水貂阿留申細小病毒的致病機制、鑒定及防治方法

卞大偉 （遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所 遼寧 沈陽 110003）

水貂阿留申細小病毒的致病機制、鑒定及防治方法

卞大偉 （遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所 遼寧 沈陽 110003）

水貂阿留申細小病毒(Aleutian mink disease parvo virus，AMDV)是感染水貂的自主復制型細小病毒，是引起水貂阿留申病的病原。AMDV感染水貂后會產(chǎn)生抗體依賴的病毒感染增強作用(Antibody-dependent enhanceme nt，ADE)，還沒有效果較好的疫苗進行防控。本文主要對AMDV的致病機制及目前的鑒定和防治方法進行綜述。

水貂阿留申細小病毒是感染水貂的自主復制型細小病毒，給世界范圍的水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[1]。AMDV根據(jù)不同的病毒株、水貂年齡、免疫狀態(tài)等因素，可引起不同的疾病，AMDV感染血清反應陰性的幼貂，可在肺泡II型細胞高效復制，引起急性致死性間質(zhì)性肺炎，而感染成年貂，則主要感染淋巴結(jié)巨噬細胞，呈低水平病毒復制，引起以脾腫大、高丙種球蛋白血癥、漿細胞增多、動脈炎、免疫復合物型腎小球腎炎為特征的慢性疾病，可致使水貂消瘦，繁殖力底下[1,2]。目前，對于AMDV，還沒有公認的效果較好的疫苗，也沒有特效的治療方法，只能通過檢疫、淘汰病貂等方法來凈化貂群，進行防控。本文根據(jù)AMDV致病機制的研究進展，對目前AMDV的鑒定和防治方法進行綜述。

1 AMDV基本特征及致病機制

（1）AMDV屬于細小病毒科(Parvoviridae)阿留申細小病毒屬(Amdoparvovirus)成員，基因組為單股線性負鏈DNA，長約4800nt，兩端回文序列形成復雜的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，中間序列含有兩個開放閱讀框(ORFs)，左端ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和NS3，其中NS1是主要的多功能蛋白，在病毒的轉(zhuǎn)錄和復制過程中發(fā)揮重要作用；右端ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2，其中VP2是主要的衣殼蛋白，占衣殼蛋白的90%，含有主要的抗原決定簇[3～6]。病毒粒子無囊膜，直徑約24～26nm，呈正二十面體對稱，結(jié)構(gòu)結(jié)實緊密，對外界環(huán)境抵抗力強，耐熱，并能耐受氯仿等有機溶劑[7]。在體外，AMDV能在貓腎細胞系CRFK細胞中復制，最適培養(yǎng)溫度32℃。（2）AMDV與其它自主復制型細小病毒相比有其特殊的致病機制。如上所述，不含母源抗體的幼貂感染AMDV致病株，可在感染后2～3周即產(chǎn)生暴發(fā)性的間質(zhì)性肺炎，致死率達90%以上[8]。而幼貂在出生一周后感染AMDV，則產(chǎn)生肺炎的幾率會顯著降低，而是會產(chǎn)生成年貂感染AMDV的癥狀，即機體快速產(chǎn)生抗病毒抗體，病毒則呈持續(xù)性感染[9]。成年貂感染AMDV的癥狀與病毒毒株及水貂基因型有關(guān)。AMDV的致病株AMDV-Utah具有較強致病性，在成年貂體內(nèi)呈持續(xù)性感染，導致免疫系統(tǒng)紊亂，但在體外CRFK細胞中復制效率低，而AMDV的弱毒株AMDV-G則能在CRFK細胞中高效復制，但在體內(nèi)無致病性[5,10]。AMDV感染后可快速刺激機體產(chǎn)生抗病毒抗體，抗AMDV抗體與病毒粒子結(jié)合形成感染性的免疫復合物，沉積在血管和腎小球處，導致高丙種球蛋白血癥和腎小球腎炎等癥狀。免疫過的成年貂雖然已產(chǎn)生保護性抗體，但并不能使其免于AMDV的感染，反而會加快疾病進程，即抗體依賴的病毒感染增強作用(Antibody-dependent enhancement，ADE)。這是因為AMDV可通過與抗體結(jié)合形成的免疫復合物，進一步與巨噬細胞表面Fc受體或補體受體結(jié)合，從而促進AMDV進入巨噬細胞，將AMDV與已感染水貂的血清預先孵育后，再感染巨噬細胞，其感染效率可提高10倍[11]。而幼貂免疫后產(chǎn)生的抗體則能保護幼貂免于產(chǎn)生致死性肺炎，這與AMDV感染幼貂的靶細胞是肺泡II型細胞有關(guān)。雖然抗體能夠促進AMDV感染巨噬細胞，但僅有少量巨噬細胞能產(chǎn)生AMDV mRNA，說明AMDV在巨噬細胞內(nèi)并沒有起始感染，存在其他機制限制病毒復制，使病毒呈持續(xù)性感染，進一步影響體內(nèi)免疫系統(tǒng)[12]。研究表明，抗體結(jié)合AMDV的主要位點是VP2蛋白的428～446位氨基酸，抗VP2∶428～446的抗體能夠凝集病毒粒子形成免疫復合物，介導ADE[13]。AMDV-G感染CRFK細胞可引起細胞凋亡，用凋亡蛋白酶3(caspase 3)或廣譜蛋白酶抑制劑預先處理CRFK細胞，可以抑制病毒引起的凋亡，但同時發(fā)現(xiàn)，抑制凋亡會顯著降低感染性病毒粒子的產(chǎn)量，說明在體外，AMDV的高效復制依賴于特異凋亡蛋白酶的激活[14～16]。目前，AMDV的ADE機制還存在很多未解問題，需進行深入研究，以期尋求防治AMDV的有效方法。

2 AMDV的鑒定

2.1 病毒粒子的鑒定 隨著全基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，各種PCR技術(shù)的不斷創(chuàng)新，使AMDV的全基因組測序成為可能。Jensen等通過PCR擴增NS1基因的374bp片段檢測水貂組織樣品中的AMDV，與對流免疫電泳方法相比，其相對敏感性達97.9%[17]。由于AMDV對外界環(huán)境抵抗力強，可能長期存在于被污染的貂場中，Prieto等為了檢測貂場中的環(huán)境樣品是否污染了AMDV，建立了實時熒光定量PCR(qPCR)檢測方法，AMDV感染的貂場中93.9%的環(huán)境樣品都顯示AMDV陽性，沒有AMDV感染的貂場或已進行過殺毒處理的貂場的檢測結(jié)果呈陰性，與動物直接接觸的樣品所污染的AMDV水平最高[18]。PCR和qPCR檢測方法靈敏度高，耗時較少，但需要特殊的儀器和專業(yè)技術(shù)，因此比較適合應用于實驗室檢測，卻不適用于大規(guī)模檢測。Zhang等優(yōu)化環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)來檢測AMDV，設(shè)計6個特異引物擴增VP2基因的特異序列，在等溫條件下(65℃水浴)，45min即可完成擴增反應，利用熒光染料用肉眼即可觀察檢測結(jié)果，不需要特殊儀器，具有簡單、特異、快速、成本低的特點，比普通PCR靈敏度更高(圖1)[19]。LAMP技術(shù)方法有潛力成為AMDV的有效診斷工具，特別是在沒有特殊儀器的野外條件下，應用前景更好。

2.2 抗AMDV抗體的鑒定 （1）PCR方法檢測AMDV感染，在感染早期，其敏感性顯著高于對流免疫電泳技術(shù)(coun-terimmunoelectrophoresis，CIEP)，但是由于病毒血癥和糞便排毒時間呈間歇性，PCR應用有一定限制[20]。感染后24周仍能檢測到AMDV抗體，因此可以通過抗體檢測來鑒定AMDV感染。常規(guī)的AMDV抗體檢測方法是CIEP，基于抗原抗體特異性反應，在瓊脂糖凝膠電泳時，抗原由負極向正級移動，抗體由正極向負極移動，兩者相遇形成灰白色沉淀線[21]?？乖梢允莵碓从诮M織或細胞培養(yǎng)物的全病毒抗原，也可以是基因工程抗原。Clemens等將VP1和VP2基因編碼序列插入重組牛痘病毒，重組病毒VV∶ADSP感染細胞后能夠成功表達VP1和VP2蛋白，并且VP2蛋白能夠自我組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)；接種VV∶ADSP能夠產(chǎn)生抗AMDV抗體；將重組表達產(chǎn)物作為抗原進行CIEP試驗檢測正常和患病水貂的血清，其特異性與標準ADV抗原相同[22]。Knuuttila等利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)成功表達了結(jié)構(gòu)蛋VP2，并自我組裝形成VLPs，純化后的VLPs作為抗原進行CIEP，與傳統(tǒng)CIEP抗原相比，兩者符合率達到100%[23]。國內(nèi)曾祥偉等將VP2基因的主要抗原區(qū)進行原核表達，將表達蛋白純化后作為抗原進行CIEP，與傳統(tǒng)CIEP結(jié)果相比較，改進的CIEP方法具有較高的敏感性和特異性，血清檢出率更高，兩者檢測符合率達94.3%[24]。全病毒抗原存在散毒危險，臟器抗原制備繁瑣，細胞抗原的病毒效價較低，病毒濃縮和純化成本較高，相比而言，基因工程疫苗特異性較好，且無散毒危險，正逐漸被推廣應用。（2）CIEP方法檢測AMDV感染，具有較好的特異性和敏感性，被作為抗體檢測技術(shù)的“金標準”，但是試驗過程需要復雜的儀器，并且結(jié)果判定存在主觀性，可能導致假陽性的判定。Knuuttila等在利用VLPs作為抗原進行CIEP的同時，還進行了酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，將VLPs作為包被抗原，HRP標記的羊抗貓抗體作為二抗，檢測316份水貂血清樣品，并將ELISA和CIEP結(jié)果進行了比較，結(jié)果顯示ELISA與CIEP檢測結(jié)果相一致，可以應用于AMDV感染檢測，并建議推廣應用[23]。Andersson和Wallgren對以AMDV病毒為抗原的ELISA方法和以AMDV VP2蛋白為抗原的ELISA方法進行比較，并以傳統(tǒng)CIEP方法為金標準進行比較。與CIEP相比，VP2-ELISA的敏感性和特異性分別為99.7%和98.3%，而AMDV-ELISA的敏感性和特異性僅為37.6%和98.3%，因此，推薦VP2-ELISA作為診斷方法代替CIEP檢測AMDV抗體。Chen等將VP2蛋白的主要抗原區(qū)(332～452位氨基酸片段)進行原核表達，表達的重組蛋白VP2332-452純化后作為抗原進行ELISA，檢測水貂血清樣品，與傳統(tǒng)CIEP相比，VP2332～452ELISA的特異性和敏感性分別達97.9%和97.3%，表明VP2332～452可以作為抗原進行ELISA檢測AMDV感染[25]。同年，Ma等預測了6個AMDV VP2抗原性肽段，即氨基酸P1(288～309)，P2 (325～340)，P3(415～433)，P4(514～532)，P5(556～567)和P6(604～616)，人工合成這6個肽段，并在多肽的N端或C端加一個半胱氨酸，再交聯(lián)一個卵清蛋白(OVA)，重組蛋白作為抗原進行ELISA，對各肽段的抗原性的檢測結(jié)果表明，P1的抗原性最好；用含有P1的重組蛋白作為抗原，檢測764份水貂血清樣品，與傳統(tǒng)CIEP相比，ELISA的敏感性和特異性分別達98.0%和97.7%，兩者一致性達97.9%；同時，比較了ELISA和CIEP對感染早期的血清樣品的檢測結(jié)果(共342份血清樣品，PCR檢測AMDV基因組陽性，而CIEP檢測AMDV抗體陰性)，ELISA檢測的陽性樣品149份，陽性率為43.6%；敏感性和特異性檢測結(jié)果表明利用VP2多肽為抗原的ELISA比CIEP的敏感性更高，特異性更好[26]。ELISA方法檢測抗體，克服了CIEP的主觀性，可自動化操作，且敏感性比CIEP更高，更適于檢測AMDV感染。各研究結(jié)果表明，VP2-ELISA比AMDVELISA的敏感性和特異性更高，適于用來檢測AMDV感染，但需要利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達大量的VP2蛋白，并需要進行純化，成本較高，而原核表達VP2抗原肽段或合成肽，既降低了蛋白表達和純化的成本，又有較高的敏感性和特異性，更適于作為抗原進行ELISA檢測AMDV感染。（3）間接免疫熒光試驗(Indirect immunofluorescence assay, IFA)也可用于抗原抗體反應，但此方法多用于實驗室內(nèi)的病毒檢測和蛋白功能鑒定等。經(jīng)典的碘凝集試驗(Iodine agglutination test，IAT)也可以檢測AMDV感染，將新配置的魯戈氏碘液與血清樣品混合，若產(chǎn)生褐色絮狀凝集物，說明存在AMDV感染[27]。此法簡單，不需要特殊儀器，適合于大群初篩檢查，但此法特異性差，需配合PCR或其他抗體檢測技術(shù)進一步鑒定。徐磊原核表達AMDV VP2的2個抗原片段，并將其作為標記抗原，制備膠體金試紙條檢測血清樣品，與CIEP檢測結(jié)果相比，膠體金免疫層析法的敏感性是CIEP的2倍，特異性較好，該方法操作簡單，成本較低，不需要特殊儀器，適用于自動化檢測，有較好的應用前景[28]。

3 AMDV的防治

1998年，Aasted等研究發(fā)現(xiàn)，AMDV衣殼蛋白VP1/2作為疫苗接種水貂后，促進了接種水貂的疾病進程，具有較高的死亡率；而接種NS1蛋白的水貂，與未接種水貂相比，AMDV感染引起更溫和的阿留申疾病，說明NS1疫苗起到了一定程度的保護作用[29]。2005年，Castelruiz Y等的研究結(jié)果同樣證明了NS1蛋白接種水貂能起到一定的保護作用[30]。水貂養(yǎng)殖主要是為了獲得皮毛，目前對AMDV的防控主要通過種貂檢疫和病貂撲殺等方式進行，養(yǎng)殖過程中，要注意定期消毒，防止交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

4 結(jié)論

自1956年水貂阿留申病被發(fā)現(xiàn)以來，由于AMDV感染后的ADE現(xiàn)象，很難通過研制有效的疫苗來防控AMDV的感染，對ADE機制的進一步深入研究對于有效疫苗的研制至關(guān)重要，疫苗必須根據(jù)相關(guān)機制避免產(chǎn)生ADE，或者引入調(diào)控因子對免疫系統(tǒng)進行調(diào)控，減少病理損傷。目前，雖然沒有有效的疫苗，但各國研究者不斷創(chuàng)新AMDV的檢測方法，通過定期對AMDV病貂篩查的方式淘汰病貂，從而凈化貂場來防控AMDV感染。

[1] Park, G.S., S.M. Best, and M.E. Bloom, Two mink parvoviruses use different cellular receptors for entry into CRFK cells. Virology, 2005. 340(1)∶ 1-9.

[2] Xi, J., et al., Genetic characterization of the complete genome of an Aleutian mink disease virus isolated in north China. Virus Genes, 2016. 52(4)∶ 463-473.

[3] Cotmore, S.F., et al., The family Parvoviridae. Archives of Virology, 2014. 159(5)∶ 1239-1247.

[4] Bloom, M.E., et al., Nucleotide-Sequence and Genomic Organization of Aleutian Mink Disease Parvovirus (Adv) - Sequence Comparisons between a Nonpathogenic and a Pathogenic Strain of Adv. Journal of Virology, 1988. 62(8)∶ 2903-2915.

[5] Qiu, J.M., et al., The transcription profile of Aleutian mink disease virus in CRFK cells is generated by alternative processing of Pre-mRNAs produced from a single promoter. Journal of Virology, 2006. 80(2)∶ 654-662.

[6] Costello, F., et al., Epitope mapping of Aleutian Mink Disease Parvovirus virion protein VP1 and 2. Scandinavian Journal of Immunology, 1999. 49(4)∶ 347-354.

[7] McKenna, R., et al., Three-dimensional structure of Aleutian mink disease parvovirus∶ Implications for disease pathogenicity. Journal of Virology, 1999. 73(8)∶ 6882-6891.

[8] Alexandersen, S., et al., Acute interstitial pneumonia in mink kits inoculated with defined isolates of Aleutian mink disease parvovirus. VetPathol, 1994. 31(2)∶ 216-218.

[9] Alexandersen, S., Pathogenesis of disease caused by Aleutian mink disease parvovirus. APMIS Suppl, 1990. 14∶ 1-32.

[10] Hadlow, W.J., R.E. Race, and R.C. Kennedy, Comparative pathogenicity of four strains of Aleutian disease virus for pastel and sapphire mink. Infect Immun, 1983. 41(3)∶ 1016-1023.

[11] Kanno, H., J.B. Wolfinbarger, and M.E. Bloom, Aleutian mink disease parvovirus infection of mink macrophages and human macrophage cell line U937∶ demonstration of antibody-dependent enhancement of infection. J Virol, 1993. 67(12)∶ 7017-7024.

[12] Alexandersen, S., et al., Pathogenesis of Aleutian mink disease parvovirus infection∶ effects of suppression of antibody response on viral mRNA levels and on development of acute disease. J Virol, 1994. 68(2)∶738-749.

[13] Bloom, M.E., et al., Identification of Aleutian mink disease parvovirus capsid sequences mediating antibody-dependent enhancement of infection, virus neutralization, and immune complex formation. Journal of Virology, 2001. 75(22)∶ 11116-111127.

[14] Best, S.M., J.B. Wolfinbarger, and M.E. Bloom, Caspase activation is required for permissive replication of Aleutian mink disease parvovirus in vitro. Virology, 2002. 292(2)∶ 224-234.

[15] Cheng, F., et al., The capsid proteins of Aleutian mink disease virus activate caspases and are specifically cleaved during infection. J Virol, 2010. 84(6)∶ 2687-2696.

[16] Best, S.M., et al., Caspase cleavage of the nonstructural protein NS1 mediates replication of Aleutian mink disease parvovirus. J Virol, 2003. 77(9)∶ 5305-5312.

[17] Jensen, T.H., et al., Implementation and validation of a sensitive PCR detection method in the eradication campaign against Aleutian mink disease virus. J Virol Methods, 2011. 171(1)∶ 81-85.

[18] Prieto, A., et al., Application of real-time PCR to detect Aleutian Mink Disease Virus on environmental farm sources. Vet Microbiol, 2014. 173(3-4)∶ 355-359.

[19] Zhang, Z., et al., Detection of Aleutian disease virus by loopmediated isothermal amplification. Virusdisease, 2015. 26(3)∶ 203-206.

[20] Farid, A.H., I. Hussain, and I. Arju, Detection of Aleutian mink disease virus DNA and antiviral antibodies in American mink (Neovison vison) 10 days postinoculation. J Vet Diagn Invest, 2015. 27(3)∶ 287-294.

[21] Cho, H.J. and D.G. Ingram, Antigen and antibody in Aleutian disease in mink. I. Precipitation reaction by agar-gel electrophoresis. J Immunol, 1972. 108(2)∶ 555-557.

[22] Clemens, D.L., et al., Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins by a recombinant vaccinia virus∶ self-assembly of capsid proteins into particles. J Virol, 1992. 66(5)∶ 3077-3085.

[23] Knuuttila, A., et al., Development and evaluation of an enzymelinked immunosorbent assay based on recombinant VP2 capsids for the detection of antibodies to Aleutian mink disease virus. Clin Vaccine Immunol, 2009. 16(9)∶ 1360-1365.

[24] 曾祥偉, 華育平, 梁冬瑩. 水貂阿留申病毒VP2蛋白主要抗原表位基因原核表達及其檢測應用[J]. 微生物學報, 2007. 47(6)∶ 1088-1090.

[25] Chen, X., et al., Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Based on Fusion VP2332-452 Antigen for Detecting Antibodies against Aleutian Mink Disease Virus. J Clin Microbiol, 2016. 54(2)∶ 439-442.

[26] Ma, F., et al., Development of a Peptide ELISA for the Diagnosis of Aleutian Mink Disease. PLoS One, 2016. 11(11)∶ e0165793.

[27] 姚彬, 杜杰, 劉倩宏, 水貂阿留申病碘凝集反應與對流免疫電泳對比試驗. 吉林農(nóng)業(yè)科技學院學報, 2014. 23(2)∶ 14-16.

[28] 徐磊, 水貂阿留申膠體金免疫層析診斷方法的初步建立[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學院. 2010.

[29] Aasted, B., S. Alexandersen, and J. Christensen, Vaccination with Aleutian mink disease parvovirus(AMDV)capsid proteins enhances disease, while vaccination with the major non-structural AMDV protein causes partial protection from disease. Vaccine, 1998. 16(11-12)∶ 1158-1165.

[30] Castelruiz, Y., M. Blixenkrone-Moller, and B. Aasted, DNA vaccination with the Aleutian mink disease virus NS1 gene confers partial protection against disease. Vaccine, 2005. 23(10)∶ 1225-1231.

山東畜牧獸醫(yī)學會簡介

山東畜牧獸醫(yī)學會成立于1952年12月，是一個學術(shù)性社會團體，是在中國共產(chǎn)黨領(lǐng)導下的社會法人團體，接受山東省科協(xié)業(yè)務主管領(lǐng)導和山東省民間組織管理局監(jiān)督和管理，掛靠在山東農(nóng)業(yè)大學。學會現(xiàn)已換屆八次，下屬16個專業(yè)委員會，有個人會員3150人，單位團體會員16個，個人會員中有高級會員98人，女性會員267人。學會自成立以來進行了大量的學術(shù)活動和科普工作，為山東乃至全國的畜牧業(yè)發(fā)展做出了積極的貢獻，因此，連續(xù)15年被山東省科協(xié)評為“先進省級學會”，并獲得“學會之星”榮譽稱號。本會2011年在中國畜牧獸醫(yī)學會等十三屆代表大會上被評為“先進集體”。

S858.92

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1007-1733(2017)04-0062-04

2016–12–14）