紅樹(shù)植物秋茄分子生物學(xué)研究進(jìn)展

杜照奎，陳河，李鈞敏

1 浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臺(tái)州 318000

2 臺(tái)州學(xué)院生態(tài)研究所，浙江 臺(tái)州 318000

3 臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000

4 海南東寨港國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，海南 海口 571129

紅樹(shù)植物秋茄分子生物學(xué)研究進(jìn)展

杜照奎1,2,3，陳河4，李鈞敏1,2,3

1 浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臺(tái)州 318000

2 臺(tái)州學(xué)院生態(tài)研究所，浙江 臺(tái)州 318000

3 臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000

4 海南東寨港國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，海南 ?？?571129

杜照奎, 陳河, 李鈞敏. 紅樹(shù)植物秋茄分子生物學(xué)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 196–204.

Du ZK, Chen H, Li JM. Advances in molecular biological studies of the mangroveKandelia obovataSheue, Liu & Yong. Chin J Biotech, Chin J Biotech, 2017, 33(2): 196–204.

秋茄Kandelia obovataSheue, Liu & Yong是分布于熱帶、亞熱帶海岸帶與河口潮間帶的常綠紅樹(shù)植物，在海岸生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的功能和價(jià)值。文中綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于秋茄分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展，主要包括基于分子標(biāo)記的秋茄親緣地理關(guān)系與遺傳多樣性研究，基于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以及逆境脅迫響應(yīng)基因的克隆與功能驗(yàn)證研究；最后還結(jié)合當(dāng)前研究現(xiàn)狀展望了秋茄分子生物學(xué)未來(lái)研究工作的方向。

秋茄，分子標(biāo)記，鹽脅迫，蛋白質(zhì)組，基因克隆

紅樹(shù)植物是分布于熱帶、亞熱帶海岸帶與河口潮間帶的常綠灌木或喬木，當(dāng)其樹(shù)干被砍斷或者樹(shù)皮被擦傷后，體內(nèi)富含的單寧酸等酚類物質(zhì)被氧化，呈現(xiàn)紅色，故稱紅樹(shù)[1]。秋茄隸屬紅樹(shù)科 (Rhizophoraceae) 秋茄屬 (Kandelia)紅樹(shù)植物，常綠灌木或小喬木；側(cè)枝的氣生根向下生成支柱根，葉片長(zhǎng)橢圓形，交互對(duì)生，中脈明顯；花白色，具短梗，2–5朵排列成二歧聚傘花序；果卵形，萼裂片宿存；胎生。Sheue等[2]根據(jù)葉、葉脈、萼片、花粉和胚軸等形態(tài)特征將其劃分為2個(gè)不同的品種，即秋茄Kandelia obovata和秋茄K. candel。

大多數(shù)紅樹(shù)對(duì)低溫敏感，降溫、不定期的寒冷或霜凍對(duì)其生長(zhǎng)和分布有著重要影響，而秋茄是紅樹(shù)植物中抗寒能力最強(qiáng)的樹(shù)種[3]。作為獨(dú)特的海岸生態(tài)系統(tǒng)，紅樹(shù)林在防風(fēng)減災(zāi)、促淤保灘、固岸護(hù)堤和凈化海水等方面具有重要的生態(tài)功能和價(jià)值[4]。近年來(lái)，秋茄由于其生態(tài)幅廣[3,5]、耐鹽[6-7]、耐寒[8-9]、富集重金屬[10-11]和降解有機(jī)物[12-13]等優(yōu)良特性，吸引著越來(lái)越多研究者的關(guān)注。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)秋茄開(kāi)展了大量研究，但主要集中在生理學(xué)和生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域。

隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，簡(jiǎn)單重復(fù)序列 (Simple sequence repeat，SSR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random amplification polymorphic DNA，RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間 (Inter-simple sequence repeat，ISSR)、抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)、cDNA末端快速克隆技術(shù) (Rapid-amplification of cDNA ends，RACE) 和蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics) 等分子生物學(xué)技術(shù)逐步運(yùn)用到秋茄的研究中，并取得了豐富的研究成果，不僅可為秋茄資源保護(hù)策略的制定提供依據(jù)，還可為闡明秋茄逆境脅迫耐受的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。文中綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)秋茄親緣地理關(guān)系與遺傳多樣性分析、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能基因發(fā)掘等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)該物種未來(lái)分子生物學(xué)研究的方向進(jìn)行了展望。

1 親緣地理關(guān)系與遺傳多樣性

Chiang等[14]基于葉綠體和線粒體DNA序列分析了東亞秋茄種群間的親緣地理關(guān)系，發(fā)現(xiàn)葉綠體DNA (cpDNA)atpB-rbcL基因間隔區(qū)、trnL-trnF基因間隔區(qū)和線粒體DNA (mtDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS) 序列一致表明不同種群來(lái)源的秋茄聚為兩類，其中泰國(guó)Ranong種群與馬來(lái)西亞Bako種群聚在一起；而中國(guó)欽州、北海、湛江、?？诤蛷B門等地的種群聚在一起，這與Sheue等[2]研究結(jié)果相吻合。從系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來(lái)看，Ranong種群與Bako種群相關(guān)性高，且與中國(guó)種群沒(méi)有檢測(cè)到相關(guān)性，表明Bako種群可能起源于印度洋沿岸。

此外，采用其他分子標(biāo)記的方法研究秋茄種群的遺傳多樣性也有較多文獻(xiàn)報(bào)道。Chen等[15]采用ISSR技術(shù)分析中國(guó)東南沿海7個(gè)秋茄種群的遺傳多樣性，結(jié)果顯示種群間的遺傳分化系數(shù) (GST) 為0.5548，即55.48%的變異存在于種群間，44.52%的變異存在于種群內(nèi)，這表明K.obovata種群間的遺傳分化程度相對(duì)較高；且種群遺傳多樣性基本上呈現(xiàn)出南方種群高于北方的態(tài)勢(shì)。阮宇等[16]通過(guò)SSR分子標(biāo)記方法檢測(cè)了中國(guó)東南沿海北部 (福鼎和寧德) 與南部(漳州和深圳) 秋茄種群的遺傳多樣性，遺傳多樣性指數(shù)He值分別為0.648±0.054和0.811±0.036，結(jié)果同樣表明大陸東南沿海南方種群的遺傳多樣性高于北方。

在全新世的地層中，長(zhǎng)江三角洲多處發(fā)現(xiàn)了紅樹(shù)植物的花粉[17]，表明在全新世時(shí)期，溫?zé)岬臍夂虼偈购Ｆ矫嫔仙覈?guó)長(zhǎng)江三角洲大部分地區(qū)被海水淹沒(méi)，紅樹(shù)林可能自然分布至浙江省杭州灣和江蘇省太湖地區(qū)。

有研究表明，大陸東南沿海南部地區(qū)可能是亞洲紅樹(shù)植物分布地區(qū)的多樣性中心之一[18]。向北流動(dòng)的黑潮及其分支洋流可能是秋茄種群擴(kuò)散的助力[17]，秋茄繁殖體在它們的推動(dòng)下從東南沿澎湖海底峽谷向北擴(kuò)散至杭州灣和長(zhǎng)江三角洲。

而在氣候寒冷的冰期，南方地區(qū)成為秋茄的避難所，其自然分布可能會(huì)縮至福建北部。秋茄北向拓殖的過(guò)程中，會(huì)經(jīng)歷空間奠基者效應(yīng)和種群瓶頸效應(yīng)，因而，種群中某些基因常常會(huì)在拓殖過(guò)程中丟失，這可能是北部種群的遺傳多樣性比南方避難所種群要低的原因之一。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)

近年來(lái)，秋茄蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展較快，促進(jìn)了人們從分子層面認(rèn)識(shí)秋茄防御逆境脅迫的機(jī)理。

重金屬鎘 (Cd) 通過(guò)巖石風(fēng)化和人類活動(dòng)進(jìn)入水體，是對(duì)植物有毒的主要環(huán)境污染物之一，秋茄分布于河口和海灣，其生長(zhǎng)與生存可能遭受著Cd脅迫。Weng等[19]分析了Cd脅迫下秋茄根的蛋白質(zhì)組變化，結(jié)果表明短期Cd處理下，共有53個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。約一半的上調(diào)蛋白參與氧化還原反應(yīng)，包括抗氧化酶類、谷胱甘肽合成所需酶類、三羧酸循環(huán)所需酶類，以及用于產(chǎn)生ATP、NADH和NADPH的磷酸戊糖途徑所需酶類。這些結(jié)果表明提高抗氧化反應(yīng)是秋茄應(yīng)對(duì)Cd導(dǎo)致的氧化脅迫的重要方式。

溫度是影響紅樹(shù)林分布范圍的主要限制因素，高緯度地區(qū)由于低溫嚴(yán)重影響紅樹(shù)的成活與生長(zhǎng)。為在分子水平上深入研究秋茄幼苗的低溫應(yīng)答機(jī)制，馬小偉[20]對(duì)一年生秋茄幼苗在4 ℃低溫條件下進(jìn)行了48、96和144 h不同時(shí)間的脅迫處理，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討北移紅樹(shù)植物秋茄幼苗對(duì)低溫的適應(yīng)機(jī)理。結(jié)果表明，與光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白和防衛(wèi)蛋白等均表現(xiàn)為上調(diào)，而與糖異生、能量與物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量隨低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)下調(diào)。

鹽脅迫是一個(gè)重要的非生物脅迫因子，在世界的許多地區(qū)限制著植物的成活與生長(zhǎng)。秋茄由于其耐鹽性被視為生態(tài)適應(yīng)性的模式木本植物[21]，較多的研究關(guān)注秋茄耐受鹽脅迫的機(jī)理。Wang等[22]將四葉齡秋茄苗于150 (對(duì)照)、300、450和600 mmol/L氯化鈉中培養(yǎng)3 d，從秋茄幼苗的葉中提取總蛋白，雙向電泳檢測(cè)到超過(guò)900個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，表達(dá)豐度的差異兩倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)53個(gè)，其中48個(gè)由MALDI-TOFTOF/MS技術(shù)所鑒定。結(jié)果表明，秋茄可以通過(guò)上調(diào)涉及光合作用、呼吸和能量代謝，Na+區(qū)隔化、蛋白質(zhì)折疊與包裝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)，從而可以耐受濃度高達(dá)450 mmol/L氯化鈉脅迫。

葉綠體是綠色植物通過(guò)光合作用把光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的重要場(chǎng)所，通過(guò)光反應(yīng)和暗反應(yīng)兩個(gè)階段的酶促反應(yīng)發(fā)生作用。當(dāng)受到鹽脅迫時(shí)，蛋白的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，導(dǎo)致葉綠體能量吸收和傳遞的能力降低。因此，為了適應(yīng)高鹽環(huán)境，光合作用機(jī)構(gòu)必須有效地發(fā)揮作用，基于這種思路，研究者們通過(guò)固定鹽脅迫時(shí)間或鹽脅迫濃度兩種方式來(lái)考察秋茄光合作用的適應(yīng)機(jī)制。四葉全展秋茄苗在0 (對(duì)照)、200、400和600 mmol/L NaCl中處理3 d后，葉綠體蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示：在400和600 mmol/L NaCl脅迫下，秋茄通過(guò)上調(diào)表達(dá)組分蛋白來(lái)維持光反應(yīng)水平；暗反應(yīng)在400 mmol/L NaCl下維持不變，但在600 mmol/L NaCl時(shí)下降，表明暗反應(yīng)更容易受到高濃度鹽脅迫的傷害[21]。

而四葉全展秋茄苗于500 mmol/L氯化鈉中處理0 (對(duì)照)、3和6 d后，Wang等[23]發(fā)現(xiàn)秋茄可耐受500 mmol/L氯化鈉脅迫時(shí)間為3 d，葉綠體蛋白質(zhì)組分析結(jié)果表明：其主要通過(guò)維持正?；蚋咝Ч夂想娮觽鬟f效率和盡量減少對(duì)卡爾文循環(huán)系統(tǒng)的破壞得以實(shí)現(xiàn)；同時(shí)，葉綠體中活性氧清除、氮同化、蛋白質(zhì)降解和分子伴侶功能也是秋茄耐鹽的重要原因?？傊?，鹽脅迫下葉綠體蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了秋茄響應(yīng)鹽脅迫光合作用適應(yīng)性機(jī)制的重要信息，這些發(fā)現(xiàn)有助于對(duì)木本鹽生植物鹽適應(yīng)機(jī)理的理解。

3 功能基因研究

3.1 與鹽脅迫相關(guān)的基因

對(duì)鹽脅迫下生長(zhǎng)的紅樹(shù)基因表達(dá)模式的識(shí)別將有助于揭示其耐鹽的分子機(jī)制。Huang等[24]通過(guò)代表性差異分析方法 (Representational difference analysis，RDA) 從不同濃度NaCl處理過(guò)的秋茄中分離出10條差異cDNA。鹽脅迫條件下，下調(diào)表達(dá)的5個(gè)基因中，2個(gè)編碼親環(huán)素 (Cyclophilin)，另外3個(gè)分別編碼液泡膜內(nèi)在蛋白 (Tonoplast intrinsic proteins，TIP)、早期光誘導(dǎo)蛋白和60S核糖體蛋白。秋茄親環(huán)素基因 (KcCYPl，GenBank登錄號(hào)：AY150052) cDNA全長(zhǎng)約為0.9 kb，含有一個(gè)519個(gè)核苷酸的完整開(kāi)放閱讀框 (Open reading frame，ORF)，編碼172個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.57，分子量18.2 kDa。42–49位氨基酸殘基為推測(cè)的ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)A基序 (P-loop)，48–54位氨基酸殘基是插入的7個(gè)氨基酸殘基。Northern分析表明：高鹽抑制KcCYPl基因的表達(dá)[25]。

秋茄液泡膜內(nèi)在蛋白 (TIP) 基因 (GenBank登錄號(hào)：AF521135) cDNA全長(zhǎng)為1 099 bp，含有一個(gè)759 bp的ORF，編碼252個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.77，分子量為26.3 kDa。該氨基酸序列含有6個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)高度保守的Asparagine-Proline-Alanine (NPA) 基序。Northern分析表明高鹽抑制該基因在紅樹(shù)3個(gè)種中的表達(dá)，這種下調(diào)表達(dá)可能降低液泡膜水分滲透，有利于鹽脅迫下細(xì)胞的保水[26]。將秋茄液泡膜水通道蛋白KcTIP1基因轉(zhuǎn)化煙草后，陽(yáng)性植株在鹽脅迫下的根、莖、葉鮮質(zhì)量，葉片凈光合速率，葉片組織Na+、K+積累和根尖Na+、K+內(nèi)流幅度均高于野生型煙草。表明KcTIP1具有與其他水通道蛋白類似的蛋白結(jié)構(gòu)和酶學(xué)功能，KcTIP1基因過(guò)表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗鹽能力[27]。

脫水應(yīng)答蛋白基因 (Responsive to desiccation 22，RD22)是非常重要的植物抗逆性基因。秋茄KcRD22基因的ORF長(zhǎng)1 128 bp，編碼1個(gè)等電點(diǎn)為9.07、分子量為39.8 kDa、由375個(gè)氨基酸組成的蛋白。100 mmol/L NaCl處理顯著降低了野生型煙草的凈光合速率，但對(duì)RD22陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉片的光合作用的影響較小。鹽濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株及野生型煙草凈光合速率都明顯降低；但鹽脅迫解除后，轉(zhuǎn)基因煙草光合作用的恢復(fù)情況明顯好于野生型煙草，說(shuō)明KcRD22的過(guò)表達(dá)提高了煙草的抗鹽性[28]。

基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是植物對(duì)非生物脅迫適應(yīng)機(jī)制的一個(gè)重要方面，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，在建立植物對(duì)脅迫適應(yīng)性過(guò)程中起到重要作用。乙烯應(yīng)答因子 (Ethylene-responsive factors，ERF) 是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物的逆境脅迫應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作用。秋茄KcERF(GenBank登錄號(hào)∶GU593721) 完整ORF共873 bp，編碼290個(gè)氨基酸，有一個(gè)典型的AP2結(jié)構(gòu)域。KcERF亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中，其編碼蛋白在酵母中有轉(zhuǎn)錄激活活性。此外，過(guò)表達(dá)KcERF基因煙草受到高鹽脅迫后的株高和葉面積、含水量、MDA含量、可溶性糖含量和電導(dǎo)率均表現(xiàn)出對(duì)鹽的耐受作用，暗示可以為轉(zhuǎn)基因耐鹽棉花和牧草的培育提供新的基因來(lái)源[29]。

鋅指蛋白是功能多樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子蛋白家族，家族成員在植物響應(yīng)非生物脅迫方面具有重要作用。在煙草中過(guò)表達(dá)秋茄C2H2型鋅指蛋白編碼基因KcZFP，結(jié)果顯示∶轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性明顯提高，其凈光合速率受鹽脅迫的影響小于野生型植株，光合系統(tǒng)在一定程度上得到了保護(hù)，且脯氨酸水平遠(yuǎn)高于野生型植株。研究結(jié)果說(shuō)明KcZFP作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與了植物的滲透調(diào)節(jié)，對(duì)植物的耐鹽性具有重要作用[30]。

Na+在植物葉片中的累積會(huì)提高H2O2的水平，從而對(duì)植物造成傷害。亞細(xì)胞定位分析揭示，秋茄Cu/Zn SOD編碼基因 (KcCSD) 位于葉綠體中。轉(zhuǎn)基因煙草結(jié)果表明，KcCSD過(guò)表達(dá)株系比野生型耐受Na+的能力更強(qiáng)[31]。100 mmol/L NaCl處理顯著降低野生型煙草葉綠素含量、最大葉綠素?zé)晒猓约肮庀到y(tǒng)Ⅱ的光化學(xué)效率，葉綠體中產(chǎn)生大量的H2O2；而轉(zhuǎn)KcCSD基因煙草從24 h到第7天，SOD活性持續(xù)增加，過(guò)氧化氫酶 (CAT) 酶活性也增加了，表明轉(zhuǎn)KcCSD煙草則可通過(guò)上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)減少Na+對(duì)葉綠體的傷害。

硫氧還蛋白 (Trxs) 是一類小分子蛋白，具有保守功能區(qū)域 (WCXPC)，可以通過(guò)半胱氨酸(Cys) 的二硫鍵的形成以及斷裂，從而具有氧化還原的作用。研究表明，過(guò)表達(dá)KcTrxf的轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性增強(qiáng)，其原因是一方面通過(guò)提高CAT以及抗壞血酸過(guò)氧化物酶 (APX) 的活性來(lái)清除H2O2；另一方面通過(guò)調(diào)節(jié)抗壞血酸-谷胱甘肽 (AsA-GSH) 循環(huán)中的關(guān)鍵酶單脫氧抗壞血酸還原酶 (MDAR) 以及谷胱甘肽還原酶(GR)的活性來(lái)增加還原型谷胱甘肽水平；同時(shí)，還增加了葉片中非蛋白巰基的含量，進(jìn)而清除活性氧，減少鹽害引起氧化脅迫[32]。

3.2 與代謝相關(guān)的基因

三萜類化合物 (Triterpenoids) 是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物界中，有抗菌和抗蟲(chóng)害等作用。三萜類化合物由2,3-氧化鯊烯經(jīng)環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶 (Oxidosqualene cyclases，OSCs) 催化后環(huán)化形成。Basyuni等[33]根據(jù)已知OSCs中的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從秋茄的幼根中克隆得到多功能三萜合酶基因(KcMS)。KcMS的ORF由2 286 bp構(gòu)成，編碼761個(gè)氨基酸。將KCMS構(gòu)建在表達(dá)載體pYES2中，轉(zhuǎn)化羊毛甾醇合酶缺陷型酵母，GC-MS分析表明，轉(zhuǎn)化子積累羽扇豆醇、β-香樹(shù)脂醇和α-香樹(shù)脂醇的混合物 (2∶1∶1)，這表明KcMS具有編碼多種三萜化合物的功能。

植物甾醇也是由2,3-氧化鯊烯環(huán)在環(huán)阿屯醇合成酶 (Cycloartenol synthase，CAS) 催化下轉(zhuǎn)變而來(lái)的。Basyuni等[34]通過(guò)RACE技術(shù)克隆得到秋茄CAS基因 (KcCAS)，結(jié)果顯示KcCAS基因ORF包含2 277 bp，編碼758個(gè)氨基酸，與百脈根Lotusjaponicus同源性高達(dá)82%。將該基因轉(zhuǎn)入羊毛固醇合酶 (Lanosterol synthase)缺陷性釀酒酵母菌株GIL77中，GC-MS分析轉(zhuǎn)基因酵母中累積環(huán)阿屯醇，表明KcCAS具有環(huán)阿屯醇合成酶的活性。

將秋茄置于0.5%、1%、1.5%、2%和3%的人工海水中培養(yǎng)，其根和葉中三萜類化合物的含量隨著鹽度升高均顯著增加，同時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：KcMS基因的表達(dá)也與鹽度顯著正相關(guān)；而甾醇類物質(zhì)則與鹽度沒(méi)有明顯的線性關(guān)系，KcCAS基因的表達(dá)也不受鹽濃度的調(diào)控。表明有助于秋茄對(duì)鹽度適應(yīng)的物質(zhì)是三萜化合物而不是甾醇類物質(zhì)[35]。

3.3 與重金屬脅迫相關(guān)的基因

金屬硫蛋白 (Metallothionein) 是一類低分子質(zhì)量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，它們通過(guò)半胱氨酸殘基上的巰基與重金屬結(jié)合形成無(wú)毒或低毒的絡(luò)合物。Zhang等[36]通過(guò)RACE技術(shù)從秋茄中克隆到一個(gè)Ⅱ型金屬硫蛋白基因KMT，其ORF包含240 bp，編碼79個(gè)氨基酸，中間有Cys-Cys、Cys-X-Cys和Cys-X-X-Cys結(jié)構(gòu)。將KMT基因轉(zhuǎn)入蛋白酶缺陷型的大腸桿菌菌株BL21 (DE3) 后，重組菌能在1 000 μmol/L的Zn、120 μmol/L的Hg和2 000 μmol/L的Cd環(huán)境中生長(zhǎng)，這些結(jié)果暗示著秋茄可能通過(guò)KMT基因編碼產(chǎn)物吸附重金屬，從而減輕海洋環(huán)境中的重金屬污染。

3.4 與低溫脅迫相關(guān)的基因

低溫是嚴(yán)重限制紅樹(shù)生產(chǎn)力和分布的主要非生物脅迫因素，而紅樹(shù)林耐受低溫的分子機(jī)制仍然知之甚少。對(duì)低溫脅迫基因的功能分析將有利于理解紅樹(shù)植物低溫適應(yīng)的分子機(jī)理。Fei等[37]通過(guò)抑制性消減雜交 (Suppression subtractive hybridization，SSH) 技術(shù)確定秋茄冷脅迫相關(guān)的潛在基因。對(duì)文庫(kù)670個(gè)克隆中334個(gè)冷相關(guān)的表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)進(jìn)行測(cè)序，其中143個(gè)cDNA根據(jù)NCBI Blast被分成10個(gè)組，如新陳代謝、能量、細(xì)胞救援和防御、轉(zhuǎn)錄和光合作用等。從文庫(kù)中選擇的兩個(gè)基因 (水通道蛋白基因和鋅家族蛋白基因) 進(jìn)一步通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行分析，結(jié)果表明，這兩個(gè)基因在冷脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，與消減cDNA文庫(kù)結(jié)果吻合。

熱休克蛋白70 (HSP70) 是HSP家庭中的重要成員，在植物各種應(yīng)激保護(hù)中發(fā)揮著作用。Fei等[38]通過(guò)RACE技術(shù)克隆得到秋茄HSP70基因(KoHSP70)，其ORF由1 959 bp核苷酸構(gòu)成。熒光定量PCR結(jié)果顯示，KoHsp70的表達(dá)起初維持在一定水平，冷脅迫48 h表達(dá)量顯著上升，168 h到達(dá)最高水平。結(jié)果表明，KoHsp70基因的表達(dá)可被誘導(dǎo)且在秋茄低溫脅迫的保護(hù)反應(yīng)中發(fā)揮作用。

4 小結(jié)與展望

秋茄是生活在熱帶、亞熱帶潮間海岸帶的重要植物，其特殊的生境使之成為人們研究木本植物對(duì)鹽、重金屬和水淹耐受機(jī)理的重要材料。盡管關(guān)于秋茄分子生物學(xué)的研究逐年增加，并取得了一定的成果，但是不得不承認(rèn)該研究起步較晚，與楊樹(shù)、蘋果、桃、桑樹(shù)和麻瘋樹(shù)等許多木本植物相比較為落后，秋茄的基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等工作也尚未見(jiàn)報(bào)道，目前較多的工作集中在鹽脅迫下蛋白質(zhì)組和基因克隆的研究，而功能基因克隆也多限于表達(dá)模式分析和原核表達(dá)階段，對(duì)于轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證方面的工作開(kāi)展相對(duì)較少。秋茄為耐寒性最強(qiáng)的紅樹(shù)植物，是海防造林重要的樹(shù)種，因而頗受人們的青睞。秋茄已成功引種至浙江省溫州和臺(tái)州海岸帶多年，然而，由于冬季低溫脅迫誘發(fā)的越冬困難使得繼續(xù)北引難度增大許多，關(guān)于生理生態(tài)學(xué)的研究已有較多報(bào)道，但其深層次的機(jī)理仍然不明，筆者克隆到秋茄與低溫脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CBF/DREB基因，并實(shí)現(xiàn)其在原核生物中的表達(dá)，下一步擬通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)探索其與順式作用原件的結(jié)合特性，旨在揭示秋茄低溫適應(yīng)的分子機(jī)理。研究秋茄低溫適應(yīng)的分子機(jī)制，并通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造，培育低溫適應(yīng)能力更強(qiáng)的品系，擴(kuò)大秋茄種群規(guī)模，使其向緯度更高的地區(qū)種植，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Advances in molecular biological studies of the mangroveKandelia obovataSheue, Liu & Yong

Zhaokui Du1,2,3, He Chen4, and Junmin Li1,2,3
1Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Evolutionary Ecology and Conservation,Taizhou318000,Zhejiang,China
2Institute of Ecology,Taizhou University,Taizhou318000,Zhejiang,China
3School of Life Sciences,Taizhou University,Taizhou318000,Zhejiang,China
4Administration Bureau of Dongzhai Harbor National Nature Reserve,Haikou571129,Hainan,China

Kandelia obovataSheue, Liu & Yong, a mangrove species which distributed in tropical, subtropical coastal and estuarine intertidal, has important ecological functions in coastal ecosystems. Here, we reviewed several aspects of the recent research progress in molecular biological studies ofK.obovata. We focused the phylogeography and genetic diversity of this species by several types of molecular markers, proteome analyses based on two-dimensional electrophoresis platform accomplished for this species, and functional genes isolated under non-biotic stress environment. Finally, based on the current research progress, we proposed some orientations for future molecular biological research onK.obovata.

Kandelia obovata, molecular marker, salt stress, proteome, gene cloning

Junmin Li. Tel: +86-576-85137178; E-mail: lijm@tzc.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31270461), 浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題 (No. EEC2014-05), 臺(tái)州市科技局項(xiàng)目

(No. 1403KY03) 資助。

時(shí)間：2016-12-01

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161201.1617.001.html

Received:July 18, 2016;Accepted:November 14, 2016

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31270461), Opening Project of Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Evolutionary Ecology and Conservation (No. EEC2014-05), Project of Taizhou Science and Technology Bureau (No. 1403KY03).