結核病臨床免疫學診斷的研究進展

余建林，彭 琳，陳娟娟，譚立明

(1、南昌大學公共衛(wèi)生學院檢驗專業(yè)2011級；2、南昌大學第二臨床學院臨床醫(yī)學專業(yè)2012級；3、南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

·綜述·

結核病臨床免疫學診斷的研究進展

余建林1，彭 琳2，陳娟娟3，譚立明3

(1、南昌大學公共衛(wèi)生學院檢驗專業(yè)2011級；2、南昌大學第二臨床學院臨床醫(yī)學專業(yè)2012級；3、南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

結核病是由胞內(nèi)寄生結核分枝桿菌（MTB）感染人體后引起的疾病。從被認識到現(xiàn)在近200年，結核病的診斷方法多種多樣，由于MTB的生長特性，臨床癥狀的非特異性，肺組織的病理變化多樣性，結核病的潛伏感染（LTBI）等因素，導致目前很難做到早期、特異、敏感的診斷。本文通過對結核病的免疫診斷的研究作一綜述，希望有助于早期、特異、敏感地診斷結核病。

結核??；免疫學診斷；分枝桿菌

目前結核病的診斷方法有多種，但是都存在一定的缺陷：⑴痰培養(yǎng)是結核病診斷的金標準，但是培養(yǎng)周期長，一般需要2~4周才能看到陽性結果，而確定陰性結果需要8周的時間，培養(yǎng)成功率只有80%左右。⑵痰涂片方法雖然簡單易行，但是陽性率低，容易造成漏檢，有40%以上的成人肺結核及75%肺外結核患者的臨床涂片標本檢查為陰性，對于潛伏感染無法做出診斷。⑶結核菌素（PPD）試驗簡便易行，但結核菌素含有多種蛋白質(zhì)成分，與多種分枝桿菌存在交叉反應，而且需要3天后才能觀察結果。結核菌素試驗陰性的人群在接種卡介苗后，PPD結果會轉為陽性；并且PPD含有多種抗原，可以是多種分枝桿菌所共有，可與其他分枝桿菌發(fā)生交叉反應[1，2]，中國人群普遍接種卡介苗，導致其假陽性率增加，且其結果是根據(jù)結核結節(jié)的大小來判斷陽性結果，容易受主觀因素的影響。對于免疫力低下的兒童、老年人或者感染能造成免疫缺陷的病毒如HIV的患者，容易造成假陰性。⑷PCR和核酸雜交方法雖然靈敏性較高，但是程序復雜需要專業(yè)的操作人員，高靈敏性導致容易出現(xiàn)假陽性。且儀器設備費用高限制了其在臨床的應用。⑸酶聯(lián)免疫斑點測定結核分枝桿菌（ELISPOT-TB）檢測技術可以早期特異性檢測致病性結核分枝桿菌特異T淋巴細胞，但是需要分離培養(yǎng)外周血單核細胞（PBMC）。對于免疫力低下，或者合并HIV感染及T淋巴細胞減少等無法準確的診斷，且無法區(qū)分活動性結核病和結核桿菌潛伏感染（LTBI）。⑹血清學抗體免疫檢驗技術簡便，快速，又有較高的敏感性和特異性，對結核病的診斷與鑒別具有重要的意義，但是由于人體血清中的抗體為多克隆抗體，可存在較嚴重的交叉反應，導致假陽性率較高。⑺血清抗原檢測技術能夠?qū)崿F(xiàn)早期檢測，且技術簡便快捷，雖然高特異度的抗體較難獲得，到那時基因操作技術、蛋白質(zhì)組學技術及單克隆抗體制備技術，使得高特異性的抗體制備成為可能。

結核分枝桿菌的免疫檢測主要包括皮膚菌素試驗，結核抗體的檢測，結核抗原的檢測，細胞因子的檢測等。

1 皮膚菌素試驗

此方法應用純蛋白衍生物（PPD）注射到體內(nèi)，觀察其是否會導致人體遲發(fā)型超敏反應，來判定人體對MTB有無免疫力，從而判斷受試者是否曾經(jīng)感染過MTB。結核菌素試驗（TST）對于診斷活動性結核病的敏感度31.6%，特異度為81.0%[3]。我國人群普遍接種了卡介苗，試驗的假陽性率高，也降低了其檢測的特異度。結果由人觀察結節(jié)直徑的大小來判斷，存在著主觀性，容易造成漏診誤診。免疫力低下，免疫力缺陷或HIV感染者均可以影響該試驗的敏感性。TST陽性的結果只能說明曾經(jīng)感染過MTB或接種過卡介苗，不能說明現(xiàn)在是否感染或者患有結核病，需要進一步的檢測才能得出更準確的結果。所以結核菌素試驗的臨床應用價值不大。

2 結核抗體的檢測

結核抗體的檢測原理是抗原抗體反應，利用MTB的特異性抗原檢測體內(nèi)相應的抗體，根據(jù)檢測抗體的滴度來判斷人體是否感染MTB。

肺結核患者的體液免疫與抗體IgG、IgM、IgA有關，在結核患者體內(nèi)能檢測特異性的結核抗體。PPD、脂阿拉伯甘露糖（LAM）、重組抗原（38kD蛋白、Ag85復合物、A60抗原等）等可作為抗原檢測抗體?；顒有越Y核病患者細胞免疫受損，體液免疫亢進，血清及其他體液中結核抗體升高，隨著治療時間的延長，血清抗體水平逐漸降低，結核抗體的檢測，可用于活動性結核病與LTBI鑒別診斷及療效判斷。據(jù)報道LAM-IgG、38kD、BCG-IgG、PPDIgG檢測的敏感度分別是74.5%、70.9%、80.0%和83.6%；特異度分別是91.0%、99.0%、93.0%和84.0%；ELISA法測定血清結核抗體的線性范圍是0.625~5μg/ml，陰性與陽性標本重復率分別是100%、95%，特異性為96%[4]。人體血液中抗體為多克隆抗體，用結核抗原去檢測時會出現(xiàn)交叉反應；在剛剛治愈的結核病患者體內(nèi)含有較高濃度的結核抗體等會造成假陽性。重癥肺結核、血播散型結核病、老年患者或HIV感染者等免疫力低下，體內(nèi)的MTB抗原無法刺激機體產(chǎn)生足量的結核抗體，導致敏感性較低，甚至出現(xiàn)假陰性結果。

3 結核抗原的檢測

結核抗原的檢測原理是抗原抗體反應的特異性，利用單克隆抗體來檢測體內(nèi)的MTB抗原，從而判斷機體是否感染MTB。

MTB的特異性蛋白抗原如L-丙氨酸脫氫酶、異丙基蘋果酸合酶、煙堿核苷磷酸酯酶，MPT64和兩個假定保守蛋白能滲透至人的胸腔積液、腹水、痰液等體液中，有助于肺外結核的診斷。MPT64抗原是結核分枝桿菌分泌時間最早、量最多，且非結核分枝桿菌不分泌[5]；且MPT64抗原檢測的敏感度，特異度分別是64.4%、99.4%[6，7]。Martin A[8]發(fā)現(xiàn)與聚合酶鏈反應相比，MPT64檢測的敏感度和特異度分別為96.5%和100%，兩者的一致性達96.9%。對儀器系統(tǒng)法報告為陽性者，培養(yǎng)濾液MPT64抗原檢測法陽性率為93.62%[9]。不同方法檢測同一種抗原，同一種方法檢測不同抗原，相同抗原不同組合測定的結果敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值均有不同[10，11]。檢測腦脊液早期分泌的抗原-6（ESAT-6）與培養(yǎng)基濾過蛋白-10（CFP-10）抗原敏感度分別為73.33%、86.67%，特異度為90.00%、95.00%[12]。應用免疫熒光細胞化學染色法檢測腦脊液單核細胞內(nèi)的ESAT-6，其敏感性為90.48%，特異性為91.49%[13]。由前所述可知應用檢測MPT64蛋白鑒別結核與非結核分枝桿菌相比于CFP-10、ESAT-6敏感度高，特異度強，具有良好的臨床應用前景。結核分枝桿菌抗原結合化學發(fā)光定量的檢測方法，可用于結核病的早期輔助診斷[14]。

結核抗原的檢測可以作為MTB存在的直接證據(jù)，可避免因為機體免疫應答低下，導致抗體檢測或者細胞檢測假陰性。

4 細胞因子的檢測

結核免疫以細胞免疫為主，巨噬細胞在控制、殺滅MTB中起到重要作用，其抗菌活性受到多種細胞因子(CK)的調(diào)節(jié)。Th1型細胞因子能激活單核巨噬細胞，增強巨噬細胞的抗菌能力，對MTB感染起到保護性免疫應答作用，有利于疾病的控制。Th2型細胞因子抑制細胞免疫，降低了巨噬細胞的抗菌能力，使結核病的免疫應答減弱，促進了疾病的發(fā)展。目前認為IFN-γ、IL-12是促進Th1分化的主要因子；IL-4、IL-10是促進Th2細胞分化的主要因子。巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌后，產(chǎn)生一系列的細胞因子譜系：IL-1、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉化生長因子-β（TGF-β）和IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-4。結核肉芽腫形成是一個復雜的細胞因子效應過程，參與的細胞因子有IL-1、IL-8、IL-12、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-I）、促黑激素釋放抑制因子（MIF）、TGF-β、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、生長因子集落刺激因子（GF-CSF）等[15]。特異性T細胞被激活增殖分泌的IFN-γ在細胞免疫中起著重要的作用，可以將巨噬細胞激活為吞噬細胞并破壞細菌[16]。IL-21能夠增強CD8T細胞，促進肺部T細胞聚集，增強T細胞的細胞因子的產(chǎn)生[17]。

細胞因子的檢測方法有多種，如γ-干擾素釋放試驗（IGRAs）是以結核分枝桿菌H37Rv基因RD1區(qū)編碼抗原ESAT-6和CFP-10肽段為刺激原，體外檢測致敏T淋巴細胞分泌的γ-干擾素，I-GRAs能夠準確的判斷潛伏性的結核感染，特異度和靈敏度明顯高于膠體金法(TB-Ab)、痰涂片抗酸染色鏡檢及聚合酶鏈式反應(TB-PCR)檢測，不受卡介苗的影響，對肺內(nèi)外檢測具有同樣的準確度[1，18-21]；T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)具有較高的敏感度和特異度[19，22-24]，以ESAT-6和CFP-10肽段為刺激原，刺激結核感染者外周血單核細胞中存在特異的活化T淋巴細胞分泌IFN-γ，進而應用酶聯(lián)免疫斑點實驗（ELISPOT）方法檢測對MTB反應的效應T細胞數(shù)量，對結核感染進行診斷。IGRAs檢測敏感性90.9%，特異性為88.5%；T-SPOT.TB檢測敏感性93.2%，特異性為92.3%[25]。結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液（CF）組分存在PPD、Rv1818c、Rv3812、Rv3018c或合成肽[26]。RD1抗原促進IFN-γ的釋放[27]，且在活動性結核與LTBI血漿中有顯著差異[28]，同時血液中的IFN-γ和IL-2濃度隨著治療的時間延長及病情的康復逐步地升高[29]。故IFN-γ在結核病的診斷中具有很好的應用前景，然而研究證實體外干擾素γ釋放試驗，不能用于LTBI較高的地區(qū)的活動性結核病的鑒別診斷[30]。

5 結語

影響LTBI傳染的因素主要是遺傳基因、機體免疫系統(tǒng)、周圍環(huán)境、影響機體免疫力的疾病等。痰陽性的活動性肺結核患者是主要的傳染源，但是LTBI是結核分枝桿菌的潛在載體，LTBI在感染后的一段時間內(nèi)，由于機體的免疫力發(fā)生變化而發(fā)展為活動性肺結核。HIV感染、化學治療、類固醇激素的治療等，導致LTBI更容易發(fā)展為活動性的肺結核[27，31，32]。

在結核病的防治中，重要的任務是活動性肺結核和LTBI的診斷、治療同步進行。需要具有特異的診斷方法能夠鑒別活動性肺結核、LTBI、卡介苗的接種。

目前結核病的檢測存在一些問題：IFN-γ不適用于判斷結核病的嚴重程度或疾病進展情況，陽性對照結果有時不會出現(xiàn)，IFN-γ對活動性結核病靈敏度不佳，特別是在感染HIV病毒的患者，陰性結果不能排除活動性結核病。干擾素釋放實驗不能區(qū)分LTBI和活動性結核病[33]，其可能的原因是：抗原的免疫原性不強，不能夠刺激細胞產(chǎn)生足夠的IFN-γ；細胞對于免疫原不夠敏感，需要其他的細胞因子加強細胞的敏感性和活性增加IFN-γ的釋放量。

為提高MTB的檢出率，可從以下幾方面進行改進，如原理不同的幾種試驗方法的聯(lián)合使用，抗原的免疫原性的提高，細胞因子和蛋白抗原聯(lián)合檢測等方面。免疫磁珠捕獲聯(lián)合雙內(nèi)標聚合酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附試驗定量檢測結核桿菌技術（IMC-PCR-ELISA）特異度和敏感度均很高[34]。IFN-γ和IL-10可促進結核分枝桿菌肽的MHC-II復合物形成[35]，在檢測IFN-γ的同時，可以檢測其他的細胞因子如IL-2[35]，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，可提高檢測的敏感度和特異性，同時也可以鑒別出活動性結核病和LTBI。在檢測結核分枝桿菌抗原如MPT64[6]、ESAT-6與CFP-10[12]等，可以結合IFN-γ的檢測。對于IGRAs陽性結果不明顯的現(xiàn)象，可以加入一些具有協(xié)同作用的細胞因子如B7與CD28或者選擇其他的刺激原來提高IFN-γ的釋放。

提高MTB檢測的敏感性可以從以下幾個方面：⑴標本的選擇，如腦脊液因為蛋白質(zhì)類的物質(zhì)相對比較少，交叉反應或者干擾物質(zhì)較少，使得其檢測結果的敏感度和特異度均較高；而在血清中因為抗體或者其他的物質(zhì)相對較多，存在的干擾較嚴重；⑵檢測方法的選擇，例如MPT64的檢測，不同的檢測方法具有不同的靈敏度和特異度[6，8，10]，敏感性不好，可能是方法選擇得欠佳；⑶抗體的選擇，可以選擇高特異性、高純度的抗體；⑷標本的處理，恰當?shù)臉吮咎幚矸椒梢詼p少干擾物質(zhì)，如使用層析或者差速離心等方法選擇合適分子量的物質(zhì)進行檢驗。

綜上所述，結核病的免疫學診斷方法具有敏感性高，特異性強，方法簡便、快速、準確等特點，但目前也有不足之處，筆者認為可以從前面所述的改進方法來提高免疫學診斷的靈敏度和特異度，使其能夠更好地為臨床診斷和治療服務

[1]李兵，陳獻雄，楊倩婷，等.卡介苗對結核分枝桿菌IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點檢測法的影響[J].臨床肺科雜志，2010(07)：955-957.

[2]何綠茵，葉惠芬，楊銀梅，等.多種實驗室檢查方法在結核病診斷中的價值[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2009，27(1)：104，107.

[3]何苗，T-SPOT.TB及傳統(tǒng)試驗診斷活動性結核病的臨床評價比較[D].中南大學，2012：16.

[4]張民軍，周助權，沈榮柴，等.4種靶特異性抗體檢測對肺結核的臨床診斷價值[J].皖南醫(yī)學院學報，2009，36(3)：187-189.

[5]辛茶香，張周云，熊國亮.分枝桿菌菌種鑒定方法及其進展[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2016(1)：1-3，7.

[6]Zhu C，Liu J，Ling Y，et al.Evaluation of the clinical value ofELISA based on MPT64 antibody aptamer for serological diagnosis of pulmonary tuberculosis[J].BMC Infect Dis，2012(12)：96.

[7]李國利，趙銘，張靈霞，等.免疫層析法檢測MPT64蛋白在結核與非結核分枝桿菌鑒定中的臨床應用價值[J].中國醫(yī)藥導報，2012(31)：152-153.

[8]Martin A，Bombeeck D，Mulders W，et al.Evaluation of the TB Ag MPT64 Rapid test for the identification of Mycobacterium tuberculosis complex[J].Int J Tuberc Lung Dis，2011，15(5)：703-705.

[9]許婉華，黃業(yè)倫，劉燕文，等.培養(yǎng)濾液MPT64抗原檢測結核分枝桿菌復合群生長的效能分析[J].中國防癆雜志，2012(08).

[10]吳雪瓊，張俊仙，李洪敏，等.結核分枝桿菌MPT64蛋白的表達、純化及初步應用[J].中國防癆雜志，2001(02).

[11]鄧志高.重組結核分枝桿菌ESAT6和CFP10混合抗原及融合抗原診斷結核病的研究[D].湖南師范大學，2013.

[12]張亞杰.ESAT-6與CFP-10在結核性腦膜炎患者的腦脊液中的表達[D].河北醫(yī)科大學，2012.

[13]聶恒，吳利先.結核分枝桿菌特異性蛋白抗原研究進展及其應用策略探討[J].中國病原生物學雜志，2014(02).

[14]孟闖.結核分枝桿菌抗原蛋白的表達、免疫特性分析及在牛結核病檢測中的初步應用[D].揚州大學，2011：72.

[15]朱曉燕，陳慧，徐俊馳，等.肺結核患者外周血sIL-2R、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的檢測意義[J].臨床肺科雜志，2015(09)：1564-1566.

[16]吳媛媛，李龍，沈萍萍.巨噬細胞替代激活及調(diào)控[J].中國細胞生物學學報，2011(02)：197-203.

[17]Booty MG，Barreira-Silva P，Carpenter SM，et al.IL-21 signaling is essential for optimal host resistance against Mycobacterium tuberculosis infection[J].Sci Rep，2016，6：36720.

[18]Diel R，Loddenkemper R，Meywald-Walter K，et al.Comparative performance of tuberculin skin test，QuantiFERON-TB-Gold In Tube assay，and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis[J].Chest，2009，135(4)：1010-1018.

[19]汪金云，周東枝，徐亞麗.體外釋放酶免疫技術檢測結核分枝桿菌的臨床應用[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學，2016(01)：32-33.

[20]黃華，陳心春，楊倩婷，等.結核分枝桿菌IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點檢測在結核診斷中的應用[J].江西醫(yī)學院學報，2009(04)：57-59. [21]蔣英，趙蓉，張勝男，等.干擾素釋放酶聯(lián)免疫法(TB-IGRA)用于檢測結核分枝桿菌的優(yōu)越性[J].實用預防醫(yī)學，2012，19(1)：24-26.

[22]白國峰.T-SPOT.TB法在肺結核分枝桿菌檢測中的應用[J].山東醫(yī)藥，2015(42)：72-73.

[23]唐碩潤，梁珍.結核酶聯(lián)免疫斑點試驗、結核分枝桿菌DNA測定和痰涂片檢測在肺結核診斷中的比較研究[J].中國當代醫(yī)藥，2013(34)：122-123.

[24]王曉娟，周曉霞，王臻，等.外周血結核桿菌感染T細胞斑點試驗聯(lián)合胸腔積液腺苷脫氨酶檢測對結核性胸膜炎患者的診斷價值及評價[J].中國醫(yī)刊，2016，51(6)：29-32.

[25]朱桂云，楊永輝，安曉穎，等.兩種γ-干擾素釋放試驗檢測結核菌感染的對比研究[J].河北醫(yī)藥，2013(19).

[26]Chaitra MG，Shaila MS，Nayak R.Detection of interferon gammasecreting CD8+T lymphocytes in humans specific for three PE/PPE proteins of Mycobacterium tuberculosis[J].Microbes Infect，2008，10(8)：858-67.

[27]Butera O，Chiacchio T，Carrara S，et al.New tools for detecting latent tuberculosis infection：evaluation of RD1-specific long-term response[J].BMC Infect Dis，2009，9：182.

[28]周樂亮.T-SPOT.TB聯(lián)合細胞因子INF-γ、IL-10等檢測在結核病診斷中的應用[D].長沙：中南大學，2013.

[29]Millington KA，Innes JA，Hackforth S，et al.Dynamic relationship between IFN-gamma and IL-2 profile of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells and antigen load[J].J Immunol，2007，178 (8)：5217-26.

[30]Ling DI，Pai M，Davids V，et al.Are interferon-{gamma}release assays useful for diagnosing active tuberculosis in a high-burden setting?Eur[J].Respir J，2011，38(3)：649-656.

[31]Druszczynska M，Kowalewicz-Kulbat M，F(xiàn)ol M，et al.Latent M. tuberculosis infection-pathogenesis，diagnosis，treatment and prevention strategies[J].Pol J Microbiol，2012，61(1)：3-10.

[32]Ahmad，S.New approaches in the diagnosis and treatment of latent tuberculosis infection[J].Respir Res，2010，11：169.

[33]Pai M，Denkinger CM，Kik SV，et al.Gamma interferon release assays for detection of Mycobacterium tuberculosis infection[J].Clin Microbiol Rev，2014，27(1)：3-20.

[34]王震，龔玉華，錢彩娣，等.5種結核桿菌檢測方法的臨床應用價值[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2015(3)：334-336.

[35]Bobadilla K，Sada E，Jaime ME，et al.Human phagosome processing of Mycobacterium tuberculosis antigens is modulated by interferon-gamma and interleukin-10[J].Immunology，2013，138(1)：34-46.

R446.62，R378.91+1

A

1674-1129(2017)01-0056-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.017

2016-07-05；

2016-11-18)

國家自然科學基金青年基金（81401964）；江西省青年科學基金（20142BAB215058）；江西省教育廳青年基金（GJJ14185）

余建林，男，1990年生，本科；彭琳，女，1994年生，本科。通信作者：陳娟娟，1983年生，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：moonlikecj@163.com；譚立明，南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，教授，1963年生，Email：wangxzlj@126.com