Xpert Mtb/RIF技術在結核性腦膜炎診斷中的應用

范秀博，閆菊娥，李毓新，吉智，李妍

(1西安交通大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生學院，西安710061；2西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院；3陜西省結核病防治研究所)

Xpert Mtb/RIF技術在結核性腦膜炎診斷中的應用

范秀博1,2，閆菊娥1，李毓新2，吉智2，李妍3

(1西安交通大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生學院，西安710061；2西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院；3陜西省結核病防治研究所)

目的探討利福平(RIF)耐藥實時熒光定量核酸擴增技術，即Xpert 結核分枝桿菌(Mtb)/RIF 技術在結核性腦膜炎診斷中的應用價值。方法分別采用抗酸染色法、培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術對34例核性腦膜炎、43例疑似結核性腦膜炎、20例非結核性腦膜炎患者的腦脊液進行Mtb檢測。結果34例結核性腦膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為1、2、8例，陽性率分別為2.94%、5.88%、23.53%；抗酸染色法與培養(yǎng)法檢測陽性率相比，Pgt;0.05；培養(yǎng)法與Xpert Mtb/RIF技術檢測陽性率相比，Plt;0.05；Xpert Mtb/RIF技術與抗酸染色法檢測陽性率相比，Plt;0.05。43例疑似結核性膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為0、1、6例，陽性率分別為0、2.33%、13.95%；抗酸染色法與培養(yǎng)法檢測陽性率相比，P=0.5；培養(yǎng)法與Xpert Mtb/RIF技術檢測陽性率相比，Pgt;0.05；Xpert Mtb/RIF技術與抗酸染色法檢測陽性率相比，Plt;0.05。20例非結核性腦膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術均未檢測到Mtb。結論Xpert Mtb/RIF技術檢測腦脊液中的Mtb更有助于結核性腦膜炎的診斷。

核酸擴增技術；Xpert結核分枝桿菌/利福平技術；結核分枝桿菌；結核性腦膜炎；腦脊液

結核病是一個重要的全球性問題。在我國，結核病患者的死亡率僅低于艾滋病患者的死亡率，結核病已成為第二大傳染病[1]。2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，全國活動性肺結核患者高達499萬例，每年新發(fā)肺結核患者約100萬例[2]。結核病的臨床表現(xiàn)形式多樣，不但包括肺結核還包括肺外結核，而肺外結核中又以結核性腦膜炎最為常見，占結核病的0.5%～1.0%[3]。結核性腦膜炎是由結核分枝桿菌(Mtb)通過淋巴系統(tǒng)或血液系統(tǒng)播散入腦而引起的腦膜、脊膜的慢性非化膿性炎癥。由于結核性腦膜炎的致死率、致殘率非常高，迫切需要一種能快速、準確檢測Mtb的方法，以便于結核性腦膜炎的及時確診。目前，國內外有文獻[4～7]報道了利福平(RIF)耐藥實時熒光定量核酸擴增技術，即Xpert Mtb/RIF 技術在肺結核和肺外結核診斷方面的應用。本研究采用Xpert Mtb/RIF技術對部分結核性腦膜炎、疑似結核性腦膜炎患者腦脊液中的Mtb進行檢測，同時用抗酸染色涂片和培養(yǎng)法對受檢標本標本進行檢測，并對檢測結果進行對比分析，探討Xpert Mtb/RIF技術在結核性腦膜炎診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2014年4月～2016年4月西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院收治的結核性腦膜炎患者34例、疑似結核性腦膜炎患者43例、非結核性腦膜炎患者20例，其中男63例、女34例，年齡13～79歲。 結核性腦膜炎的診斷標準[8]：既往有結核病病史，急性或亞急性起病，慢性遷延性病程，出現(xiàn)頭痛、嘔吐等顱內壓增高癥狀和腦膜刺激征，腦脊液壓力明顯增高、淋巴細胞增多、氯化物和糖含量減低，影像學檢查見顱底腦膜及側裂池呈點狀或團塊狀明顯強化，伴有腦積水等改變。43例疑似結核性腦膜炎患者包括腦梗死13例、癲癇9例、腦積水6例、腦炎15例。20例非結核性腦膜炎患者包括病毒性腦膜炎8例、化膿性腦膜炎12例。

1.2 腦脊液Mtb檢測及藥敏試驗方法 所有受檢者于治療前留取腦脊液，分別用抗酸染色法、培養(yǎng)法及Xpert Mtb/RIF技術檢測Mtb，培養(yǎng)出的菌株做RIF平藥敏試驗。

1.2.1 Mtb檢測 ①抗酸染色鏡檢Mtb：采用離心濃縮法[9]處理腦脊液，腦脊液標本靜置2～4 h，取沉淀部分30 mL并置50 mL的無菌螺旋蓋離心管中，3 000 g離心20 min。棄上清，取沉淀物涂片。自然干燥，用火焰固定2～3次。采用萋尼抗酸染色法染色(萋尼氏染色液購自中國珠海貝索生物技術有限公司)并于鏡下觀察結果。根據(jù)涂片Mtb含量的多少[9]判為4+、3+、2+、1+、1～8條/300個視野、陰性6級(其中前5級判為陽性)。②培養(yǎng)法檢測Mtb：采用中和離心法[9]處理腦脊液，腦脊液標本靜置2～4 h，取沉淀部分30 mL并置50 mL的無菌螺旋蓋離心管中，3 000 g離心20 min。棄上清，保留重懸沉淀物于5 mL滅菌生理鹽水中，加入1～2倍體積的4% NaOH消化液，渦旋振蕩30 s，靜置15 min后在生物安全柜內打開螺旋蓋，加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，0.067mol/L)至40 mL，3 000 g離心20 min，棄上清，加入1～2 mL磷酸鹽緩沖液，混懸，接種。接種時以無菌吸管吸取上述處理液0.1 mL，均勻接種在2支羅氏培養(yǎng)基(購自中國珠海貝索生物技術有限公司)斜面上，保持斜面水平向上37 ℃培養(yǎng)24 h后，直立放置37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。接種后第3、7天觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察1次，并在分離培養(yǎng)結果記錄本上記錄Mtb生長結果。根據(jù)菌落生長占培養(yǎng)基斜面的比例[9]分為++++、+++、++、+、實際菌落數(shù)、陰性6級(其中前5級判為陽性)。③Xpert Mtb/RIF技術檢測Mtb：Gene Xpert Dx儀器、 Gene Xpert Mtb/RIF Cartridge檢測盒及SR(sample reagent)購自美國Cepheid公司。取1 mL腦脊液標本加入前處理管中，然后加入2倍標本體積的SR標本處理液，渦旋振蕩15～30 s，靜置15 min，使標本充分液化。打開反應盒，取2 mL處理后樣品由加樣孔緩慢加入反應盒，然后將反應盒放入檢測模塊，儀器開始進行自動化檢測。反應結束后，在檢測系統(tǒng)窗口下可直接觀察結果。GeneXpert Mtb/RIF系統(tǒng)以Mtb DNA拷貝的高低分為高、中、低、極低和未檢出5級(其中前4級判為陽性)。

1.2.2 藥敏試驗及菌種鑒定 藥敏試驗所用培養(yǎng)基均購自中國珠海貝索生物技術有限公司。采用比例法[11]。用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對制成1mg/mL菌懸液，梯度稀釋為10～2 mg/mL和10～4 mg/mL，接種到含RIF(40 μg/mL)的羅氏固體培養(yǎng)基和空白對照管培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4周，觀察結果。每批藥敏試驗用H37Rv作為敏感對照，以評價含藥培養(yǎng)基質量；若對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于20個，則重復試驗。菌種鑒定與藥敏試驗同時進行，將1 mg/mL的菌懸液進行100倍稀釋，接種0.1 mL于對硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鑒別培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結果。耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上生長的的菌落數(shù))×100%，耐藥百分比lt;1%為受試菌對該藥敏感、≥1%為受試菌對該藥耐藥。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。率的比較用χ2檢驗、校正χ2檢驗和確切概率法。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

34例結核性腦膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為1、2、8例，陽性率分別為2.94%、5.88%、23.53%；抗酸染色法與培養(yǎng)法檢測陽性率相比，χ2= 0.00，Pgt;0.05；培養(yǎng)法與Xpert Mtb/RIF技術檢測陽性率相比，χ2=4.22，Plt;0.05；Xpert Mtb/RIF技術與抗酸染色法檢測陽性率相比，χ2=4.61，Plt;0.05。

43例疑似結核性膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為0、1、6例，陽性率分別為0、2.33%、13.95%；抗酸染色法與培養(yǎng)法檢測陽性率相比(確切概率法)，P=0.5；培養(yǎng)法與Xpert Mtb/RIF技術檢測陽性率相比，χ2=2.49，Pgt;0.05；Xpert Mtb/RIF技術與抗酸染色法檢測陽性率相比，χ2=4.48，Plt;0.05。

20例非結核性腦膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術均未檢測到Mtb。

34例結核性腦膜炎患者、43例疑似結核性膜炎患者、20例非結核性腦膜炎患者腦脊液用抗酸染色法、培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為11、7、0例，陽性率分別為32.35%、16.28%、0；結核性腦膜炎與疑似結核性膜炎患者相比，χ2=2.74，Pgt;0.05；疑似結核性腦膜炎和非結核性腦膜炎患者相比，χ2=2.20，Pgt;0.05；結核性腦膜炎與非結核性腦膜炎患者相比，χ2=6.25，Plt;0.05。

所有受檢對象的腦脊液通過培養(yǎng)，3例發(fā)現(xiàn)陽性菌株，菌種初步鑒定均為Mtb，比例法藥敏試驗結果均為RIF敏感。同時，3例經過Xpert Mtb/RIF技術檢測為RIF敏感。二種方法檢測結果一致。

3 討論

由于結核性腦膜炎患者病情輕重程度不同、就診階段不同、臨床表現(xiàn)多樣，加之腦脊液實驗室檢查特征性結果較少，導致確診結核性腦膜炎的難度較大。因此，腦脊液中檢測出Mtb仍然是確診結核性腦膜炎的金標準和重要手段。目前，用于結核性腦膜炎診斷的方法有腦脊液抗酸染色法和培養(yǎng)法，前者容易漏檢，后者出結果時間長(1～2個月)。隨著分子生物學手段的不斷發(fā)展，越來越多的新診斷技術應用于臨床，Xpert Mtb/RIF技術便是其中之一。該技術只需手工加入已處理的待測樣本，其余均由儀器自動操作判讀是否為Mtb及其是否對RIF耐藥，整個流程僅需 2 h。本研究利用Xpert Mtb/RIF技術檢測結核性腦膜炎患者的腦脊液標本，并與傳統(tǒng)的抗酸染色法、培養(yǎng)法相比較，探討其在結核性腦膜炎診斷中的應用價值。

Xpert Mtb/RIF檢測技術是一種半巢氏實時熒光定量PCR體外診斷技術，可對Mtb以及其RIF耐藥性進行檢測。該技術針對Mtb的rpoB基因81bp的RIF耐藥決定區(qū)序列設計引物、探針，可以檢測rpoB基因是否發(fā)生突變，從而判斷受檢標本是否對RFP耐藥[9]。據(jù)報道[10]，通常需Mtb達5 000 CFU/mL時抗酸染色法才能得到陽性結果，Xpert Mtb/RIF技術的臨床檢出限為131 CFU/ mL[11]。在本研究中，采用Xpert Mtb/RIF技術檢測結核性腦膜炎與疑似結核性腦膜炎患者的腦脊液，Mtb陽性檢出率分別為23.53%、13.95%，均高于抗酸染色法(2.94%、0)和培養(yǎng)法(5.88%、2.33%)的檢出率，與鄒月麗等[12]報道確診結核性腦膜炎組的23.68%和可能結核性腦膜炎組的18.18%接近。所有受檢者Xpert Mtb/RIF技術陽性檢出率為14.43%(14/97)，低于Tortoli等[7]報道的84.6%，其原因可能有以下幾點：①入選者腦脊液標本本身含菌量較低；②腦脊液標本中存在某些抑制因子；③入選的病例數(shù)較少。

本研究中有3例腦脊液培養(yǎng)陽性，菌種初步鑒定均為Mtb，比例法藥敏試驗和Xpert Mtb/RIF技術監(jiān)測均顯示其對RIF敏感，結果一致率為100%，高于筆者之前的研究結果[13]。此次試驗由于腦脊液標本數(shù)量有限，加之培養(yǎng)法陽性率較低，最終可以和Xpert Mtb/RIF技術檢測結果作比較的RIF敏感/耐藥的結果較少。

近幾年，世界衛(wèi)生組織及國家結核病參比實驗室推薦了多種結核菌快速檢測技術，如Xpert Mtb/RIF技術、CPA 恒溫技術、LAMP 恒溫技術等，使得結核病的診斷更加快速、準確、簡便。這些技術對痰標本具有較高的診斷價值，對于含菌量較低的肺外標本更具臨床意義。Xpert Mtb/RIF技術對Mtb的陽性檢出率明顯高于其他檢測方法，大大提高了其病原學診斷率，具有特異性強、敏感度高、快速、簡便，且能同時檢測出Mtb是否對RIF耐藥等特點，在結核性腦膜炎的診斷和治療中具有重要的應用價值，可在資源豐富的地區(qū)作為一種常規(guī)方法大力推廣，使其在肺外結核病的診療中發(fā)揮重要作用。

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閆菊娥(E-mail： 55709810@qq.com)

2017-05-31)