干細(xì)胞示蹤技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用及進(jìn)展

曹歡，宋紅麗，沈中陽(yáng)（. 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 300070，.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 3009）

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞［1］。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，具有再生各種組織器官的潛能，這些特性是干細(xì)胞治療的基礎(chǔ)［2］。近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療已在動(dòng)物模型和部分臨床試驗(yàn)中取得了巨大進(jìn)步［3］。為了實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的治療潛力，干細(xì)胞必須在移植后遷移到損傷或病變部位，分化為靶細(xì)胞然后定植于病變部位并存活［4］。

隨著細(xì)胞示蹤及成像技術(shù)的發(fā)展，研究者能更加深入地了解干細(xì)胞在動(dòng)物模型體內(nèi)的遷徙、存活及分化情況［5］。為了更好地了解干細(xì)胞在機(jī)體的情況，合理的示蹤技術(shù)起著至關(guān)重要的作用。本文將比較各種示蹤技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)目前示蹤技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 干細(xì)胞的標(biāo)記及示蹤技術(shù)

1.1 熒光蛋白標(biāo)記示蹤法：綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）是由 Shimomura 等［6］在1962年從一種學(xué)名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)的由238個(gè)氨基酸組成的單體蛋白質(zhì)。隨后相繼發(fā)現(xiàn)了30余種波長(zhǎng)不同的熒光蛋白，常見的有GFP和其衍生物黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein， YFP）、 藍(lán) 色 熒 光 蛋 白（blue fluorescent protein， BFP）以及紅色熒光蛋白（red fluorescent protein， RFP）等。

熒光蛋白示蹤的原理是通過(guò)腺病毒、慢病毒、質(zhì)粒等載體將熒光蛋白基因與目的基因整合并在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，經(jīng)激發(fā)光照射下發(fā)出熒光?，F(xiàn)主要介紹最常用的GFP和RFP，以及最新研究進(jìn)展迅速的新型熒光蛋白。

GFP具有如下優(yōu)點(diǎn)：① 不需加入任何底物或酶即可發(fā)射穩(wěn)定的綠色熒光，可顯微鏡下觀測(cè)活細(xì)胞的情況［7］，也可與其他熒光試劑同時(shí)進(jìn)行雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)或同時(shí)聯(lián)合多種熒光蛋白在同一組織中不同的靶細(xì)胞［8］；② 對(duì)細(xì)胞和機(jī)體的毒性作用和不良反應(yīng)小，對(duì)細(xì)胞的完整性及活力影響小［9］；③ 熒光蛋白質(zhì)無(wú)種屬特異性，原核和真核細(xì)胞均能表達(dá)［10］；④ 可以進(jìn)行定量研究［11］。GFP目前已成為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中示蹤完整活細(xì)胞生命現(xiàn)象的重要手段。然而，GFP在作為示蹤劑時(shí)仍存在一些不足：① GFP的表達(dá)水平在個(gè)體之間甚至在同一動(dòng)物體內(nèi)的不同細(xì)胞中是高度可變的，移植前高水平表達(dá)GFP的細(xì)胞移植后可能會(huì)出現(xiàn)低表達(dá)［12］；② GFP的具體半衰期還不確定，不利于在實(shí)驗(yàn)中對(duì)時(shí)間的掌控；③ 在發(fā)光效率方面，野生型GFP發(fā)光強(qiáng)度和靈敏度較低［13］。為了解決上述問(wèn)題，目前使用較多的是其人工突變體增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）。EGFP增強(qiáng)了GFP的熒光性能，顯著提高了檢測(cè)靈敏度。有研究人員使用EGFP轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了體外培養(yǎng)6個(gè)月熒光持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)［14］。

RFP也是一種常用的熒光蛋白，光穩(wěn)定性高，并且受pH值影響小，在pH為5～12范圍內(nèi)吸收光和發(fā)射光強(qiáng)度沒有明顯變化［15］。其優(yōu)點(diǎn)與GFP大致相同，熒光強(qiáng)度較GFP稍強(qiáng)，并且RFP能發(fā)射更長(zhǎng)的波，能夠滲透至深部組織。但是其細(xì)胞毒性比GFP高，故單獨(dú)運(yùn)用時(shí)使用頻率比GFP低，其與EGFP形成互補(bǔ)，共同用于雙色熒光示蹤。

上述傳統(tǒng)熒光蛋白熒光的成熟依賴于氧分子，在用于研究高密度發(fā)酵、腦缺血、腫瘤缺氧等厭氧生物系統(tǒng)的作用有限［16］。為了解決上述問(wèn)題開發(fā)的基于黃素的熒光白（flavin-based fluorescent proteins， FbFPs）是一種新型熒光蛋白，其特征為不依賴氧成熟的熒光，并且與GFP相比，F(xiàn)bFPs分子量更?。?7］，適用于在低氧條件下示蹤靶細(xì)胞或厭氧微生物［18］。

1.2 熒光染料標(biāo)記示蹤法：迄今為止，多種熒光染料已被利用于標(biāo)記示蹤干細(xì)胞，不同的熒光染料可與細(xì)胞的不同部位可逆或不可逆地結(jié)合，如可以結(jié)合細(xì)胞核的熒光染料：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、雙苯甲酰亞胺（Hoechst），結(jié)合細(xì)胞膜例如碳花青染類料（DiI）等，位于細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的如羧基熒光素琥珀酰亞胺基氨基酯（CFSE）等［19］。其原理是：干細(xì)胞移植前，使用熒光素進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記，移植后利用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記干細(xì)胞的遷徙情況及后續(xù)的存活情況。染料能直接標(biāo)記細(xì)胞，適用于短時(shí)期示蹤，因染料不是基因依賴，不能遺傳給子細(xì)胞，隨著細(xì)胞的增殖過(guò)程，被標(biāo)記的細(xì)胞會(huì)越來(lái)越少，只能用于短時(shí)間觀察［20］，現(xiàn)介紹氯甲基苯甲酰氨（chloromethylbenzamidodialkyl carbocyanine，CM-DiI）和 DAPI兩種具有代表性的熒光染料。

CM-DiI是一種親脂性碳花青染料，易嵌入細(xì)胞膜磷脂雙分子層作側(cè)向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞膜，是一種細(xì)胞膜熒光染料，其在醛類物質(zhì)中保持穩(wěn)定，因此CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞后再進(jìn)行固定、脫水、浸蠟及包埋等操作不會(huì)影響其熒光［21］。因其標(biāo)記率高，具有標(biāo)記細(xì)胞后傳代示蹤的可行性，適用于觀察細(xì)胞在體外的誘導(dǎo)分化情況，或顯示移植細(xì)胞在活組織的遷徙及分化［22］。研究表明，在保證良好的標(biāo)記示蹤的前提下，CM-DiI的常用濃度為 4 ～ 10 μmol/L［23］。CM-DiI具有以下缺點(diǎn) ：① CM-DiI雖然細(xì)胞毒性低，在常用濃度標(biāo)記細(xì)胞時(shí)，對(duì)標(biāo)記后細(xì)胞成活率影響不大,但是對(duì)細(xì)胞早期增殖有影響［24］；② 由于CM-DiI 標(biāo)記的產(chǎn)生熒光存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，不存在于細(xì)胞核，傳代培養(yǎng)后熒光有所衰減，不能用于干細(xì)胞的長(zhǎng)期示蹤，適用于短期示蹤［25］。

DAPI可以透過(guò)完整的細(xì)胞膜，快速進(jìn)入活細(xì)胞中與DNA結(jié)合，在紫外光的激發(fā)下呈藍(lán)色熒光，DAPI對(duì)細(xì)胞活性、增殖均無(wú)明顯影響，是較為常用的細(xì)胞核熒光染料［26］。用DAPI標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，12小時(shí)即可見細(xì)胞核發(fā)明亮藍(lán)色熒光，但隨著標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光亮度和標(biāo)記率均逐漸降低，以12～24小時(shí)為最佳標(biāo)記時(shí)間［27］。DAPI的缺點(diǎn)是隨著細(xì)胞的分裂增殖，DAPI被平均分配到子代細(xì)胞中，導(dǎo)致DAPI標(biāo)記強(qiáng)度降低，靈敏度下降。更重要的是，DAPI無(wú)法與DNA共價(jià)緊密結(jié)合，因此，細(xì)胞移植后DAPI可從標(biāo)記的細(xì)胞上解離，并被宿主細(xì)胞攝?。?8］，因此，DAPI不是活細(xì)胞的理想標(biāo)記物，多用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)或短期的標(biāo)記示蹤。

1.3 核酸標(biāo)記法：具有代表性的是5-溴-2'-脫氧尿苷（BrdU），為一種嘧啶類似物，常用于標(biāo)記活細(xì)胞中新合成的DNA。摻入到DNA的BrdU可通過(guò)抗BrdU單克隆抗體在組織切片或細(xì)胞爬片上顯示［29］。但是BrdU需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致染色彌散，準(zhǔn)確性降低等問(wèn)題，逐漸被5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU） 取 代［30］。EdU是另外一種胸腺嘧啶核苷類似物，它也能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過(guò)基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)檢測(cè)DNA復(fù)制活性，通過(guò)檢測(cè)EdU標(biāo)記便能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況［31］。EdU檢測(cè)染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無(wú)需DNA變性即可有效檢測(cè)，可有效避免樣品損傷，適用于在細(xì)胞和組織水平能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖等現(xiàn)象。

1.4 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）：FISH是基于DNA或DNA / RNA雙鏈的互補(bǔ)性質(zhì)的大分子識(shí)別技術(shù)。與熒光團(tuán)偶聯(lián)的核苷酸整合的選定的DNA鏈可以用作探針以雜交到測(cè)試的細(xì)胞和組織中的互補(bǔ)序列上，然后通過(guò)熒光顯微鏡或成像系統(tǒng)進(jìn)行觀測(cè)［32］。FISH技術(shù)有3個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)：① 能夠高靈敏度和特異性識(shí)別目標(biāo)DNA或RNA 序列［33］；② 直接應(yīng)用于中期染色體和間期核［34］；③ 在單細(xì)胞水平的雜交信號(hào)的可視化［35］。并且多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列，既可以在載玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)［36］。但是FISH技術(shù)不能保證100%雜交，這種現(xiàn)象在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)表現(xiàn)明顯［32］。

1.5 磁共振對(duì)比增強(qiáng)劑標(biāo)記示蹤法：此技術(shù)是在體外將待移植細(xì)胞用MR增強(qiáng)劑標(biāo)記后移植，然后利用磁共振成像（magnetic resonance imagine，MRI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行追蹤。磁共振示蹤劑種類多樣，目前效果較理想同時(shí)也是研究熱點(diǎn)的磁共振示蹤劑是超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxides，SPIO）。純應(yīng)用SPIO標(biāo)記細(xì)胞效率較低，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染劑修飾后能提高細(xì)胞的有效磁標(biāo)記率。MRI可檢測(cè)到很少量的磁標(biāo)記細(xì)胞甚至是單個(gè)細(xì)胞，靈敏度高，同時(shí)磁標(biāo)時(shí)間長(zhǎng)［37］。然而，SPIO作為示蹤劑時(shí)仍存在不足：① 由于干細(xì)胞增殖，SPIO標(biāo)記的子細(xì)胞會(huì)失去一些SPIO標(biāo)記，因此，當(dāng)SPIO濃度低時(shí)不能保持初始高標(biāo)記效率；② 隨著細(xì)胞的死亡，殘留在死亡組織內(nèi)的SPIO微?；虮痪奘杉?xì)胞吞噬SPIO微?？赡茉斐杉訇?yáng)性結(jié)果［38］；③ SPIO用量越高標(biāo)記效率越高，但是高劑量的SPIO可能對(duì)細(xì)胞有害，導(dǎo)致細(xì)胞活力降低［39］。因此，SPIO適用于短期示蹤細(xì)胞在體內(nèi)或體外的增殖分化情況。

1.6 量子點(diǎn)（quantum dots， QDs）標(biāo)記示蹤法：QDs大多是由硒化鎘制成的半導(dǎo)體熒光納米晶，其獨(dú)特的光學(xué)特性使其越來(lái)越多地被應(yīng)用于活細(xì)胞標(biāo)記［40］，近年來(lái)，QDs的發(fā)展已經(jīng)有超過(guò)有機(jī)熒光劑發(fā)展趨勢(shì)［41］。與有機(jī)熒光蛋白相比，QDs有多方面的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)中常見的熒光標(biāo)記物主要為有機(jī)小分子，由于這些小分子光穩(wěn)定性差，無(wú)法滿足干細(xì)胞治療的長(zhǎng)時(shí)間與高穩(wěn)定性的監(jiān)測(cè)要求［42］。相比而言，QDs具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的熒光壽命，并且在觀察標(biāo)記的干細(xì)胞不需要注入其他的試劑或酶等［43］。在一定濃度范圍內(nèi)，QDs不會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)和增殖改變，不影響細(xì)胞的正常生理代謝［44］。鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，QDs適用于長(zhǎng)期示蹤活細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、增殖及分化情況。

然而，大多數(shù)量子點(diǎn)含有鎘離子，具有高水平的毒性，這使得量子點(diǎn)在濃度較大時(shí)對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞具有生理毒性，影響標(biāo)記細(xì)胞的增殖［45］。有研究人員開發(fā)了無(wú)鎘的QDs，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，在同一濃度下，無(wú)鎘QDs對(duì)細(xì)胞增殖影響比含鎘QDs低，但粒子的亮度和攝取水平基本相似，示蹤效果接近［46］。因此，如何在不降低量子點(diǎn)分辨率的前提下，降低不良反應(yīng)的無(wú)鎘或毒性較小的量子點(diǎn)的發(fā)展是很有前景的［47］。

2 示蹤常用儀器

成像技術(shù)的發(fā)展與干細(xì)胞示蹤關(guān)系密切，目前常用的成像儀器包括熒光顯微鏡、核磁共振儀、流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡等，不同示蹤技術(shù)應(yīng)選擇合適的成像儀器。熒光顯微鏡是最常用的熒光檢測(cè)方法，常用于定性觀察細(xì)胞內(nèi)部熒光物質(zhì)的空間分布和強(qiáng)度分布［48］，操作簡(jiǎn)便，但是定量分析能力較差［49］。

磁共振成像具有空間、時(shí)間分辨率高，有效成像時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)比度高等優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)獲得生理及解剖信息，可以觀察細(xì)胞的動(dòng)態(tài)遷徙過(guò)程［50］，在活體細(xì)胞示蹤中應(yīng)用前景好，但是目前常用的示蹤劑對(duì)細(xì)胞生理影響大，且操作麻煩，費(fèi)用較高［39］。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞經(jīng)過(guò)熒光染色，被激光照射后，會(huì)產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的激發(fā)光，根據(jù)激發(fā)光的強(qiáng)弱，可以判斷細(xì)胞和染色物質(zhì)的結(jié)合情況，從而得到要檢測(cè)的結(jié)果如抗原量等，可定性定量分析［51］。但是流式細(xì)胞技術(shù)只能測(cè)量一個(gè)細(xì)胞的總核酸或蛋白質(zhì)量，不能測(cè)量具體部位的量。

共聚焦顯微鏡是目前較先進(jìn)、成像效果好并且可以進(jìn)行定性定量分析的儀器。其主要優(yōu)點(diǎn)是能夠通過(guò)熒光樣品的厚度范圍為50 μm或以上的連續(xù)生產(chǎn)?。?.5～1.5 μm）的光學(xué)部分，有深入現(xiàn)場(chǎng)消除或減少的背景信息的焦平面（即導(dǎo)致圖像退化）的控制能力，顯著提高對(duì)比度和清晰度。非侵入性的共聚焦光學(xué)切片技術(shù)對(duì)各種標(biāo)本的檢測(cè)具有更高的清晰度，并可定性定量地進(jìn)行免疫熒光測(cè)定［52］。

3 總結(jié)與展望

目前，干細(xì)胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，許多實(shí)驗(yàn)表明移植入宿主體內(nèi)的干細(xì)胞能促進(jìn)宿主體內(nèi)器官損傷的修復(fù)，優(yōu)秀的干細(xì)胞標(biāo)記示蹤技術(shù)有助于研究者進(jìn)一步了解干細(xì)胞在動(dòng)物模型內(nèi)發(fā)揮功能的機(jī)制，最終使其轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療手段。成熟的干細(xì)胞標(biāo)記示蹤方法眾多，每一種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，不同細(xì)胞情況或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)類型需選擇合適的示蹤方法，在需要時(shí)可聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種示蹤方法，利用其各自的優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到良好的示蹤效果。

理想的示蹤方法應(yīng)具有簡(jiǎn)單易行、特異性強(qiáng)、靈敏度高、受外界干擾因素小和假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)，此外，尋找最佳示蹤效果與示蹤劑細(xì)胞毒性之間的平衡是發(fā)展新型示蹤劑的關(guān)鍵問(wèn)題。隨著干細(xì)胞示蹤研究的不斷深入，其勢(shì)必會(huì)對(duì)干細(xì)胞治療產(chǎn)生較為深遠(yuǎn)的影響。