視黃醇結(jié)合蛋白4在妊娠期糖尿病孕婦中表達(dá)與胰島素抵抗關(guān)系

郭 永，付竹梅

（山東省濰坊市婦幼保健院，山東 濰坊 261011）

視黃醇結(jié)合蛋白4在妊娠期糖尿病孕婦中表達(dá)與胰島素抵抗關(guān)系

郭 永，付竹梅

（山東省濰坊市婦幼保健院，山東 濰坊 261011）

目的妊娠期糖尿病產(chǎn)婦機(jī)體中視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）的表達(dá)及其與胰島素抵抗之間的關(guān)系分析。方法用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)妊娠期糖尿病孕婦32例（GDM組）、糖耐量正常孕婦30例（正常妊娠組）血液中的RBP4濃度，借助葡萄糖氧化酶法、放射免疫法對(duì)兩組產(chǎn)婦空腹?fàn)顟B(tài)下的胰島素（FINS）濃度、血糖（FPG）濃度等進(jìn)行測(cè)量，然后對(duì)胰島素的抵抗指數(shù)（HOMA-IR）進(jìn)行計(jì)算。采用熒光定量PCR技術(shù)、蛋白免疫印跡法對(duì)兩組產(chǎn)婦胎盤(pán)RBP4 mRNA、蛋白表達(dá)等進(jìn)行檢測(cè)，并且分析GDM組胎盤(pán)組織RBP4 mRNA及蛋白表達(dá)與產(chǎn)婦血清RBP4、HOMA-IR之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果（1）對(duì)照組產(chǎn)婦血清RBP4以及FINS、FPG等水平、HOMA-IR均低于GDM組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05；（3）對(duì)照組產(chǎn)婦胎盤(pán)組織RBP4 mRNA、蛋白表達(dá)顯著低于GDM組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05；（3）GDM組胎盤(pán)組織RBP4 mRNA、蛋白表達(dá)與HOMA-IR均具備相關(guān)性，同時(shí)血清RBP4和HOMA-IR也具備顯著的相關(guān)性，P＜0.05；但是胎盤(pán)組織RBP4 mRNA、蛋白表達(dá)與產(chǎn)婦血清RBP4水平未表現(xiàn)出相關(guān)性，P＞0.05。結(jié)論GDM產(chǎn)婦胎盤(pán)組織內(nèi)的RBP4 mRNA出現(xiàn)高表達(dá)，且血清RBP4異常升高，提示產(chǎn)婦可能發(fā)生了胰島素抵抗機(jī)制，臨床應(yīng)給予高度重視。

妊娠期糖尿病；視黃醇結(jié)合蛋白4；胎盤(pán)；胰島素抵抗

妊娠期糖尿?。℅DM）是指妊娠期間首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)糖代謝異常[1]，是妊娠期常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重危害母兒健康。GDM的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，尚未完全闡明，其中胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能異常是GDM重要的發(fā)病機(jī)制。RPB4屬于最新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，主要由機(jī)體中的脂肪細(xì)胞所分泌，與胰島素抵抗密切相關(guān)[2]，但其與GDM的關(guān)系報(bào)道較少。本研究對(duì)GDM孕婦血清及胎盤(pán)中RPB4的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以探討其在不同組織中與胰島素抵抗的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年12月至2016年4月在濰坊市婦幼保健院產(chǎn)科門(mén)診進(jìn)行前檢，并選擇期剖宮產(chǎn)手術(shù)的32例GDM孕婦，視為GDM組，平均年齡是（28.0±1.9）歲，平均孕周（38.3±1.2）周，平均體重指數(shù)（27.3±1.2）kg/m2；隨機(jī)抽取同期血糖正常，且行剖宮產(chǎn)手術(shù)的30例產(chǎn)婦作為對(duì)照組，平均孕周（37.8±0.9）周，平均年齡（26.5±1.5）歲，平均體重指數(shù)（27.3±1.3）kg/m2。在年齡、體重指數(shù)、孕周等資料上，兩組孕婦比較基本一致（P＞0.05），具有可比性。兩組產(chǎn)婦均為單胎，且未合并其他疾病及并發(fā)癥，無(wú)糖尿病家族史，剖宮產(chǎn)手術(shù)指征為臀位、巨大兒或瘢痕子宮[3]。此次研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且所有對(duì)象均已經(jīng)知情，簽訂了同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 本次研究所有的標(biāo)均采集時(shí)間為剖宮產(chǎn)術(shù)前24 h內(nèi)，分別在兩組產(chǎn)婦空腹?fàn)顟B(tài)下抽取4 mL肘靜脈血，對(duì)血清進(jìn)行分離，-80℃保存待測(cè)。分娩后30 min內(nèi)取約1 cm× 1 cm×1 cm的胎盤(pán)母體面中央組織，反復(fù)漂洗后分裝于無(wú)菌離心管中，-80℃保存待用。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩組孕婦胎盤(pán)組織中RBP4 mRNA的表達(dá)：首先，提取胎盤(pán)組織樣本的總RNA，然后再將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以此作為一個(gè)新的模板；按照cDNA的序列來(lái)對(duì)熒光定量PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，并對(duì)RBP4基因表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定；RBP4上游引物為5′-TACTCCTTCGTGTTTTCCCGG-3′，下游引物5′-TAACCGTTGTGGACGATCAGC-3′；β-actin上游引物為5′-CTTTTCCAGCCTTCCTTCTTGG-3′，下游引物為5′-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′。以上引物均由上海生工生物丁程有限公司合成。按照熒光定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作方法操作。

1.2.3 蛋白印跡法檢測(cè)RBP4蛋白表達(dá)蛋白樣本按蛋白裂解液說(shuō)明書(shū)抽提、濃縮后取得，對(duì)其進(jìn)行電泳后，將蛋白樣本轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上（4℃，275 mA，120 min），采取4℃的封閉液進(jìn)行封閉，然后在加入比例為1：100的抗4℃孵育進(jìn)行過(guò)夜，第二天將一抗棄去后進(jìn)行洗滌；然后再次加入比例為1:2000二抗（羊抗兔抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）孵育2小時(shí)后洗滌。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL顯影），X線曝光30秒，顯影后清水漂洗、定影，洗片后用激光掃描儀進(jìn)行定量分析。以葡萄糖磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照物，RBP4蛋白與GAPDH的條帶灰度值的比值表示RBP4蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)比兩組產(chǎn)婦血清指標(biāo)水平情況

妊娠期糖尿病組32例產(chǎn)婦血清中的RBP4水平、FPG水平以及FINS水平分別是（27.4±1.5、5.5±0.8、12.2±1.3）及HOMA-IR（2.6±0.4）均顯著高于對(duì)照組（18.7±2.1、3.8±0.5、7.9±0.6、1.7±0.3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 比較兩組孕婦胎盤(pán)組織中RBP4 mRNA以及RBP4的蛋白表達(dá)情況

妊娠期糖尿病組32例產(chǎn)婦胎盤(pán)組織RBP4mRNA的表達(dá)水平是（0.79±0.16），對(duì)照組為（0.48±0.05）；對(duì)照組孕婦胎盤(pán)組織中RBP4蛋白水平為（0.50±0.07），GDM組為（0.78±0.11），GDM組相比于對(duì)照組顯著要高（P＜0.05）。

2.3 GDM組產(chǎn)婦不同組織RBP4表達(dá)水平及其與HOMAIR的關(guān)系分析

GDM組30例產(chǎn)婦胎盤(pán)組織中RBP4蛋白水平及RBP4 mRNA表達(dá)水平與HOMA-IR均呈正相關(guān)（r=0.541、0.832，P＜0.05），而其與血清RBP4水平無(wú)相關(guān)性（r=0.045 P＞0.05）；血清RBP4水平與HOMA-IR呈正相關(guān)（r=0.793，P＜0.05）。

3 討 論

3.1 GDM孕婦血清RBP4水平變化及意義

RBP4基因位于染色體10q23～q24區(qū)域，含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，其是視黃醇結(jié)合蛋白家族成員，是一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)，主要由肝臟合成和分泌，其次是脂肪組織，其主要負(fù)責(zé)結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)全反式視黃醇及其衍生物[4]。但RBP4參與胰島素抵抗的機(jī)制尚不明確，有研究表明，RBP能夠?qū)σ葝u素所刺激的IRS1307號(hào)絲氨酸磷酸化進(jìn)行抑制，可能通過(guò)干預(yù)IRS1-Ras-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而對(duì)酪氨酸磷的酸化發(fā)揮抑制作用，促進(jìn)磷酸烯醇式丙酮酸激酶的基因表達(dá)而增加肝糖的輸出量，降低肌肉糖攝取量，進(jìn)而影響胰島細(xì)胞的分泌等多種途徑引發(fā)胰島素抵抗[5]。

GDM組30例產(chǎn)婦血清RBP4濃度依舊存有爭(zhēng)議，在此次研究中，GDM組血清RBP4明顯比對(duì)照組的高，并且和HOMA-IR呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性關(guān)系，提示RBP4可能參與可GDM患者胰島素抵抗的發(fā)生。

3.2 GDM孕婦胎盤(pán)組織中RBP4的表達(dá)及臨床意義

血清中RBP4主要由肝臟合成和分泌，其次是脂肪組織[6]。有研究表明[7]GDM患者血清中RBP4的表達(dá)水平與皮下脂肪中RBP4-mRNA的表達(dá)水平有明顯相關(guān)性。關(guān)于GDM孕婦胎盤(pán)組織中RBP4表達(dá)變化的報(bào)道極少，本研究結(jié)果表明，與正常孕婦相比較，GDM組的RBP4 mRNA、蛋白表達(dá)水平等明顯高得多，且和HOMA-IR表現(xiàn)出相關(guān)性，由此可以看出，胎盤(pán)RBP4在GDM孕婦胰島素抵抗形成過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。但其與血清RBP4水平變化無(wú)明顯相關(guān)性，考慮原因?yàn)樘ケP(pán)組織并非視黃醇結(jié)合蛋白4唯一來(lái)源有關(guān)。而目前臨床尚不清楚GDM孕婦胎盤(pán)組織中視黃醇結(jié)合蛋白4表達(dá)升高的機(jī)制，仍需進(jìn)一步深入探討。

總之，GDM孕婦胎盤(pán)組織及血清中RBP4表達(dá)水平均較高，提示其可能參與妊娠期糖尿病胰島素抵抗的形成，但其具體的發(fā)病機(jī)制仍需深入研究。

[1] American Diabetes Association.Standards of medical care in diabetes-2011[J].Diabetes Care,2011,34(01):s11-s61.

[2] Yan H,Chang X,Xia M.Serum retinol binding protein 4 is negatively related to beta cell function in Chinese women with non-alcoholic fatty liver disease: a cross-sectional study[J].Lipids Health Dis,2013,27(12):157.

[3] American Diabetes Association.Standards of medical care in diabetes-2011[J].Diabetes Care,2011,34(01):s11-s61.

[4] 董金華,薛麗麗.視黃醇結(jié)合蛋白4在妊娠期糖尿病患者血清、臍血及胎盤(pán)組織中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016.13(35):80-83.

[5] 孫玉秀,魯云霞,王朝紅,等.視黃醇結(jié)合蛋白4與胰島素抵抗及2型糖尿病關(guān)系研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2014,54(12):87-89.

[6] 高秀秀,甘旭培,徐先明.妊娠期糖尿病孕婦胎盤(pán)中視黃醇結(jié)合蛋白4表達(dá)與胰島素抵抗和胰島素分泌功能的相關(guān)性.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展[J].2016,25(10):750-753.

[7] Kuzmicki M,Telejko B,Wawrusiewicz-Kurylonek N,et al. Retionalbinding 4 in adipose and placental tissue of women with gestational diabetes[J].Gynecol Endocrinol,2011,27(12):1065-1069.

本文編輯：劉帥帥

R714.256

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ISSN.2095-8803.2017.07.60.02

郭永，男，山東省臨朐縣人，主任醫(yī)師，大學(xué)本科，研究方向：婦產(chǎn)科高危疾病的診療