吸煙對(duì)口腔癌前病變細(xì)胞中過氧化物還原酶1表達(dá)及絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

張 弘, 張 英

(1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院, 遼寧 沈陽(yáng), 110002; 2. 陜西省延安市人民醫(yī)院, 陜西 延安, 716000)

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吸煙對(duì)口腔癌前病變細(xì)胞中過氧化物還原酶1表達(dá)及絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

張 弘1, 2, 張 英1

(1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院, 遼寧 沈陽(yáng), 110002; 2. 陜西省延安市人民醫(yī)院, 陜西 延安, 716000)

吸煙; 口腔癌前病變; 過氧化物還原酶1; 絲裂原活化蛋白激酶

口腔癌是發(fā)生在口腔的惡性腫瘤的總稱，包括舌癌、口底癌、軟硬腭癌、上頜竇癌等以及發(fā)生于顏面部皮膚黏膜的癌癥，是頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一?？谇话装呤强谇话┳顬槌Ｒ姷陌┣安∽?，發(fā)病率約為10.47%, 單純白斑的癌變率約為4%～17.5%, 白斑合并上皮異常增生者癌變率約為36%[1]。吸煙是口腔癌前病變發(fā)生的主要風(fēng)險(xiǎn)之一，但其在口腔癌前病變中的作用機(jī)制尚不明確。Prx1是過氧化還原酶家族中的主要成員之一，其表達(dá)增高提示腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制[2]。MAPK信號(hào)通路則在腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究探討吸煙對(duì)口腔癌前病變細(xì)胞株DOK中Prx1蛋白質(zhì)與mRNA以及MAPK家族中3種激酶磷酸化表達(dá)的影響，分析吸煙對(duì)口腔癌前病變的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人口腔黏膜癌前病變細(xì)胞株DOK細(xì)胞購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。Trizol試劑，Invitrogen。DMEM高糖液體培養(yǎng)基, HYCLONE。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司。RTFQ-PCR試劑盒購(gòu)自生興生物技術(shù)(南京)有限公司。高產(chǎn)量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems。RTFQ-PCR引物合成購(gòu)自寧波康貝生化有限公司。一抗: p-JNK、p-ERK、p-p38, Cell Signaling Technology, Inc。Prx1購(gòu)自Abcam公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自上海明睿生物技術(shù)有限公司。組織蛋白抽取試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。聚偏二氟乙烯膜購(gòu)自深圳市凱宏膜環(huán)?？萍加邢薰?。免疫印跡試驗(yàn)預(yù)染蛋白MAPKer購(gòu)自杭州佐正生物科技有限公司。免疫印跡試驗(yàn)封閉液II購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。香煙煙變應(yīng)原試劑購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

DOK細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含104U/L鏈霉素、104U/L青霉素、12%胎牛血清的DMEM高糖液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于5% CO2、37 ℃的孵箱內(nèi)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。觀察組應(yīng)用50 μL溶媒稀釋的香煙煙抗原浸液處理口腔癌前病變細(xì)胞株DOK 14 d, 對(duì)照組單純應(yīng)用50 μL溶媒處理口腔癌前病變細(xì)胞株DOK 14 d。

1.3 觀察指標(biāo)

應(yīng)用倒置顯微鏡觀察2組DOK細(xì)胞形態(tài)變化。應(yīng)用Trizol試劑分別提取觀察組與對(duì)照組細(xì)胞總RNA, 分光光度計(jì)測(cè)量總RNA質(zhì)量與濃度, cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, RTFQ-PCR試劑盒定量擴(kuò)增目的基因，應(yīng)用相對(duì)定量方法進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算2-△△Ct。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參照，基因引物序列如下: GAPDH-R, 5′-tgtagaccatgtagttgaggtca-3′; GAPDH-F, 5′-aggtcggtgtgaacggatttg-3′; Prx1-R, 5′-tccccatgtttgtcagtgaa-3′; Prx1-F, 5′-gggtattcttcggcagatca-3′。

Western Blot檢測(cè)2組細(xì)胞中Prx1 蛋白的表達(dá)，以及MAPK家族p-JNK、p-ERK、p-p38表達(dá)情況。DOK細(xì)胞處理同RTFQ-PCR, 分別收集2組細(xì)胞，對(duì)組織樣品進(jìn)行蛋白提取并用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，電泳分離蛋白，每個(gè)樣品上樣30 μg, 濕法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，封閉，一抗孵育: p-JNK(1∶1 000)、p-ERK(1∶2 000)、p-p38(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)。洗膜，二抗孵育：羊抗小鼠-HRP(1∶5 000), 羊抗兔-HRP(1∶5 000)。電化學(xué)發(fā)光顯色。應(yīng)用Qantity one 4.62軟件灰度掃描，分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察未處理前的DOK細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形或梭形，觀察組與對(duì)照組均未見明顯變化。

2.2 Prx1 mRNA與蛋白的表達(dá)

觀察組Prx1 mRNA表達(dá)為(1.92±0.39), Prx1 蛋白表達(dá)為(0.76±0.22); 對(duì)照組分別為(1.01±0.17)、(0.60±0.18), 2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 MAPK家族p-JNK、p-ERK、p-p38的表達(dá)

觀察組p-JNK表達(dá)為(0.42±0.01), p-ERK表達(dá)為(0.46±0.02), p-p38表達(dá)為(0.27±0.06); 對(duì)照組分別為(0.59±0.03)、(0.27±0.01)、(0.36±0.05), 2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

口腔癌是世界第6大癌癥，平均每年發(fā)病人數(shù)達(dá)到50萬(wàn)人，并且每年死亡人數(shù)高達(dá)25萬(wàn)人。目前公認(rèn)吸煙是口腔癌發(fā)生發(fā)展的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[3]，吸煙者較非吸煙者罹患口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)高7～10倍。研究[4]表明，吸煙可產(chǎn)生大量的活性氧簇(ROS)，ROS可氧化脂質(zhì)、多糖與蛋白質(zhì)，包括DNA與RNA。對(duì)于ROS引起的氧負(fù)荷，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)主要有抗氧化酶，如過氧化物還原酶(Prxs)。Prxs廣泛存在于真核及原核生物的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中，是特異性巰基類抗氧化酶，通過催化和還原脂質(zhì)氫過氧化物，避免細(xì)胞受到進(jìn)一步損傷，已知在哺乳動(dòng)物中存在6種亞型，以Prx1在組織中含量最為廣泛與豐富。研究[5]發(fā)現(xiàn)Prx1具有刺激細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及保護(hù)其他蛋白的氧化等作用?？谇话┣安∽兘M織白斑中，隨著異常增生程度的增加, Prx1表達(dá)增加，顯著高于正常組織[6]。此外, Prx1在前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)較高[7], 提示Prx1的高表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中，觀察組Prx1 mRNA與蛋白均顯著高于對(duì)照組，提示觀察組細(xì)胞受損程度大于對(duì)照組。

MAPK信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲與分化中發(fā)揮重要作用，主要包括JNK、ERK、p38三條信號(hào)通路。正常情況下, JNK、ERK、p38三條通路可促分化。在應(yīng)激狀態(tài)下, ERK抗細(xì)胞凋亡而JNK、p38則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。本研究中，觀察組p-JNK與p-p38顯著低于對(duì)照組，而p-ERK顯著高于對(duì)照組，提示觀察組細(xì)胞的抗凋亡作用顯著。有研究[9]顯示，香煙中的主要成分尼古丁通過提高p-ERK的表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖。

國(guó)外學(xué)者體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[10]發(fā)現(xiàn)，在Prx1高表達(dá)的細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1活性受抑，進(jìn)而抑制MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的p38級(jí)聯(lián)反應(yīng); 而Prx1低表達(dá)的細(xì)胞中, p38與JUN顯著激活。在本次研究中，在香煙煙抗原浸液處理的觀察組中, Prx1高表達(dá)而p-JNK與p-p38表達(dá)降低, p-ERK表達(dá)升高，提示長(zhǎng)期吸煙刺激口腔黏膜病變，可能通過誘導(dǎo)過氧化物還原酶1表達(dá)增高，調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，活化JNK、ERK、p38磷酸化水平，繼而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，促使口腔癌前病變發(fā)展為口腔癌。

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2017-01-20

遼寧省衛(wèi)計(jì)委青年項(xiàng)目(20144Y0199)

張英

R 739.8

A

1672-2353(2017)13-230-02

10.7619/jcmp.201713084