采油污水對斑馬魚SOD活性的影響

劉超群+吳楊+張薇+徐長君+寶力德

摘要：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系統(tǒng)中重要的一種酶。通過研究采油污水對生物體內(nèi)SOD活性的影響，可以判斷采油污水對生物體產(chǎn)生的毒害以及對環(huán)境產(chǎn)生的污染。本實驗采用斑馬魚為實驗材料，通過比色法和酶液提取技術(shù)，以不同濃度的采油污水脅迫培養(yǎng)斑馬魚，然后測定斑馬魚的頭部、肌肉和內(nèi)臟中SOD活性。實驗結(jié)果顯示，在采油污水脅迫培養(yǎng)的斑馬魚體內(nèi)的sOD活性的變化與污水的濃度也就是污染物脅迫強度有著一定的關(guān)系。其中以斑馬魚頭部的SOD活性變化最為顯著，在無采油污水脅迫的對照組中斑馬魚頭部的SOD活性為16.73U/mg，而在采油污水稀釋濃度為0.03的全致死組中培養(yǎng)的斑馬魚頭部的SOD活性為239.09U/mg。說明在沒有采油污水污染的情況下斑馬魚的SOD基礎(chǔ)活性比較低，在全致死濃度時其活性在斑馬魚頭部中上升了14倍左右，變化非常明顯。因此可以通過檢測斑馬魚頭部的SOD活性的變化去判斷斑馬魚是否受到水中污染物的毒害，進而判斷環(huán)境污染的程度。為環(huán)境檢測提供實驗依據(jù)，為采油污水的綜合化處理和環(huán)境污染的治理提供簡便的檢測手段。另外本研究發(fā)現(xiàn)在大慶地區(qū)采油污水中斑馬魚全致死濃度為該污水的33倍稀釋濃度，反映出目前大慶地區(qū)的水源被采油污水污染較嚴重。采油污水的排放質(zhì)量不達標，急需加強對采油污水的排放進行治理，改善大慶地區(qū)水源環(huán)境質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：采油污水；斑馬魚；SOD；環(huán)境污染

中圖分類號：X502 文獻標識碼：A 文章編號：2095—672Xf2016）06—0072—05

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2016.06.016

引言

現(xiàn)今，隨著人類對石油資源的不斷開采，產(chǎn)生了大量的采油污水，并對環(huán)境造成了嚴重的污染。大慶作為我國重要的石油基地，同樣面臨著此種情況。為了保證石油的產(chǎn)量，新采油技術(shù)不斷的開發(fā)，我國的石油污染狀況和性質(zhì)也發(fā)生了巨變。采油污水主要來自于石油生產(chǎn)過程中注采不平衡時所產(chǎn)生的污水，以及油氣集輸裝置檢修和沖洗管線時所產(chǎn)生的污水，該污水成分較復(fù)雜，其中的污染成分來源于采油生產(chǎn)的各個生產(chǎn)工序。采油污水中主要成分是：原油、地層中的鹽類、氣體、懸浮物、化學(xué)藥劑、微生物等。采油污水是否會對環(huán)境產(chǎn)生污染、對生態(tài)產(chǎn)生破壞，引起人們的廣泛關(guān)注。

斑馬魚（Danio rerio）是一種體型較小生活在熱帶的魚類。其身體近似紡錘形，成年斑馬魚體長約5cm，身體兩側(cè)有銀色斑紋，身體背部呈橄欖色，在身體的其他部位還有與其相同的斑紋。斑馬魚還具有繁殖快、數(shù)量多、便于獲取培養(yǎng)、易成活等優(yōu)點。水生生態(tài)環(huán)境的污染對斑馬魚產(chǎn)生的影響較明顯，故本實驗選用斑馬魚作為檢測采油污水對水質(zhì)污染程度的生物檢測的實驗魚。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系統(tǒng)中重要的一種酶，廣泛存在于動、植物的細胞中，其功能主要是清除細胞中的超氧陰離子游離基，將其轉(zhuǎn)化為H₂O₂和O₂，再經(jīng)過氧化氫酶的作用轉(zhuǎn)化成水和氧氣。通常情況下在動、植物體中處于動態(tài)平衡。超氧化物歧化酶不僅可清除、阻止因氧游離基對動、植物細胞造成的損害，還能夠及時修復(fù)被損害的細胞，并復(fù)原游離基對細胞造成的傷害。

當(dāng)生物體受到環(huán)境脅迫時，表現(xiàn)出SOD活性的變化，測定SOD活性的變化能推斷出生物體受到環(huán)境脅迫的程度。本實驗依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性的大小。在有氧化物質(zhì)的存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O₂，可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O₂，從而抑制甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。在采油污水中脅迫培養(yǎng)的斑馬魚的SOD活性的變化，反應(yīng)出了采油污水對水生生物的毒害，進而推斷出采油污水對水生生態(tài)環(huán)境的污染程度。

1材料與方法

1.1實驗材料

實驗材料為斑馬魚，購于大慶市讓胡路區(qū)博奧國際花鳥魚市場。在整個實驗過程中規(guī)定實驗用斑馬魚必須年齡相同、品種相同、大小相同、生理狀況相同，實驗用斑馬魚必須顏色純正、活動自如、無任何外傷、各項生理狀況等完全正常，任何有異常的魚都不可以作為實驗魚。

1.2采油污水的稀釋

采油污水取于油田水處理聯(lián)合站。

取實驗室專用清潔紗布，對采油污水進行過濾，去除其它物質(zhì)，將最后得到的采油污水濃度規(guī)定為單位1，向其中加去離子水稀釋，得到濃度分別為0.01，0.04，0.07，0.10，0.13，0.16六組濃度，并對每組污水設(shè)置一組平行實驗組。

1.2.1試劑的配制

（1）磷酸緩沖液（濃度為0.05 mol/L，pH值為7.8）：取濃度為0.1 mol/L，pH值為7.8的Na3P04緩沖液50mL，將其定容至100mL容量瓶中，充分混勻。并置于4℃冰箱中避光保存，以備后用。

（2）EDTA—核黃素混合液：取濃度為0.1mmol/L的EDTA試劑50mL將其與濃度為2mmol/L的核黃素試劑50mL混合，移入100mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）Met溶液：取0.3879g的Met粉末，用PBS緩沖液溶解并定容至100mL。

（4）NBT溶液：取0.1533g的NBT粉末，用100mL蒸餾水溶解并定容250mL。

（5）石英砂

1.3確定斑馬魚的致死、半致死濃度

用1000mL燒杯分別裝上述濃度的采油污水，每燒杯中培養(yǎng)8條斑馬魚。再取1000mL燒杯裝相同體積的去離子水分別培養(yǎng)8條斑馬魚，作為對照。把實驗組和對照組燒杯中的水溫調(diào)至最適溫度值，從實驗用斑馬魚中隨機抽取出斑馬魚，將其立刻投入燒杯中，每燒杯投入8條斑馬魚。設(shè)定一個實驗周期為96h，分別在在24h、48h、72h、96h的時間點觀察并記錄斑馬魚的存活數(shù)量，并計算出死亡率，最后根據(jù)此數(shù)據(jù)得出斑馬魚的致死濃度和半致死濃度的大致范圍。斑馬魚是否死亡可根據(jù)是否有活動跡象，比如是否呼吸、觸碰其身體后是否游動等，從而判斷斑馬魚是否存活。

根據(jù)致死濃度和半致死濃度范圍在將此濃度范圍分成六個濃度梯度，進一步縮小濃度范圍。最終確定斑馬魚的全致死濃度、半致死濃度和1/4致死濃度。

1.4酶液的粗提取

從實驗燒杯中取出斑馬魚，在預(yù)冷的條件下，將斑馬魚的頭部、肌肉和內(nèi)臟分別稱取0.4 g置于研缽中，加入預(yù)冷的2mL濃度為0.05mol/L的pH值為7.8的磷酸緩沖液，將其置于冰浴中研磨粉碎后，將其移入容量為10mL的離心管中，然后再用6mL濃度為0.05mol/L的pH值為7.8的磷酸緩沖液對其進行沖洗，并一同倒入同一離心管中。將離心管置于離心機中于10000rpm下離心15min。然后將離心管中的上清液取出，移入10mL容量瓶中定容，然后將其置于4℃下保存，用于測定超氧化物歧化酶的活性。

1.5 SOD活性單位的測定

在560nm波長下，測定不同酶液量的吸光值。通過計算得出抑制NBT光還原的相對百分率。以酶液用量為橫坐標，以抑制NBT光還原相對百分率為縱坐標，繪制出二者相關(guān)曲線。從而得出抑制NBT光還原相對百分率為50%時的超氧化物歧化酶的酶液量（μL），并以此規(guī)定為一個酶活力單位（U）。

1.6 NBT法測定SOD活性

將待測組設(shè)置成1/4致死濃度（稀釋濃度為0.015）、半致死濃度（稀釋濃度為0.019）和全致死濃度（稀釋濃度為0.03）。并用去離子水做兩組相同對照。取0.3mL蛋氨酸+0.3mL EDTA—核黃素混合溶液+0.3mL NBT+1.5mL磷酸緩沖液（0.05mol/L，pH值為7.8）+0.1mL酶液，混勻。將對照組中的一組試管外側(cè)套上略長于試管的避光錫紙。另一對照組置于正常實驗條件下曝光。待其靜止大約25分鐘之后，置于560nm下，測定其OD值。重復(fù)進行此實驗三次，實驗結(jié)果取平均值。

2結(jié)果與討論

2.1采油污水中斑馬魚致死濃度的確定

經(jīng)測定，斑馬魚的全致死濃度為0.03、半致死濃度為0.019、1/4致死濃度為0.015。

2.2 SOD活性

通過NBT法測定了在不同的采油污水濃度中培養(yǎng)的斑馬魚不同組織提取液中的SOD的酶活性，得出以下數(shù)據(jù)：

在圖1中分析了斑馬魚體內(nèi)各部位的SOD活性受不同濃度的采油污水脅迫的變化趨勢。

如表1和圖1所示，在相同的處理時間和環(huán)境條件下，隨著采油污水濃度的增加，斑馬魚體內(nèi)的SOD活性隨之增大。以斑馬魚頭部為例：對照組SOD活性為16.73U/mg、1/4致死組SOD活性為75.95U/mg、半致死組SOD活性為128.23U/mg、全致死組SOD活性為239.09U/mg。

實驗結(jié)果顯示，采油污水對斑馬魚頭部的SOD活性影響最明顯，而內(nèi)臟中的SOD活性次之，肌肉中的SOD活性最小。這種結(jié)果可能是由于鰓是斑馬魚的呼吸器官，通過吸取水中的氧氣進行呼吸，直接與體外環(huán)境進行物質(zhì)交換，且斑馬魚頭部組織的細胞較易受到污染物的損傷，導(dǎo)致SOD活性增加。而斑馬魚內(nèi)臟中的心臟與肝臟作為斑馬魚生存的主要代謝中心和解毒中心。心臟的功能是推動血液流動，向組織和器官輸送足夠的血液，以供應(yīng)氧和營養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、尿素和尿酸等），使細胞維持正常的代謝和功能。而肝臟對來自體內(nèi)和體外的非營養(yǎng)物質(zhì)如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，具有生物轉(zhuǎn)化作用。通過新陳代謝將它們徹底分解或以原形排出體外，從而起到解毒作用。在本實驗中表現(xiàn)為在采油污水濃度較低時，斑馬魚內(nèi)臟中的SOD活性變化較大。而隨著采油污水濃度的增加，進入內(nèi)臟中的大量污染物會反過來抑制斑馬魚內(nèi)臟的代謝活動，導(dǎo)致斑馬魚內(nèi)臟中的SOD活性的變化比在低濃度采油污水脅迫培養(yǎng)的斑馬魚內(nèi)臟中的SOD活性的變化小。采油污水中的大量污染物主要通過斑馬魚內(nèi)臟的代謝活動進入到斑馬魚的肌肉組織，所以，采油污水濃度的增加對肌肉中SOD活性的變化最小，且斑馬魚肌肉中的SOD活性的變化趨勢與內(nèi)臟中SOD活性的變化趨勢類似，都是在采油污水濃度較小時，SOD活性變化較大，而隨著采油污水濃度的增加，SOD活性變化較小。

采油污水的污染造成了斑馬魚體內(nèi)各種細胞的損傷，并產(chǎn)生了更多的超氧陰離子游離基，機體為了消除這些超氧陰離子游離基，產(chǎn)生了SOD活性升高的現(xiàn)象。

3結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，隨著采油污水的濃度不斷增加，斑馬魚體內(nèi)的SOD活性增大。本實驗通過對不同濃度采油污水脅迫培養(yǎng)后的斑馬魚體內(nèi)的SOD活性進行分析，可知在無采油污水脅迫的對照組中斑馬魚頭部的SOD活性為16.73U/mg，而在采油污水稀釋濃度為0.03的全致死組中培養(yǎng)的斑馬魚頭部的SOD活性為239.09U/mg。說明在沒有采油污水污染的情況下斑馬魚的SOD的基礎(chǔ)活性比較低，在全致死濃度時其活性在斑馬魚頭部中上升了14倍左右，變化非常明顯。因此可以通過檢測斑馬魚頭部的SOD活性的變化去判斷斑馬魚是否受到水中污染物的毒害，進而判斷環(huán)境污染的程度，為環(huán)境檢測提供實驗依據(jù)，為采油污水的綜合化處理和環(huán)境污染的治理提供簡便的檢測手段。另外本研究發(fā)現(xiàn)在大慶地區(qū)采油污水中斑馬魚全致死濃度為該污水的33倍稀釋濃度，反映出目前大慶地區(qū)的水源被采油污水污染較嚴重，采油污水的排放質(zhì)量不達標，急需加強對采油污水的排放進行治理，改善大慶地區(qū)水源環(huán)境質(zhì)量。