(gè),分別加入800 μL CTAB提取緩沖液、36 μL 10%PVP、10 μL β-巰基乙醇,輕輕上下晃動(dòng),充分混合;(2)65 ℃水浴30 min;(3)放入離心機(jī)內(nèi)以10000 r/min離心10 min。取上清,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液,在4 ℃下以12000 r/min離心10 min;(4)取上清轉(zhuǎn)入新的離心管,加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，以10000 r/min離心10 min;(5)重復(fù)步驟(4)，直到無(wú)明顯分層;(6)取上清液，加入等體積的異丙醇,室溫放置30 min;(7)以10000 r/min離心25 min,去上清,用70%乙醇洗1次;(8)棄上清液,風(fēng)干,加入15 μL雙蒸水溶解,放入冰箱內(nèi)備用。

1.6.5 方法5(改良的SDS法2) 根據(jù)張今今[4]的SDS法并有改動(dòng)?；静襟E如下:(1)取裝有0.1 g蓮霧果實(shí)粉末的2 mL離心管2個(gè),分別加入800 μL的提取緩沖液,再加入23 μL 10%SDS、34 μL 10%PVP、10 μL β-巰基乙醇，輕輕充分搖勻;(2)65 ℃水浴10 min;(3)取上清,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液,在4 ℃下以12000 r/min離心15 min;(4)取上清轉(zhuǎn)入新的離心管,加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，以10000 r/min離心15 min;(5)取上清,加入等體積的異丙醇,室溫放置30 min;(6)在4 ℃下以10000 r/min離心20 min;(7)棄上清液,用70%乙醇洗1次；(8)棄上清液,自然風(fēng)干,用15 μL雙蒸水溶解,放入冰箱備用。

1.7 RNA純度和完整性的檢測(cè)方法

1.7.1 RNA完整性的檢測(cè) 采用1%的瓊脂糖凝膠電泳[7]檢測(cè)蓮霧果實(shí)RNA的完整性。具體步驟如下：將制膠用具用70%乙醇沖洗1遍,晾干備用;稱取1.0 g瓊脂糖,置入干凈的200 mL錐形瓶中,加入100 mL 0.5×TBE電泳緩沖溶液,微波爐內(nèi)加熱1 min使瓊脂糖徹底溶化均勻；待膠冷卻至60～70 ℃時(shí),向其中加入10 μL核酸染料，混合均勻,小心倒入膠膜內(nèi),凝成1 cm左右的厚度,在室溫下放置30 min；待凝膠形成后，將其置于0.5×TBE電泳緩沖液中,將抽提的RNA分別取3 μL與1 μL 6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合均勻后用移液槍點(diǎn)樣；在電泳槽內(nèi)加入0.5×TBE緩沖液,于200 V/mL的電壓下電泳；電泳結(jié)束后,在紫外燈下檢查結(jié)果。

從完整的RNA圖譜上可以清晰看到28sRNA、18sRNA和5sRNA三條帶，并且28sRNA的亮度大概是18sRNA亮度的兩倍,表明所提取的RNA樣品比較完整,沒(méi)有多少降解[8-9]。如果兩條帶的亮度反過(guò)來(lái),則說(shuō)明28sRNA已經(jīng)降解成18sRNA的大小；如果沒(méi)有清晰的帶狀,則說(shuō)明樣品已經(jīng)發(fā)生了嚴(yán)重的降解；如果在點(diǎn)樣槽內(nèi)或其附近有熒光物質(zhì),則說(shuō)明RNA樣品已經(jīng)被DNA所污染[9]。

1.7.2 RNA純度的檢測(cè)方法 可以用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA純度的檢測(cè),以評(píng)價(jià)各種方法提取的RNA的質(zhì)量。即可用OD260/OD280比值來(lái)鑒定RNA純度,純的RNA溶液的OD260/OD280值應(yīng)該在1.7～2.0之間[9]。如果RNA的OD260/OD280<1.8，則說(shuō)明有蛋白質(zhì)、酚的污染；如果OD260/OD280大于2.0，則說(shuō)明RNA有所降解[10]。對(duì)于RNA純制品,其 OD260/OD280≈2.0。OD260/OD280<2.0可能是蛋白污染所致[10-11],可以通過(guò)適當(dāng)增加PVP的量[12]以及增加酚的抽提次數(shù)[13]來(lái)改善。

2 結(jié)果與分析

電泳圖譜結(jié)果(圖1)顯示,所選用的5種方法都能夠從蓮霧的果實(shí)中提取出RNA。

泳道1和2:方法1提取的RNA;泳道3和4:方法2提取的RNA;泳道6和7:

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:用方法4提取的RNA完整性好、純度高、RNA產(chǎn)率高,OD260/OD280接近2.0，滿足實(shí)驗(yàn)的要求。從凝膠圖譜(圖1)上可以清晰地看到用方法4所提取RNA的28sRNA和18sRNA兩條明亮的帶,且28sRNA的亮度是18sRNA亮度的2倍；同時(shí)還可以看到5sRNA帶,說(shuō)明所提取的RNA完整性好,沒(méi)有發(fā)生降解[14]。由表1可知,用方法4提取的RNA的OD260/OD280接近2.0,濃度為384.4 μg/mL，說(shuō)明所提取的RNA純度較高。從實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間來(lái)看,方法4所用時(shí)間最短,實(shí)驗(yàn)操作更為簡(jiǎn)便。方法1即天根試劑盒法雖然也能提取出RNA,但是28sRNA和18sRNA兩條帶亮度相近且兩條帶不明顯；通過(guò)紫外分光光度法進(jìn)行RNA純度檢測(cè),其OD260/OD280為2.289，大于2.0，說(shuō)明RNA降解嚴(yán)重。用方法2提取的18sRNA和28sRNA兩條帶明顯,但是亮度相近[15],其OD260/OD280值大于2.0，說(shuō)明RNA發(fā)生了降解。方法2實(shí)驗(yàn)耗時(shí)4.9 h之久,步驟繁多。從圖1可以明顯看到方法3所提取的18sRNA和28sRNA亮度明顯,RNA的完整性較好,但是其OD260/OD280值為1.554，小于1.80,說(shuō)明有雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酚等)未去除，純度較差[16]。方法5所提取的28sRNA和18sRNA兩條帶亮度都很明顯,但是這兩條帶亮度相近,說(shuō)明RNA已經(jīng)發(fā)生了降解；且兩條帶的帶型不整齊,呈向上凸起拖尾狀,說(shuō)明其中有雜質(zhì)；且點(diǎn)樣孔中有熒光物質(zhì)，說(shuō)明RNA已經(jīng)被DNA污染。綜上所述,方法4提取蓮霧果實(shí)RNA的效果最顯著,耗時(shí)短,所得RNA純度較高且比較完整，可以用于后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

表1 5種不同方法提取的蓮霧果實(shí)總RNA 純度的比較

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用了5種不同的方法,每種方法都有各自的特點(diǎn)。方法4實(shí)用、經(jīng)濟(jì),步驟少，耗時(shí)短,比一般的試劑盒要便宜得多,所得RNA產(chǎn)率及純度也很高,對(duì)蓮霧果實(shí)RNA的提取效果明顯,是提取蓮霧果實(shí)RNA的最佳方法。天根試劑盒法雖然簡(jiǎn)便,但是價(jià)格昂貴且有毒,對(duì)蓮霧果實(shí)RNA的提取效果不明顯,產(chǎn)量低。而其他3種方法都是常用的RNA提取方法,對(duì)蓮霧果實(shí)RNA的提取效果較差,所提取的RNA不能滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究的要求。

3.2 討論

蓮霧果實(shí)中富含多糖、酚類以及蛋白質(zhì)[2]。這些成分的存在都會(huì)對(duì)蓮霧RNA的提取造成一定的影響。在蓮霧果實(shí)成熟后,果實(shí)內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物增多,在研磨后果實(shí)內(nèi)的酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來(lái),酚類物質(zhì)很容易被氧化,氧化后會(huì)使勻漿液變?yōu)楹稚?并隨氧化程度的增加而加深,產(chǎn)生褐化效應(yīng)[3]。同時(shí)酚類能與RNA穩(wěn)定結(jié)合，從而影響RNA的提??；加之成熟后果實(shí)內(nèi)水分含量增加,樣品的產(chǎn)率降低,這些對(duì)蓮霧果實(shí)RNA的提取造成了很大的障礙。阻止酚類物質(zhì)與RNA結(jié)合[16],是蓮霧果實(shí)RNA提取的關(guān)鍵。PVP是一種高效的螯合劑[5],它與酚具有很強(qiáng)的結(jié)合能力,能抑制酚類氧化成醌類物質(zhì),有效地防止其與蓮霧果實(shí)RNA的結(jié)合[4,17]。同時(shí)β-巰基乙醇是一種強(qiáng)還原劑，能防止多酚氧化[4,19]。這兩者結(jié)合使用可以有效地控制酚類物質(zhì)與RNA結(jié)合。

本實(shí)驗(yàn)所用的方法4即改良的CTAB法2,其提取液中的CTAB能有效地和蛋白質(zhì)結(jié)合;β-巰基乙醇可以很好地防止褐變效應(yīng)[20];PVP能很好地抑制多酚氧化物的產(chǎn)生[21];高濃度的NaCl可以有效去除多糖的影響[21]。用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提2次可以有效除去殘留的DNA,防止DNA對(duì)RNA的污染[22],所以用這種方法提取的RNA完整性好,純度較高，能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。其他幾種方法提取RNA的效果較差,可能是因?yàn)樯忟F果實(shí)中富含多酚、多糖,可在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步改良,適當(dāng)多加PVP、CTAB可有效除去多酚、多糖的影響。

3.3 本實(shí)驗(yàn)的改良之處

將實(shí)驗(yàn)步驟中的用氯仿抽提改為用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，這樣分層更明顯、效果更好。將提取液、材料混勻水浴或冰浴后的直接抽提改為先離心再抽提，這樣抽提效果更好,去除DNA和蛋白質(zhì)的效果明顯。

在最后一步用70%的乙醇洗滌RNA沉淀時(shí),若吸取乙醇廢液困難,則可將樣品在4 ℃下以5000 r/min離心5 min；然后先用大移液槍,再用小移液槍,輕輕地把乙醇給吸取出來(lái),盡量把離心管內(nèi)的乙醇吸取干凈。這樣做的好處是干燥RNA沉淀時(shí)所用的時(shí)間短,可以降低RNA沉淀的損失以及污染,同時(shí)減少乙醇對(duì)后續(xù)操作的不利影響。

針對(duì)蓮霧果實(shí)中多糖、多酚的特性,適當(dāng)加大PVP和提取液的量,有效控制多糖、多酚及蛋白質(zhì)對(duì)提取效果的影響。

在抽提上清的過(guò)程中,動(dòng)作一定要輕,不能取到中間層,這關(guān)系到所提取RNA的質(zhì)量。

在加完異丙醇后,室溫靜置30 min,然后再離心；離心時(shí)間改為30 min左右,這樣沉淀效果更明顯。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Comparison of Several Methods for RNA Extraction from Wax Apple

SHEN Yan, LIU Huan, MA Hua-qing, CHEN Ping*

(Key Laboratory of Tropical Crop Germplasm Resources Protection and Genetic Improvement, Ministry of Education /College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University, Haikou 570228, China)

Five different methods, including method 1 (kit method), method 2 (improved CTAB method one) and method 3 (improved SDS method one), were used to extract RNA from the mature fruits of wax apple, and their extraction effects were compared. The experimental results showed that the method 4 (improved CTAB method two) had the best RNA-extracting effect, and it not only could effectively restrain the influences of polysaccharides, polyphenols and secondary metabolites on the RNA extraction from the fruits of wax apple, but also could obtain relatively complete and high-purity RNA.

Wax apple; Fruit; RNA; Extraction method; SDS; CTAB

2016-10-24

海南大學(xué)教育教學(xué)研究課題立項(xiàng)項(xiàng)目(hdjy1303);海南省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(教育教學(xué)改革研究) (HNJG2014-05);海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20153061)。

沈雁(1980─),女,助理研究員,碩士,從事熱帶果樹(shù)遺傳育種研究。*通訊作者:陳萍。

Q522

A

1001-8581(2017)03-0043-05