下調(diào)HMGA1對乳腺癌MCF7細胞增殖和侵襲能力的影響及機制

張洋，董理，孫源博，李文媛，王瑩，孫平，于偉光

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院)

下調(diào)HMGA1對乳腺癌MCF7細胞增殖和侵襲能力的影響及機制

張洋1，董理2，孫源博2，李文媛1，王瑩1，孫平1，于偉光2

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院)

目的觀察下調(diào)高遷移率族蛋白A1(HMGA1)對乳腺癌MCF7細胞增殖和侵襲能力的影響，并探討其機制。方法選擇人乳腺癌MCF7細胞，將其分為siRNA對照組、siRNA-HMGA1組、miR對照組和miR-24-3p組，分別轉(zhuǎn)染siRNA對照慢病毒、siRNA-HMGA1慢病毒、miR對照慢病毒和miR-24-3p慢病毒。采用Western boltting法檢測未轉(zhuǎn)染MCF7、正常乳腺上皮細胞株(HMEC hTERT)及siRNA對照組、siRNA-HMGA1組細胞HMGA1蛋白，實時熒光定量PCR法檢測miR對照組和miR-24-3p組細胞HMGA1、miR-142-3p mRNA，MTT法和Transwell法檢測4組細胞增殖活力和侵襲能力，熒光素酶報告基因分析驗證HMGA1與miR-142-3p靶向關(guān)系。結(jié)果MCF7、HMEC hTERT細胞中HMGA1蛋白相對表達量分別為0.574±0.075、0.234±0.099，兩者相比P<0.01。siRNA-HMGA1組、siRNA對照組HMGA1蛋白相對表達量分別為0.141±0.051、0.651±0.136，兩組相比P<0.01。miR-142-3p組、miR對照組HMGA1 mRNA相對表達量分別為0.135±0.046、0.604±0.156，miR-142-3 mRNA相對表達量分別為1.128±0.174、0.263±0.116，兩者相比P均<0.01。MCF7細胞中HMGA1 mRNA、miR-142-3p mRNA表達呈負相關(guān)(r=-0.259，P=0.021)。siRNA-HMGA1組、siRNA對照組細胞增殖活力分別為0.535±0.066、1.160±0.125，穿膜細胞數(shù)分別為(32.05±9.33)、(71.68±14.39)個，兩者相比P均<0.01。miR-142-3p組、miR對照組細胞增殖活力分別為0.362±0.121、1.083±0.139，穿膜細胞數(shù)分別為(21.52±6.64)、(46.74±7.82)個，兩組相比P均<0.01。miR-142-3p組、miR對照組野生型HMGA1 3′-UTR熒光素酶活性分別為0.668±0.074、1.000±0.000，兩組相比P<0.01。結(jié)論下調(diào)HMGA1乳腺癌MCF7細胞增殖和侵襲能力增強，其機制可能與HMGA1可靶向反向調(diào)控miR-142-3p有關(guān)。

高遷移率族蛋白A1；微小RNA 142-3p；乳腺腫瘤；細胞增殖；細胞侵襲

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，是全球女性因癌癥導(dǎo)致死亡的首要原因。乳腺癌高病死率主要原因為腫瘤轉(zhuǎn)移，而腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因已被證實參與腫瘤細胞增殖，因此，篩選鑒定腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的生物標志物，對乳腺癌臨床治療具有重要意義[1]。高遷移率族蛋白A1(HMGA1)是一種染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)。最近研究表明HMGA1為多種惡性腫瘤的致癌基因[2]，其在乳腺癌[3]、胃癌[4]、卵巢癌[5]、非小細胞肺癌[6]、甲狀腺癌[7]中表達上調(diào)，并促進腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移，其高表達與胃癌[4]和非小細胞肺癌[6]患者的預(yù)后呈負相關(guān)。本研究前期通過TargetScan軟件發(fā)現(xiàn)與3′非編碼區(qū)(3′-UTR)HMGA1序列相匹配microRNAs為miR-142-3p，而miR-142-3p已被證實可作為多種腫瘤的抑癌基因。研究表明,胰腺癌[8]、乳腺癌[9]和結(jié)腸癌[10]中miR-142-3p表達下調(diào)，并抑制腫瘤增殖、遷移和侵襲。但在乳腺癌細胞中HMGA1的生物學(xué)作用及對miR-142-3p的靶向調(diào)控目前尚不明確。2011年10月～2016年2月,本研究觀察了下調(diào)HMGA1對乳腺癌MCF7細胞增殖和侵襲能力的影響，并探討其對miR-142-3p的靶向調(diào)控作用，為臨床乳腺癌治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 siRNA-HMGA1慢病毒(piLenti-siRNA-HMGA1)、siRNA對照慢病毒(piLenti-siRNA-GFP)、miR-142-3p慢病毒(Lenti hsa-miR-142-3p)、miR對照慢病毒(pLenti-Ⅲ-miR-Blank)均購于美國ABM公司；HMGA1、miR-142-3p、內(nèi)參U6、GAPDH引物由美國Ambion公司合成；雙熒光素酶報告試劑盒購自美國Promega公司；四氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、HMGA1一抗購自美國Sigma公司；microRNA PCR Kit試劑盒購自美國Exiqon公司；TRIzol提取液購自美國Invitrogen公司。CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；超凈臺(蘇州蘇凈安泰公司)；凝膠成像系統(tǒng)(北京六一公司)。

1.2 細胞來源及培養(yǎng)方法 人乳腺癌細胞株(MCF7)和正常乳腺上皮細胞株(HMEC hTERT)購于美國Sigma公司，并采用含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3～4 d消化傳代，取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.3 HMGA1、miR-142-3p轉(zhuǎn)染方法 取對數(shù)生長期MCF7細胞，將其分為siRNA對照組、siRNA-HMGA1組、miR對照組和miR-24-3p組，鋪于6孔板中，1 d后進行轉(zhuǎn)染。各組每孔取37 ℃預(yù)熱無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋后分別加入2 μL siRNA對照慢病毒、siRNA-HMGA1慢病毒、miR對照慢病毒和miR-24-3p慢病毒。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后用于進一步實驗。

1.4 細胞HMGA1蛋白檢測 采用Western boltting法。取MCF7、HMEC hTERT及siRNA對照組和siRNA-HMGA1組細胞，應(yīng)用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取蛋白質(zhì)提取物，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉后加入一抗HMGA1抗體(1∶1 000)或GADPH(1∶5 000)，加入二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBS洗凈，應(yīng)用顯色液顯示后行吸光度分析。以GADPH做校正得到積分光密度相對比值來計算細胞HMGA1蛋白相對表達量。

1.5 細胞HMGA1、miR-142-3p mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。取miR對照組和miR-24-3p組細胞，應(yīng)用TRIzol提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)說明書通過SYBR Green系統(tǒng)進行實時熒光定量。HMGA1引物序列：5′-AGGAAAAGGACGGCACTGAGAA-3′；5′-CCCCGAGGTCTCTTAGGTGTTGG-3′。GAPDH引物序列：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′；5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。miR-142-3p應(yīng)用Mirvana qRT-PCR miRNA檢測試劑盒進行檢測。miR-142-3p引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3′；5′-CGACGTGTAGTGTTTCCTA-3′；U6引物序列：5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′；5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 60 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s共40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算HMGA1、miR-142-3p mRNA相對表達量。

1.6 細胞增殖能力觀察 將上述4組細胞接種于96孔板，每孔2×103個細胞，培養(yǎng)6 d。在細胞生長檢測時間點，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT培養(yǎng)2 h，丟棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，每孔加入100 mL的DMSO，在570 nm波長測定吸光度值，檢測細胞增殖活力[11]。

1.7 細胞侵襲能力觀察 應(yīng)用Transwell法觀察細胞侵襲能力，分別取上述4組(8～10)×104個細胞加入到基質(zhì)膠的上室，600 μL RPMI1640培養(yǎng)液注入下室。收集細胞后PBS沖洗和固定，0.1%結(jié)晶紫染色，拍照及顯微鏡下計數(shù)細胞個數(shù)。

1.8 熒光素酶報告基因分析驗證HMGA1與miR-142-3p靶向關(guān)系 采用熒光素酶報告基因分析。從人基因組DNA中克隆HMGA1 3′-UTR，插入XhoⅠ與NotⅠ酶切位點之間，進行psiCHECK-2熒光素酶基因報告，通過測序驗證野生型和突變型的插入序列[12]，構(gòu)建含有野生型或突變HMGA1 3′-UTR序列靶位點熒光素酶報告基因載體。分別取miR對照組和miR-24-3p組細胞，接種在24孔板中。根據(jù)說明書用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 MCF7、HMEC hTERT細胞中HMGA1蛋白表達比較 MCF7、HMEC hTERT細胞中HMGA1蛋白相對表達量分別為0.574±0.075、0.234±0.099，兩者相比P<0.01。

2.2 siRNA-HMGA1組、siRNA對照組HMGA1蛋白表達比較 siRNA-HMGA1組、siRNA對照組HMGA1蛋白相對表達量分別為0.141±0.051、0.651±0.136，兩組相比P<0.01。

2.3 miR-142-3p組、miR對照組HMGA1 mRNA表達比較 miR-142-3p組、miR對照組HMGA1 mRNA相對表達量分別為0.135±0.046、0.604±0.156，miR-142-3 mRNA相對表達量分別為1.128±0.174、0.263±0.116，兩者相比P均<0.01。

2.4 MCF7細胞中HMGA1 mRNA與miR-142-3p mRNA的關(guān)系 MCF7細胞中HMGA1 mRNA、miR-142-3p mRNA兩者相對表達量呈負相關(guān)(r=-0.259，P=0.021)。

2.5 siRNA-HMGA1組、siRNA對照組細胞增殖、侵襲能力比較 siRNA-HMGA1組、siRNA對照組細胞增殖活力分別為0.535±0.066、1.160±0.125，穿膜細胞數(shù)分別為(32.05±9.33)、(71.68±14.39)個，兩者相比P均<0.01。

2.6 miR-142-3p組、miR對照組細胞增殖、侵襲能力比較 miR-142-3p組、miR對照組細胞增殖活力分別為0.362±0.121、1.083±0.139，穿膜細胞數(shù)分別為(21.52±6.64)、(46.74±7.82)個，兩組相比P均<0.01。

2.7 HMGA1與miR-142-3p靶向關(guān)系驗證結(jié)果 miR-142-3p組、miR對照組野生型HMGA1 3′-UTR熒光素酶活性分別為0.668±0.074、1.000±0.000，兩組相比P<0.01。miR-142-3p組、miR對照組突變型HMGA1 3′-UTR熒光素酶活性分別為1.020±0.031、1.000±0.000，兩組相比P﹥0.05。

3 討論

高遷移率族蛋白家族(HMG)是一系列染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控蛋白家族，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與多種生物學(xué)進程，包括細胞周期調(diào)控、細胞增殖和遷移等[3]。HMGA1為HMGA家族的主要成員，HMGA1蛋白包括HMGA1a和HMGA1b，主要通過綁定位于多種基因啟動子和增強子區(qū)域A/T-rich DNA序列，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，其失調(diào)可能會導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定[5]。HMGA1激活I(lǐng)Rb啟動子，促進參與胰島素抵抗(IR)表達缺失。HMGA1能夠調(diào)節(jié)細胞周期蛋白E2的活動，轉(zhuǎn)移Yes相關(guān)蛋白(YAP)至細胞核，進而增強細胞運動和侵襲性[13]。HMGA1高表達已被證明是腫瘤細胞的標志物，在一些腫瘤疾病的診斷和預(yù)后評估中具有重要的價值。HMGA1在腫瘤細胞通過Wnt/β-catenin和Pin1/mutant p53信號通路維持腫瘤干細胞和腫瘤轉(zhuǎn)移特性[14,15]。HMGA1蛋白質(zhì)已被證明是不同來源的細胞致瘤相關(guān)的“樞紐蛋白”，在促進細胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用[16]。HMGA1基因在人類乳腺癌中過度表達，敲除乳腺癌組織中HMGA1能顯著減少錨定依賴性生長及移植瘤形成，但HMGA1在乳腺癌的生物學(xué)作用機制尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)HMGA1在乳腺癌MCF7細胞中表達較正常乳腺細胞增高，表明HMGA1可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果表明siRNA-HMGA1組較siRNA對照組HMGA1蛋白表達低，證實siRNA-HMGA1慢病毒有效沉默HMGA1表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，siRNA-HMGA1組較siRNA對照組細胞增殖活力低且穿膜細胞數(shù)少。這表明下調(diào)HMGA1表達可抑制MCF7細胞增殖活力和侵襲能力，反向證實HMGA1能夠通過促進乳腺癌細胞增殖和侵襲，在乳腺癌發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

microRNAs是非編碼單鏈RNA分子(22個核苷酸的長度)，在轉(zhuǎn)錄后通過與靶基因mRNA的3′-UTR發(fā)生堿基配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯[8]，在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。為探討HMGA1潛在的靶點microRNA，本研究構(gòu)建了含有野生型或突變3′-UTR HMGA1序列靶位點熒光素酶報告基因載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-142-3p組較miR對照組野生型HMGA1 3′-UTR熒光素酶活性低，表明miR-142-3p高表達顯著降低野生型HMGA1 3′-UTR熒光素酶活性。HMGA1在MCF7細胞表達顯著上調(diào)，且MCF7細胞中HMGA1 mRNA與miR-142-3p mRNA表達呈負相關(guān)，進一步證實miR-142-3p是HMGA1的直接靶基因，HMGA1反向調(diào)控miR-142-3p發(fā)揮作用。miR-142-3p可作為一個獨立的腫瘤抑制因子，在胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌[8～10]等多種腫瘤組織中表達下調(diào)，并抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示miR-142-3p組較miR對照組細胞增殖活力低且穿膜細胞數(shù)少，證實miR-142-3p可抑制MCF7細胞增殖活力和侵襲能力，這與以往miR-142-3p在其他腫瘤中的作用相一致[17]。因此我們推測HMGA1靶向反向調(diào)節(jié)miR-142-3p促進腫瘤細胞增殖和侵襲，這可能是HMGA1在乳腺癌中作用機制之一。

綜上所述，下調(diào)HMGA1乳腺癌MCF7細胞增殖和侵襲能力增強，其機制可能與HMGA1可靶向反向調(diào)控miR-142-3p有關(guān)。

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Effectsofdown-regulationofHMGA1onproliferationandinvasionofbreastcancerMCF7cells

ZHANGYang1,DONGLi,SUNYuanbo,LIWenyuan,WANGYing,SUNPing,YUWeiguang

(1MudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157011,China)

ObjectiveTo investigate the effects of the down-regulation of high mobility group protein A1 (HMGA1) on the proliferation and invasion of breast cancer MCF7 cells and its mechanism.MethodsThe human breast cancer cell line (MCF7) was divided into four groups: siRNA control group, siRNA-HMGA1 group, miR control group, and miR-24-3p group; MCF7 cells in the above groups were transfected with siRNA control lentivirus, siRNA-HMGA1 lentivirus, miR control lentivirus and miR-24-3p lentivirus, respectively. The protein expression of HMGA1 was detected in MCF7 cells, normal breast epithelial cell line (HMEC hTERT), siRNA control group, and siRNA-HMGA1 group by using Western blotting; the HMGA1 and miR-142-3p mRNA expression and its correlation was detected in the miR control group and miR-24-3p group by real-time quantitative PCR; the cell proliferation and invasion were detected in the four groups by MTT and Transwell assay; Luciferase reporter experiment was used to verify the target relationship between HMGA1 and miR-142-3p.ResultsHMGA1 protein expression in MCF7 cells was 0.574±0.075, which was significantly higher than that of HMEC hTERT cells (0.234±0.099) (P<0.05), and the expression of HMGA1 in siRNA-HMGA1 group (0.141±0.051) was lower than that of siRNA group (0.651±0.136) (P<0.05); HMGA1 mRNA expression in the miR-142-3p group was lower than that of the miR control group (0.135±0.046 vs 0.604±0.156), and the miR-142-3 mRNA expression was higher than that of the miR control group (1.128±0.174 vs 0.263±0.116) (allP<0.01); the expression of HMGA1 mRNA and miR-142-3p mRNA was negatively correlated (r=0.259,P<0.05); the cell proliferation in the siRNA-HMGA1 group was lower than that of the control group (0.535±0.066 vs 1.160± 0.125), transmembrane cell number was also lower than that of the siRNA group (32.05±9.33 vs 71.68±14.39) (P<0.05); the cell proliferation ability of miR-142-3p group was lower than that of the miR group (0.362±0.121 vs 1.083±0.139), and the transmembrane cell number was also lower than that of the miR group (21.52±6.64 vs 46.74±7.82) (P<0.05); in the miR-142-3p group and the miR control group, the Dual luciferase reporter assay demonstrated that the HMGA1 3′-UTR luciferase activity in wild-type was 0.668±0.074 and 1.000±0.000, respectively (P<0.01).ConclusionThe down-regulation of HMGA1 expression can promote the proliferation and invasion of breast cancer cells by reversely regulating miR-142-3p expression.

high mobility group protein A1; microRNA-142-3p; breast carcinoma; cell proliferation; cell invasion

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.005

R735

A

1002-266X(2017)38-0015-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(81371362)；黑龍江省自然科學(xué)基金項目(H201377)。

張洋(1987-)，女，博士，講師，主要研究方向為腫瘤轉(zhuǎn)移機制。E-mail: 978619420@qq.com

于偉光(1987-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向為腫瘤轉(zhuǎn)移機制。E-mail: Yingwang770224@163.com

2017-03-29)