Cathelicidins結構與功能的關系及其分子設計研究進展

王晨，馮蘭，于海寧，王義鵬

1 大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024 2 蘇州大學 藥學院，江蘇 蘇州 215123

Cathelicidins結構與功能的關系及其分子設計研究進展

王晨1，馮蘭1，于海寧1，王義鵬2

1 大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024 2 蘇州大學 藥學院，江蘇 蘇州 215123

Cathelicidins作為大多數(shù)脊椎動物所特有的宿主防御肽，除了具有高效廣譜的抗菌活性外，還具有如抗炎癥、傷口修復、抑制組織損傷和促進血管生成等重要活性，因此成為蛋白多肽類新藥研發(fā)熱點。近年來，以其為模板進行的結構改造主要有以下幾類：通過點突變、氨基酸替換、活性片段拼接、化學修飾以及軛合物和二聚體構建等手段提高cathelicidins的生物學活性；通過添加或刪減氨基酸殘基和破壞Leu和Phe拉鏈結構等手段可以降低cathelicidins的細胞毒性和溶血活性；通過D-型氨基酸替換L-型氨基酸、構建環(huán)形和固位型cathelicidins的方式增強其體內外穩(wěn)定性等。

Cathelicidins，結構，功能，分子設計，穩(wěn)定性

當今抗生素的過度濫用引起的多重耐藥菌感染導致每年至少有25 000名患者死亡，因此尋找傳統(tǒng)抗生素的替代品已成為醫(yī)學界急需解決的難題[1–3]。脊椎動物所特有的宿主防御肽cathelicidins (CATHs) 由于具有高效廣譜的抗菌活性，以及抑制組織損傷、抗炎癥、傷口修復和促進血管生成等一系列免疫調節(jié)活性，成為蛋白多肽類新藥尤其是新型抗生素的研發(fā)熱點。然而，生物活性不夠強、具有溶血及細胞毒性、容易被蛋白酶降解等缺點卻限制了其廣泛應用。因此以cathelicidins為模板進行的分子設計與改造近年也有了很快發(fā)展。

1 Cathelicidin簡介

CATHs是一類廣泛存在于脊椎動物體內的宿主防御肽，其前體由 N-端信號肽、高度保守的cathelin區(qū)和高度特異的C-末端成熟肽構成，具有廣譜抗菌活性[4]。常見CATHs二級結構有α螺旋、β折疊、延伸-螺旋和不太多見的環(huán)狀結構[5]。1) α-螺旋類CATHs：分子結構以α螺旋為主，具有很好的兩親性，通常無分子內二硫鍵，N-端含有較多的親水氨基酸，C-端富含疏水氨基酸。人源LL-37為此類的典型代表[6]。2) β-折疊類CATHs：具有反向平行的β折疊結構，其分子內有4個保守的Cys可形成2個二硫鍵，可起到穩(wěn)定多肽結構的作用，如豬 CATHs: PG-1b、PG-2b、PG-3b、PG-4b和 PG-5b等[7]。3) 延伸-螺旋型CATHs：該類CATHs不形成典型的二級結構，也不形成分子內二硫鍵，但是通常富含某些特定的氨基酸殘基 (AA)，如：Arg、Trp和 Pro。常見的有富含 Arg和 Pro的PR-39[8]以及富含 Trp的 Indolicidin[9]。4) 環(huán)狀CATHs：分子內含有一個二硫鍵，整體呈現(xiàn)環(huán)鏈結構，大多兩棲類蛙來源的CATHs，還有綿羊的OaDode和牛的Dodecapeptide[10]均為此結構。本文將針對不同 CATHs的結構與功能、作用機制與成藥性特征進行的結構改造手段進行綜述。

2 Cathelicidins殺菌機理及特點

大部分CATHs家族抗菌肽具有兩親性的α-螺旋結構并且富含帶正電荷的AA。含有磷壁酸的革蘭氏陽性菌 (G+菌) 細胞壁以及含有脂多糖的革蘭氏陰性菌 (G–菌) 細胞壁均帶負電荷，而帶正電荷的CATHs可以首先通過靜電吸附聚集至細菌表面，進而發(fā)揮破壞微生物膜形態(tài)的作用[11]。雖然目前作用機制仍不明確，但普遍推測此類抗菌肽可以通過“地毯”或者“桶板”模型兩種機制破壞微生物細胞膜，發(fā)揮抗菌作用?！暗靥骸蹦Ｐ屯ǔＰ枰?CATHs富含正電荷AA，但不需要具有特定的二級結構。陽離子CATHs與細菌細胞膜的磷脂雙分子層中帶負電的磷脂分子頭基相互靜電吸引，CATHs以地毯式覆蓋在細菌細胞膜表面，通過轉動最終使親水側朝向磷脂分子頭基，疏水側朝向疏水核心破壞細胞膜，導致細菌裂解死亡，如LL-37[12]。與“地毯”模型不同的是，“桶板”模型既需要CATHs富含陽離子又需要特定的二級結構使其具有兩親性，如 α-螺旋和 β-折疊。在此模型中CATHs相互識別并聚集在細菌細胞膜表面，親水區(qū)域與磷脂頭基相互吸引，疏水區(qū)域與細胞膜的疏水核心相互作用，最終在膜上形成孔洞，引起細菌死亡[13]。

除了對細胞膜的破壞作用，一些CATHs可以通過干擾細菌的正常生理功能來發(fā)揮抗菌作用，例如：阻斷DNA合成、影響RNA轉錄、干擾蛋白的加工折疊以及阻斷能量供應和營養(yǎng)物質吸收等[14]。而傳統(tǒng)抗生素大多數(shù)是通過與微生物的酶發(fā)生作用，干擾其正常的生命活動，需要較長時間才能發(fā)揮作用。因而CATHs作為新藥模板或新型抗生素替代品的優(yōu)勢是：1) 抗菌譜廣，對G+菌、G-菌、真菌、霉菌、原蟲和部分有包膜病毒均有活性。2) 抗菌活性強，最小抑菌濃度 (MIC)可以達到 nmol/L水平,且殺菌作用迅速。2) 不易誘導微生物產(chǎn)生耐藥性，對大量臨床耐藥菌株，甚至是超級耐藥菌，具有非常強的活性[15–16]。3) 低溶血性及細胞毒

性[17–18]。4) 相對于溶菌酶和防御素等蛋白類抗生素，分子量小，不含有二硫鍵，結構簡單。5) 生產(chǎn)工藝簡單，成本低。6) 除了直接的抑菌殺菌活性外，還具有多種免疫調節(jié)活性[19–20]。

3 Cathelicidins的結構改造與策略

雖然CATHs家族活性肽具有以上的優(yōu)勢，但某些特點仍然限制了其廣泛應用。由結構特點所致的強抗菌活性通常伴隨著較強的溶血活性；且蛋白的穩(wěn)定性低，容易被蛋白酶水解等。因此針對該家族肽的結構改造一直是相關領域研究熱點。

3.1 提高CATHs生物活性的改造

3.1.1 氨基酸替換法

替換天然CATHs某些特定的氨基酸殘基是增強其抗菌活性的重要手段。早在 2005年Hilpert等發(fā)現(xiàn)將具有典型的 α-螺旋結構牛CATH-Bac2A的第3位Ala替換為Trp，得到的W3抗菌活性提高了6-8倍[21]。隨后Zhu等在對豬 CATH、PMAP-36的研究中，先截取PMAP-36的α螺旋區(qū)域得到RI16，然后用Trp替換成對存在的帶正電荷的AA (Lys 和Ar) 分別得到PRW3、PRW4、PRW5和PRW6，抗菌活性提高了8-16倍[22]，原因可能為RI16含有較多的Lys和Arg，而Trp的側鏈為被帶負電荷π電子云環(huán)繞的吲哚基，吲哚基的存在有助于使得帶正電荷的基團滲入到細胞膜的雙分子層中，進而使疏水面更深地插入到細菌細胞膜中破壞其完整性。Concetta等用疏水性較強的Ala替代歐洲林蛙來源的Temporin-B中疏水較弱的Gly，得到的衍生物對 G+菌的抗菌活性明顯增強；把來自黑龍江林蛙的Temporin-1Ceb α-螺旋的親水面5-6個非極性氨基酸替換為Lys，改造體抗菌活性提高了 10-40倍[23]，原因可能是提高了抗菌肽的陽離子性和兩親性。

3.1.2 片段拼接法

將CATHs活性區(qū)域與同家族或者其他活性肽的活性區(qū)域直接進行拼接也是提高CATHs抗菌活性、或引入其他性能的常見手段。鑒于CATHs結構與功能關系，常利用截短改造的方法可得到其活性區(qū)域。PMAP-36由36個AA組成，Lv等舍去C端12個AA僅保留N端24個AA，其截短產(chǎn)物GI24的抗菌活性與PMAP-36活性一致[24]。人LL-37的只含19個AA的截短產(chǎn)物 IG-19仍然具有很強的抗菌活性[25]。對雞的cathelicidin-2 (CATH-2) 進行截短改造，僅保留C11-21，仍然有很好的抗菌活性[26]。

將 2個以上活性截斷體拼接后往往會得到具有所有截短體活性特征的拼接體。將LL-37 α螺旋區(qū)分別與 magainin II、magainin II (alaninated) 和cecropin A的活性區(qū)域進行拼接分別得到MALL、LLaMA和CaLL。其中LLaMA和CaLL具有很好的抗菌活性，尤其是CaLL的活性更加突出[27]。Ma等將豬源 PMAP-36的改造產(chǎn)物PRW-4與雞fowlicidin-2的α螺旋區(qū)域進行拼接得到PR-FO；將PRW-4與protegrin-3的β折疊區(qū)域進行重組得到PR-PG；將PRW-4與tritrpticin的活性區(qū)域結合得到 PR-TR，與模板肽相比這 3條重組肽的抗菌活性尤其是對耐藥菌的活性，得到了明顯提升。其中PR-FO活性最好，抗菌活性提高了近 13倍[28]。我們將海蛇Hc-CATH活性區(qū)域Hc3截斷后與trpsin inhibitor loop、ORB-C雙向拼接，再通過關鍵殘基替換，得到4個改造體，與Hc3相比，不僅保留了強抗菌抗炎活性，低溶血低毒性，更極大提高了對理化條件 (NaCl、pH和血清等) 及蛋白酶的穩(wěn)定性。

3.1.3 化學修飾法

對天然CATHs進行化學修飾也是增強其抗菌活性的常見手段。LL-37的改造體，17F2 (GX1KRLVQRLKDX2LRNLV，X1X2均為Phe，Leu為D型氨基酸)，在模擬膜環(huán)境中的高級結構為非典型的兩親結構，無粘聚力的側鏈，造成了其結構上的疏水缺陷。通過引入更大的疏水化學基團的填充17F2的疏水凹槽，以增強其抗菌活性。4-三氟甲基苯基丙氨酸(4-triuoromethyl phenyl alanine)、2-萘基丙氨酸(2-naphthylalanine) 和聯(lián)苯基丙氨酸(Biphenylalanine)均為氨基酸類似物，也可以看作 Ala的側鏈經(jīng)疏水基團修飾的產(chǎn)物。在檢測的 6株菌株中，無修飾的17F2僅對3株表現(xiàn)出抗菌活性，而修飾的改造體對 6株菌均有抗菌活性且抗菌活性得到很大提升，其中17BIPHE2活性最好。后續(xù)研究中還發(fā)現(xiàn)17F2和6種化學修飾改造體除了通過破壞細菌細胞膜完整性從而發(fā)揮其抗菌活性，還能夠進入細胞與DNA結合，并且抗菌活性與DNA結合能力呈正相關[29]。因而推測化學修飾增強活性的原因可能是提高了CATHs的兩親性和DNA結合能力。

3.1.4 二聚體的構建

一些含有 Cys的抗菌肽能夠形成由二硫鍵連接的二聚體，使得生物活性明顯提高。此種手段也可應用于含有 Cys的 CATHs的優(yōu)化改造。實驗表明二聚化的 LLP1、Analogue 5、magG3C和TL1的抗菌活性均得到明顯提升，最高提升了16倍[30]。同時還發(fā)現(xiàn)LLP1的單體和二聚體形式的二級結構均為 α-螺旋，說明二硫鍵不會改變多肽原有的二級結構。二聚化也可能提高抗菌肽的其他一些生物活性，比如PST13-RK (一類 β-轉角抗菌肽) 經(jīng)二聚化修飾后，其抗癌活性明顯提高[31]。

3.1.5 軛合物的構建

該類CATHs的組成模式為：CATH-連接體-功能域，其中CATHs行使殺滅微生物的功能，功能域能夠識別特定的微生物，連接體將二者連接。連接體區(qū)域通常形成絞鏈區(qū)，功能域為非線性肽或者非肽類分子。SMAP-28是來自綿羊的 α-螺旋 CATH，用馬來酰亞胺作為連接體將其與牙齦卟啉單胞菌Porphyromonas gingivalis菌株表面特異性抗體IgG進行連接可形成一種軛合物，這種改造體在低濃度條件下 (20 μg/mL) 可選擇性殺滅 P．gingivalis，而對伴放線放線桿菌Aggregatibacter actinomycetemcomitans和微小消化鏈球菌Peptostreptococcus micros不表現(xiàn)出抗菌活性，但在高濃度條件下 (50 μg/mL)，對 3種試驗菌均表現(xiàn)出殺滅活性[32]。

將功能域換為靶向體，將得到另一類軛合物：CATHs-連接體-靶向體。靶向體是一類能夠識別特定病原菌的區(qū)域，與功能域不同的是該區(qū)域為線性肽。與之類似的是特異性靶向抗菌肽 (Specifically targeted antimicrobial peptides, STAMPs)[33]，這種構建方式將致病菌信息素末端的氨基酸序列整合到抗菌肽上，使整個分子可以被信息素感受器識別，從而更加有效地破壞特定微生物的細胞膜，將其殺滅[34]。該類CATHs在多種細菌共棲的環(huán)境中，可以選擇性地殺滅有害微生物，在維持動物腸道健康方面有著得天獨厚的優(yōu)勢。

富含Lys的抗菌肽與抗生素新霉素B可形成軛合物，也可應用于對CATHs的改造研究中。Bera對該軛合物的殺菌活性研究結果表明，其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus的活性較肽和新霉素相比提高了 8倍，但殺滅其他革蘭氏陽性菌的活性卻有所下降，同時對革蘭氏陰性菌的活性提升較為明顯，與新霉素和肽相比分別提升了4-8倍和12倍[35]。

將脂肪酸與抗菌肽相連也可增強抗菌活性。脂肪酸鏈的長度不超過16個時，其抗菌活性與脂肪酸鏈碳原子數(shù)呈正相關[36]，機制可能為脂肪酸鏈增加了肽的疏水性，從而加強了其與膜的親和性進一步提高了抗菌活性。

將CATHs作為佐劑，與抗原形成的軛合物，還能夠提高機體的免疫反應。將編碼 LL-37的基因與編碼巨噬細胞集落刺激因子受體(M-CSFRJ6-1)的基因進行融合表達，表達得到的軛合物能夠高效誘導免疫反應，刺激脾臟細胞分泌 IFN-γ和 IL-4，并且能夠延長接種P2/0-CSFRJ6-1腫瘤細胞小鼠的壽命[37]。

3.2 提高CATHs細胞選擇性的改造

3.2.1 點突變

豬Tritrpticin富含Arg和Trp，具有很強的抗菌活性，但是溶血性較高，對真核細胞的殺傷作用成為阻礙其臨床應用的障礙之一。將Tritrpticin的所有Arg替換為Lys得到TRK，雖然抗菌活性僅略微提升，但溶血活性降低近 40倍[38]。羊Ovispirin-1是SMAP-29的前體，具有很強的抗菌活性但同時也具有很強的人上皮細胞有毒性，人紅細胞溶血性。在保留Ovispirin-1兩親性的基礎上，用弱疏水的Gly取代第10位強疏水的Ile，得到Ovispirin G-10，保留其抗菌活性的基礎上，溶血活性降至僅2.5%，同時對子宮細胞ME-80和肺癌細胞A-549的細胞毒性也極大降低，原因是降低了強疏水氨基酸的比例[39]。

3.2.2 破壞Leu和Phe拉鏈結構

牛BMAP-27具有廣譜的抗菌活性和中度溶血活性。其二級結構為 α-螺旋，N-端含有較多的Leu，C-端含有較多的Phe，分別位于a位點和d位點，幾乎在α-螺旋的一側排列，因而在N-端和C-端分別形成Leu拉鏈和Phe拉鏈結構，該結構與溶血活性密切相關。將位于a位點和d位點的Phe和Leu用Ala替代，可以破壞拉鏈結構得到 4條改造體，對人血紅細胞的溶血活性幾乎消失，而原始肽在濃度為50 μmol/L條件下溶血率在 20%以上[40]。研究還發(fā)現(xiàn)改造體對鼠的3T3細胞的細胞毒也明顯低于原始肽。

3.3 提高CATHs穩(wěn)定性

作為蛋白多肽類藥物，CATHs也面臨被環(huán)境中、動物體內的蛋白酶家族水解的難題。如何提高其酶穩(wěn)定性是蛋白類藥物應用亟待解決的首要難題[41]。

3.3.1 D-型氨基酸替換L-型氨基酸

將GF-17 (LL-37的C17-32片段) 的20、24和 28位 AA替換為 D-型氨基酸，得到的GF-17d3，在與糜蛋白酶共孵育后仍具有抗菌活性。說明GF-17d在存在糜蛋白酶的環(huán)境中有較好的穩(wěn)定性。但若只替換第20位氨基酸或者第20、24位的L-型Ile為D-Ile，則對糜蛋白酶的穩(wěn)定性沒有明顯的改變[42]。在本次研究中雖然用D-型氨基酸替換相應的L-型氨基酸可以提高CATHs的穩(wěn)定性，但其抗菌活性卻不如原始肽。Mathison等研究者發(fā)現(xiàn)將鼠FEG的所有氨基酸殘基由L-型轉變?yōu)镈-型后，抗蛋白酶解能力顯著提升，并且D-型肽在含有NaCl、MgCl2和血清的環(huán)境中抗菌活性高于L-型[43–44]。

3.3.2 環(huán)形CATHs的構建

將多肽的骨架進行環(huán)化是一種有效的增強穩(wěn)定性的手段。一般分為兩種，一種是共價鍵連接 N-端的-NH3和 C-末端的-COOH；另一種是N-端Cys和C-端Cys的-SH形成二硫鍵。將富含 Arg和 Trp的短肽進行環(huán)化，發(fā)現(xiàn)其酰胺鍵環(huán)化類似物在酶中的穩(wěn)定性顯著提高[45]。

3.3.3 構建模擬型CATHs

CATHs的抗菌活性與其理化性質及高級結構密切相關，通過模擬其高級結構有望構建在體內體外環(huán)境中較為穩(wěn)定的模擬型CATHs。目前已被成功模擬的二級結構主要有：α-螺旋、β-折疊、β-轉角和loop等[46]。其次，采用寡?；嚢滨：皖惞檀?胺共價物低聚體(Oligoacyllysines，OAKs)來模擬CATHs的兩親性和正電荷性，并且寡?；嚢滨５氖杷钥梢酝ㄟ^調控?；湹拈L度實現(xiàn)[47]。由此該類化合物既能發(fā)揮抗菌性能，同時又具有抗蛋白酶降解、耐酸等優(yōu)點[48]。

3.3.4 構建固位型CATHs

通過化學或物理方法將CATHs固定在載體上，形成固位型CATHs，可使穩(wěn)定性顯著增強，如固位型LL-37[49]。固位后CATHs的二級結構、間隔區(qū)、密度、活性序列、易變性、固定鏈位置和周圍環(huán)境都會影響其生物學效價[50]。但研究表明間隔區(qū)的長短、固定鏈的位置及 N端的疏水性殘基比表面密度對于抗菌活性而言更加重要。

4 展望

CATHs作為優(yōu)秀的抗感染抗炎癥新藥模板，近年來對其進行的分子改造已成為熱點，目的均是最大限度地提升其藥理學活性，降低毒副作用及解決蛋白類藥物所特有的穩(wěn)定性差的問題。目前圍繞CATHs的結構、帶正電荷以及疏水性AA的數(shù)量及位置，對CATHs進行功能改造，如殘基替換、構建雜合肽、截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽鏈的正電荷含量等手段均取得了較大進展，已有一些優(yōu)勢改造體除藥理活性明顯提升外，成藥性也得到顯著加強，已進入臨床研究。隨著結構生物學的發(fā)展，更多CATHs的三維結構可被精確模擬，在此基礎上的結構和功能關系以及分子設計將得以更加定性定量的發(fā)展。

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(本文責編 陳宏宇)

Relationship between structure and function of cathelicidins and their molecular design: a review

Chen Wang1, Lan Feng1, Haining Yu1, and Yipeng Wang2

1 School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China
2 College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, Jiangsu, China

Cathelicidins play critical roles in mammalian innate immune defense against invasive bacterial infection. Inaddition to their broad-spectrum bactericidal effect, cathelicidins are interesting peptide-based drug templates because they have multiple functions including anti-inflammatory, wound healing, and angiogenesis promotion. This article summarizes the aim and method of cathelicidin molecular designs. Residue mutation, fragment assembly, chemical modification, and construction of conjugates and dimers are usually used to increase the biological activities. Addition or deletion of certain residues, disruption of leucine zipper and phenylalanine zipper are used to reduce the hemolysis and cytotoxicity. By substituting L-amino acids with D-amino acids, circular constructions and immobilization, cathelicidins’ in vitro and in vivo stability could be greatly enhanced, especially their proteinase resistance.

cathelicidins, structure, function, molecular design, stability

Haining Yu. Tel/Fax: 86-411-84708850; E-mail: yuhaining@dlut.edu.cn

10.13345/j.cjb.160247

Received: June 24, 2016; Accepted: September 6, 2016

Supported by: Research Projects of Liaoning Ocean and Fisher Administration (No. 201404). Suzhou Science and Technology Development Project (Nos. SYN201407, SYN201504), Haimen Science and Technology Development Project (No. 2015NY06), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20160336), Natural Science Fundation of College in Jiangsu Province (No. 16KJB35004).

遼寧海洋與漁業(yè)廳項目 (No. 201404)，蘇州市科技計劃應用基礎項目 (Nos. SYN201407, SYN201504)，海門市科技計劃 (No.

2015NY06) 江蘇省自然科學基金 (No. BK20160336)，江蘇省高校自然科學基金 (No. 16KJB35004) 資助。

王晨, 馮蘭, 于海寧, 等. Cathelicidins結構與功能的關系及其分子設計研究進展. 生物工程學報, 2017, 33(1): 27–35.

Wang C, Feng L, Yu HN, et al. Relationship between structure and function of cathelicidins and their molecular design: a review. Chin J Biotech, 2017, 33(1): 27–35.