哺乳動物克隆技術(shù)研究進(jìn)展

張榮華，王 曦，李武峰

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

哺乳動物克隆技術(shù)研究進(jìn)展

張榮華1，2，王 曦2，李武峰1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

自首例克隆羊“多莉”誕生以來，哺乳動物克隆技術(shù)研究就廣受關(guān)注，應(yīng)用此技術(shù)已獲得了小鼠、水牛以及家兔等動物?？偨Y(jié)了近年來克隆過程中的關(guān)鍵技術(shù)和獲得的研究成果，不僅更進(jìn)一步了解了胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長等生物現(xiàn)象，同時也為將來解決克隆中存在的問題，如成功率低、胎盤肥大、重編程異常、出生死亡率高等奠定了理論基礎(chǔ)，開拓了新的思路。隨著哺乳動物克隆技術(shù)的迅速發(fā)展，其在多個領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，如利用克隆技術(shù)進(jìn)行快速大規(guī)模的品種改良、有效地保護(hù)瀕危動植物，并可將核移植技術(shù)應(yīng)用于疾病的治療，通過克隆生物反應(yīng)器生產(chǎn)所需的物質(zhì)，具有重要的實踐意義。

哺乳動物；克隆技術(shù)；胚胎重組

希臘語“klon”就是克隆，指用小枝丫去增殖，開始于植物學(xué)[1]。動物克隆廣義上講是指動物的無性繁殖，18世紀(jì)興起了微生物學(xué)，科學(xué)家們觀察到低等動物一般通過分裂、出芽和斷裂3種方式進(jìn)行繁殖，這些都是“克隆”——無性繁殖[2]。目前人們研究的克隆是人為干預(yù)的無性繁殖。此技術(shù)發(fā)展至今，可用胚胎細(xì)胞或體細(xì)胞進(jìn)行克隆而獲得個體。具體的克隆大致可分為細(xì)胞核移植[3]和胚胎分割[4]2種。通常人們所謂的哺乳動物克隆是指前一種，并且也獲得了很多克隆動物。

克隆試驗的成功無論是在理論還是應(yīng)用方面都具有重大意義。理論上，它打破了傳統(tǒng)思維，即動物細(xì)胞的生長、分化是不可逆的。證實了已分化的體細(xì)胞核與受精卵相似，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以恢復(fù)其全能性，發(fā)育成為新的個體。同時，此理論為遺傳學(xué)、基因表達(dá)調(diào)控等方面提供了新的思路。應(yīng)用上，克隆技術(shù)可以加快優(yōu)良家畜品種的繁殖。自然繁殖時，優(yōu)良家畜都是經(jīng)過多次雜交、基因重組產(chǎn)生的。此過程耗時長，成本高，工作量大，而且因基因突變導(dǎo)致優(yōu)良性狀消失的概率大。而利用體細(xì)胞克隆技術(shù)則可解決以上問題。此外，克隆技術(shù)可以用于保護(hù)瀕危動物，通過構(gòu)建基因庫，利用克隆擴(kuò)大動物的群體。在醫(yī)學(xué)研究方面，利用克隆技術(shù)培育器官，避免了排異性，提高了安全性且可以保證大量供應(yīng)。

本文介紹了目前克隆技術(shù)各過程的主要方法與存在的問題，并指出進(jìn)一步的研究方向。

1 哺乳動物克隆研究進(jìn)展

1.1 哺乳動物胚胎克隆

胚胎克隆即采用專門的方法和技術(shù)建立胚胎的無性繁殖系，以獲得具遺傳同質(zhì)性動物（克隆動物）的過程。胚胎克隆從廣義來講，可分為胚胎分割以及細(xì)胞核移植，狹義的即胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)。該技術(shù)是將早期胚胎細(xì)胞的細(xì)胞核或卵裂球，通過融合、激活和體外培養(yǎng)等方法，移植到去核卵母細(xì)胞中，構(gòu)成新合子，然后移植給受體。此生物技術(shù)所獲得的后代將與核供體基因型相同[5]。提出胚胎克隆的理論基礎(chǔ)是胚胎細(xì)胞與受精卵一樣，都具有發(fā)育全能性。但因為早期試驗條件有限，且哺乳動物的受精過程在體內(nèi)發(fā)生，所以，首次胚胎細(xì)胞核移植成功是在1952年BRIGGS等[6]研究的兩棲類動物——美洲豹蛙。隨后體外受精兔也獲得成功，為哺乳動物胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

1.2 哺乳動物胚胎干細(xì)胞的核移植技術(shù)

胚胎干細(xì)胞是一種可分化成多種功能型細(xì)胞的細(xì)胞類型[7]。目前，從組織中已分離出了胚胎干細(xì)胞（ES）和成體干細(xì)胞。其中，胚胎干細(xì)胞是從早期胚胎中分離出的高度未分化、具有發(fā)育全能性和多能性的一類細(xì)胞[8]。ES細(xì)胞的多能性是指它具有發(fā)育成為不止一種細(xì)胞或組織的能力。ES細(xì)胞的全能性概念是它可以在某條件下去分化，再生為機(jī)體內(nèi)的各組織甚至可發(fā)育成完整個體的能力[9]。

根據(jù)以上的理論基礎(chǔ)，動物克隆的方法之一就是胚胎干細(xì)胞核移植技術(shù)[10]。研究者們用ICM細(xì)胞為供體構(gòu)成克隆胚，發(fā)育成正常仔鼠。CAMPBELL等[11]將ES細(xì)胞傳至3代后進(jìn)行核移植，也獲得4只綿羊。另外，此方法在兔、山羊和牛等動物上都取得了進(jìn)展，但此技術(shù)仍不成熟，尚待進(jìn)一步研究[12]。

1.3 哺乳動物體細(xì)胞的核移植技術(shù)

體細(xì)胞核移植技術(shù)（SCNT）是將一個動物的體細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞中，重構(gòu)克隆胚，發(fā)育為與供體動物細(xì)胞基因完全相同的后代[13]。

早期人們認(rèn)為，細(xì)胞的分化程度越高，其全能性越差，甚至已高度分化的體細(xì)胞則完全喪失全能性。因此，人們的研究集中在胚胎干細(xì)胞上。直到BRINSTER[14]研究發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞可脫分化抑制重新發(fā)育分化，打破了以往的觀念。而體細(xì)胞的核移植研究技術(shù)是在1997年WILMUT等[15]宣布世界首例體細(xì)胞克隆綿羊“多莉”誕生，才變成焦點。應(yīng)用此技術(shù)已成功獲得了大鼠、兔、騾子、馬、水牛、歐洲盤羊[16]和非洲野貓等動物。同時，此技術(shù)還可保護(hù)珍稀的瀕臨滅絕的動物，例如雪貂[17]。

SCNT技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，如加速繁殖優(yōu)良畜種，培育轉(zhuǎn)基因品種[18]，利用克隆技術(shù)治療疾病[19]，保護(hù)瀕危物種等。但總的來說效率很低。KISHIGAMI等[20]研究指出，利用SCNT技術(shù)克隆出的動物常有異常，如胎盤肥大、胎兒患呼吸疾病等問題，且克隆動物成活率僅為2%?，F(xiàn)在許多學(xué)者正努力探究著影響體細(xì)胞克隆成功率的因素，如核供體、核受體、供受體間的相互作用及核移植操作技術(shù)等。

2 核移植的受體細(xì)胞選擇與去核

2.1 核移植受體細(xì)胞的選擇

克隆技術(shù)的第一步就是選擇受體細(xì)胞。早期人們使用去核受精卵，但因為受精卵已被激活，重編程能力差，所以，越來越多的試驗使用MⅡ期成熟卵母細(xì)胞為受體。這是因為MⅡ期的卵母細(xì)胞周期長，并且去分化的必備因子——MPF活性高，對供體細(xì)胞核的重新編程更有利[21]。

WILLADSEN[22]第1次用去核的成熟卵母細(xì)胞作受體，獲得了克隆綿羊。之后CHESNé等[23]先將卵母細(xì)胞注射HCG，再培養(yǎng)16 h用作受體，囊胚率為47%，并得到了胚胎克隆兔。陳大元等[24]將卵母細(xì)胞培養(yǎng)大約19 h，選擇第一極體剛形成的做胞質(zhì)受體，囊胚率約26.63%，并獲得克隆牛。

同樣，MⅡ期卵母細(xì)胞做核受體前，進(jìn)行激活或未激活的結(jié)果也大不相同。研究證明，在激活后的卵母細(xì)胞中，成熟促進(jìn)因子濃度降低，不足以支持重構(gòu)胚的發(fā)育。所以，大多采用未激活的MⅡ期卵母細(xì)胞作為核受體。

許多試驗發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)、外成熟的卵母細(xì)胞也有差異。當(dāng)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)成熟時，用此細(xì)胞做核受體，克隆成功率大大提高。如牛、豬、羊等的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)較成熟，所以，成功克隆的案例較多。但很多物種的體外培養(yǎng)技術(shù)還不夠完善，需進(jìn)一步研究。

2.2 核移植受體細(xì)胞的去核

受體細(xì)胞的去核技術(shù)對核移植至關(guān)重要，主要有以下幾種去核方法。

2.2.1 盲吸去核法 此方法是除去第一次減數(shù)分裂后卵母細(xì)胞形成的紡錘體。此時紡錘體在第一極體下方，除去第一極體以及下方約1/4的胞質(zhì)，以達(dá)到去核的目的。但目前只有鼠卵母細(xì)胞可以觀察到紡錘體，因此，稱為盲吸法[25]。此方法可以避免熒光染料和紫外照射對卵母細(xì)胞不利的影響。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，兔的紡錘體不一定在第一極體下方，可能位于對面，造成盲吸法的效率降低。所以，人們逐漸放棄使用盲吸法去核。

2.2.2 半卵去核法 其是先在極體上部做切口，再從切口處吸出第一極體及1/2的胞質(zhì)，最后熒光染料Hoechst33342確認(rèn)。但由于卵母細(xì)胞胞質(zhì)減少而且熒光染料對核受體有不利影響[26]，所以，該去核法使用很少。

2.2.3 切割去核法 它是對半卵去核法的改進(jìn)。具體方法：沿極體與卵母細(xì)胞相交處，將卵母細(xì)胞平分，將無極體附著的半卵作為核移植受體細(xì)胞[27]。此方法操作的基礎(chǔ)是卵母細(xì)胞與第一極體黏著在一起，并無透明帶，卵母細(xì)胞要用植物凝集素（PHA）和鏈霉蛋白酶預(yù)處理。此方法的優(yōu)點是去核率高，甚至可達(dá)90%，沒有熒光染料和紫外照射的影響[28]。最具有商業(yè)意義的是該法在體視顯微鏡下就可完成。

2.2.4 高速離心去核法 此方法的原理是卵母細(xì)胞的細(xì)胞核、質(zhì)與極體的質(zhì)量不同，不同轉(zhuǎn)速可使細(xì)胞核與極體一同離心排出。具體過程：將卵母細(xì)胞用含有細(xì)胞松弛素B的培養(yǎng)液培養(yǎng)，梯度離心后取約1/3的部分作為核受體胞質(zhì)。它的優(yōu)點是可一次性處理大量核受體，但還未得到克隆后代，有待進(jìn)一步驗證。

2.2.5 化學(xué)誘導(dǎo)去核 該方法可一次性制備大量的卵母細(xì)胞，并對操作的技能要求較低，造成的機(jī)械性傷害小[29]。方法是先將MⅡ期卵母細(xì)胞激活，再在成熟液中添加抑制劑脫羰秋水仙堿，使其排放第二極體。此化學(xué)物質(zhì)使核染色質(zhì)進(jìn)入第二極體，從而去核。但大量的試驗表明，此方法去核率僅為54%，除了小鼠和豬外，未獲得其他克隆動物。

此外，還有功能性去核法，它利用的是紫外線或激光照射使核變性，從而達(dá)到去核目的[30]；擠壓法是指在卵母細(xì)胞發(fā)育的過程中，當(dāng)多數(shù)的卵母細(xì)胞準(zhǔn)備排出第一極體時，破壞透明帶并擠壓，使極體與尚未分離的核一同排出。

同時，為了能夠精確去核，利用卵母細(xì)胞MⅡ期染色體是由紡錘體連接在赤道板上的原理[31]，通過尋找紡錘體定位染色體。所以，研究者發(fā)現(xiàn)了幾種示核法。熒光染料法是使用熒光染料Hoechst 33342處理卵母細(xì)胞后，可通過紫外線觀察到極體與卵母細(xì)胞中期板的相對位置，從而協(xié)助去核成功。但染料和紫外線都會對卵母細(xì)胞有一定的不利影響，從而妨礙胚胎發(fā)育成熟。極化顯微鏡法是利用構(gòu)成紡錘體的蛋白有極性的特點，設(shè)計了極化顯微鏡，可在普通光路下觀察到極體和中期板。由于它破壞性小，很多核移植試驗采用此方法。

3 核移植供體細(xì)胞的選擇與分離

3.1 哺乳動物核移植中供體細(xì)胞的選擇

大量研究表明，不同的供體細(xì)胞類型適用于不同的物種。供體細(xì)胞大致分為胚胎分裂球、胚胎干細(xì)胞（ES）和體細(xì)胞。首例克隆成體的綿羊多莉，使用的供體細(xì)胞是乳腺上皮細(xì)胞。另外，皮膚成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和一些器官細(xì)胞等體細(xì)胞都已被證實可用做核供體細(xì)胞。相同的試驗條件下，成體干細(xì)胞作為供體的胚胎發(fā)育率比分化完全的體細(xì)胞高5～10倍，說明外遺傳修飾作用會促使分化成各種表型細(xì)胞，影響克隆的成功率。

供體細(xì)胞的發(fā)育周期也是重要因素，不同時期，核內(nèi)的DNA含量不同，使得核移植效率也大不同。WILMUT等[15]研究認(rèn)為，血清饑餓法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入并停留在G0期，才能得到克隆羊多莉。但KUES用0.2%的血清對豬胎兒成纖維細(xì)胞饑餓處理5 d后，細(xì)胞凋亡率約為40%[32]。LAI用秋水仙素處理供體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重組胚中排出極體的細(xì)胞大多來自G2/M期，少數(shù)來自G0/G1期。隨后愈來愈多的研究者認(rèn)為，G0/G1期的細(xì)胞并不是克隆成功的必備條件[33]。

有研究表明，細(xì)胞培養(yǎng)的傳代數(shù)也影響著克隆結(jié)果。ROH等[34]發(fā)現(xiàn)，早期細(xì)胞（8～16代）比晚期細(xì)胞（17～32代）有利于克隆，因為培養(yǎng)時間越長，供體細(xì)胞內(nèi)染色體的畸形率越高。而CAPECCHI則認(rèn)為，長時間的傳代培養(yǎng)可以增加細(xì)胞數(shù)量，并且減少以后發(fā)生基因修飾的機(jī)會，利于核移植[33]。后來經(jīng)大量試驗證實，10代左右最好，盡量少于15代。

除了以上的因素，供體細(xì)胞仍有許多因素影響著克隆效率，如動物年齡等。

3.2 核移植中供體細(xì)胞的分離

將合適的供體細(xì)胞分離成單個細(xì)胞是制備供體細(xì)胞的過程之一。胚胎未發(fā)生致密化時，去除透明帶后進(jìn)行吹打，即可得到分散的卵裂球。隨后發(fā)現(xiàn)用不含Ca2+，Mg2+的培養(yǎng)液短時間處理供核細(xì)胞，或用胰蛋白酶消化、免疫外科、顯微外科等方法也可分離供體細(xì)胞。但當(dāng)胚胎細(xì)胞連接變緊密，形成橋粒，發(fā)生了致密化緊縮后，就無法用常規(guī)方法分離，增加了很大的難度。

4 核移植與激活

4.1 核移植的方法

4.1.1 細(xì)胞融合法 誘導(dǎo)融合最早使用的是滅活后的仙臺病毒，但其毒性大，融合率不穩(wěn)定。后來研究者使用毒性相對較小的聚乙烯乙二醇（PEG）融合，但融合效率低，無法推廣。直到WILLADSEN[22]利用直流電誘導(dǎo)細(xì)胞融合，此方法效率高，更安全穩(wěn)定，被廣泛使用。

4.1.2 細(xì)胞注入法 此方法是第一次成功克隆哺乳動物采用的胚胎重建法。但由于對受體細(xì)胞損傷太大，進(jìn)行了改良。改進(jìn)后先用細(xì)玻璃針把供體細(xì)胞的細(xì)胞膜弄破，將供體核注入到受體細(xì)胞內(nèi)。而且發(fā)現(xiàn)將供體細(xì)胞注入受體細(xì)胞內(nèi)再將核吸出，更利于重建后的發(fā)育。目前，最先進(jìn)的胞質(zhì)內(nèi)注射儀器是Piezo，可以很大程度上減小傷害[35]。

除了以上2種主要的核移植方法，利用激活抑制劑（MG132）、四倍體囊胚腔、去除透明帶等方法都成功進(jìn)行了核移植。

4.2 克隆胚胎的激活

激活是使克隆胚胎進(jìn)一步發(fā)育的必經(jīng)過程，原因是未激活的卵母細(xì)胞中成熟促進(jìn)因子（MPF）濃度較高，導(dǎo)致它停留在MⅡ期階段[36]。在受精過程中，精子的進(jìn)入導(dǎo)致卵母細(xì)胞中Ca2+周期性波動，當(dāng)Ca2+濃度升高時伴隨MPF濃度降低。基于此，研究者們發(fā)現(xiàn)了2條激活思路分別為產(chǎn)生Ca2+波動和降低MPF的水平。

激活方法分為物理激活和化學(xué)激活。物理激活又包括機(jī)械法、溫度變化刺激和電激活等。很多細(xì)胞通過機(jī)械刺激得到激活，如豬、牛等，但很少得到囊胚。溫度變化激活是指用溫度刺激卵母細(xì)胞，最早使用于兔的未受精卵，在10℃處理后發(fā)現(xiàn)其中的18%發(fā)育為囊胚[37]。需注意的是，溫度激活的時間不可過長，否則會影響細(xì)胞活性。電激活是利用直流高壓電脈沖，在細(xì)胞膜上造成可恢復(fù)微孔，使融合液中的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，升高其濃度。雖然電脈沖無法形成Ca2+濃度波動，只能瞬間性的升高，但少次的電脈沖就可激活大部分的卵母細(xì)胞[38]。電刺激的使用最為廣泛，1989年，ONODERA等[39]開始對兔卵母細(xì)胞使用，一直到現(xiàn)在，小鼠、牛、豬等卵母細(xì)胞都成功激活。

化學(xué)激活包括乙醇、Ca2+載體和IP3等。激活不同物種的卵母細(xì)胞可以用無特異性、不同濃度的乙醇介導(dǎo)。它的原理是在細(xì)胞膜上形成三磷酸肌醇（IP3），促使細(xì)胞內(nèi)存儲的Ca2+釋放，引發(fā)濃度波動[40]。Ca2+載體是一類很有效的化學(xué)激活物。使用Ca2+載體——A23187激活小鼠卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在無Ca2+的培養(yǎng)液中激活率比含Ca2+培養(yǎng)液中更高，說明Ca2+載體可增強(qiáng)胞質(zhì)內(nèi)存儲的Ca2+釋放，且抑制蛋白質(zhì)合成[41]。IP3是另一種引發(fā)Ca2+波動的物質(zhì)，與受精過程更相似。但I(xiàn)P3只能對卵母細(xì)胞激發(fā)，對原核期胚胎無作用，所以，需要與其他物質(zhì)一同激活。

由于僅使用單一方法激活并不徹底，所以，多數(shù)試驗采用聯(lián)合方法。PARRISH等[42]用6-DMAP方法結(jié)合電脈沖對牛卵母細(xì)胞激活，使其發(fā)生有絲分裂。MITALIPOV等[43]用IP3和6-DMAP聯(lián)合方法激活兔卵母細(xì)胞，成功激活84%卵母細(xì)胞。大多數(shù)的融合-激活是先進(jìn)行2次電脈沖后再使用化學(xué)試劑激活。

5 胚胎的體外培養(yǎng)及胚胎移植

核移植后進(jìn)行科學(xué)的胚胎體外培養(yǎng)是提高克隆效率的重要步驟。目前的技術(shù)無法完全模擬胚胎在體內(nèi)的發(fā)育環(huán)境[44]，但科學(xué)的體外培養(yǎng)條件也可以大大降低胚胎死亡率，提高穩(wěn)定性。影響體外培養(yǎng)環(huán)境的因素很多，如培養(yǎng)環(huán)境的氣體濃度，低氧氣濃度可提高胚胎的發(fā)育能力。還有體外培養(yǎng)時間，試驗發(fā)現(xiàn)，豬和兔培養(yǎng)24 h后移植受體體內(nèi)最佳，而牛、羊等家畜則所需時間更長[45]。影響因素中最重要的一個是培養(yǎng)液的選擇。目前體外培養(yǎng)液大約有3種，一是簡單型培養(yǎng)液，含有基礎(chǔ)培養(yǎng)液和牛血清白蛋白、胎牛血清；二是復(fù)雜培養(yǎng)液，在簡單型培養(yǎng)基中添加了維生素、嘌呤、TCM199等營養(yǎng)成分；三是共培養(yǎng)液，因為適量的體細(xì)胞可除去不利影響因子，所以，在簡單培養(yǎng)液中加部分飼養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)了胚胎發(fā)育。除了以上因素，胚胎質(zhì)量、重構(gòu)程序、受體供體發(fā)展階段等都是影響體外胚胎培養(yǎng)的因素。

體外培養(yǎng)后，通過手術(shù)移植或非手術(shù)移植將胚胎植入受體動物。

6 克隆技術(shù)存在的問題

6.1 成功率低

克隆成功率僅為1%～3%的原因有很多。一是妊娠早期易流產(chǎn)；二是胎盤發(fā)育異常；三是懷孕周期長、體質(zhì)弱導(dǎo)致難產(chǎn)、出生后死亡率高。四是表觀修飾異常，導(dǎo)致基因重組排列，增加了胎兒發(fā)育異常或死亡[46]。

6.2 端粒酶活性問題

端粒對保護(hù)染色體至關(guān)重要，每次細(xì)胞復(fù)制，端粒核苷酸就會減少50～100 bp。而端粒的產(chǎn)生則需端粒酶，它決定著細(xì)胞的活性大小。SHIELS等[47]研究發(fā)現(xiàn)，造成克隆羊多莉壽命短的原因是它的端粒比同齡羊要短。但也有研究證明并非都如此，如克隆牛[48]。甚至克隆鼠的端粒比正常鼠的還要長，平均壽命也延長了7個月[49]。因此，研究者認(rèn)為，動物的端粒酶活性應(yīng)該是可控的。

另外，還存在供體與受體細(xì)胞發(fā)育周期不完全一致、線粒體來源不確定和基因印記擾亂等問題，有待于對細(xì)胞活動及相關(guān)技術(shù)深入研究。

7 克隆技術(shù)的發(fā)展前景

哺乳動物克隆不僅僅為生物學(xué)帶來了新的探究領(lǐng)域，更為醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)等提供了新的方法思路，應(yīng)用前景十分廣闊。

在生物學(xué)領(lǐng)域上克隆涉及學(xué)科廣泛，如細(xì)胞學(xué)、胚胎發(fā)育學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳修飾學(xué)等，可加深對細(xì)胞發(fā)育、全能多能性和核質(zhì)相互關(guān)系等基本問題的認(rèn)識。醫(yī)學(xué)家將克隆技術(shù)應(yīng)用于治療，從病人體內(nèi)取體細(xì)胞，植入去核的細(xì)胞中重建，最后分化成所需的類型用于治療，有助于人們探究腫瘤、細(xì)胞衰老等疾病。同時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器可以用于生產(chǎn)所需的藥物蛋白，并降低成本。還可以與生物反應(yīng)器相結(jié)合，進(jìn)行基因修飾后，利用膀胱、乳腺等動物器官生產(chǎn)所需的蛋白，提高轉(zhuǎn)基因技術(shù)的效能。在畜牧業(yè)方面，克隆技術(shù)可以快速的選育優(yōu)良品種，并且大量擴(kuò)增遺傳性狀優(yōu)良的動物。克隆技術(shù)亦可促進(jìn)瀕危物種的擴(kuò)繁和保存，減少科學(xué)研究中所需試驗動物的數(shù)量，如歐洲盤羊。

8 結(jié)語

在哺乳動物克隆過程中，選擇科學(xué)合理的技術(shù)可以大大的提高成功率。但有些克隆步驟仍不夠完善，克隆結(jié)果存在一定的缺陷，如胎盤肥大、基因異常、生產(chǎn)率低等。隨著克隆技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，它的過程與機(jī)制會徹底清晰，更好的提高應(yīng)用價值。

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Research Progress of Mammalian Cloning Technology

ZHANGRonghua1，2，WANGXi2，LIWufeng1

（1.College ofLife Science，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China；2.Institute ofAnimalHusbandry and Veterinary，ShanxiAcademy ofAgriculturalSciences，Taiyuan 030032，China）

Since the birth ofthe firstcloned sheep"Dolly",mammalian cloning technology has attracted much attention.Using this technology,mouse,buffalo,rabbits and other animals had been obtained.In this paper,the key techniques and achievements ofcloning in recent years were summarized,which was not only to further understand the embryonic development,cell growth and other biological phenomena,for the future to solve the problems in cloning,such as low success rate,placentalhypertrophy,reprogramming abnormalities, high mortality and lay the theoreticalbasis,opened up new ideas.And with the rapid developmentof mammalian cloning technology,it had a good prospectin many fields.Such as the use ofcloning technology for rapid and large-scale varieties ofimproved,optimized and effective protection of endangered plants and animals,and nuclear transplantation technology for the treatment of diseases,cloning bioreactorproduction ofthe required material,has a very significantpracticalsignificance.

mammals;cloning techniques;embryo recombination

S811.4

：A

：1002-2481（2017）09-1577-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.42

2017-04-21

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技自主創(chuàng)新能力提升工程項目（2017zzcx-02）

張榮華（1992-），女，山西太原人，在讀碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。李武峰為通信作者。