MTT法與CCK—8法檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性的比較研究

楊冬萍 楊曉旭 俞洋

【摘要】目的：探討MTT法和CCK-8法對(duì)細(xì)胞活性檢測的最佳實(shí)驗(yàn)條件，并比較二者的優(yōu)缺點(diǎn)。方法：取傳至第5代的兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，分別用MTT試劑和CCK-8試劑檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果：MTT法最佳檢測波長為570nm，最佳檢測時(shí)間在加入試劑后4h，細(xì)胞數(shù)量在125×103～2×104之間檢測較好；CCK-8法最佳檢測波長在450nm，最佳檢測時(shí)間在加入試劑4～6h，適宜的細(xì)胞檢測范圍為125×103～1×104。結(jié)論：MTT法較CCK-8法細(xì)胞檢測范圍更廣，孵育時(shí)間更短，是一種優(yōu)于CCK-8法的細(xì)胞活性檢測方法。

【關(guān)鍵詞】MTT；CCK-8；兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；細(xì)胞活性

【中圖分類號(hào)】R-332【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）06-0031-04

檢測細(xì)胞活性與增殖的方法有很多，如乳酸脫氫酶釋放法、臺(tái)盼藍(lán)拒染法、集落形成法、流式細(xì)胞儀法、熒光染色法、MTT比色法等，其中，MTT比色法自1983年Mosmann建立以來，由于其簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，成為定量檢測細(xì)胞生長和增殖的理想方法[1]。但由于MTT生成的產(chǎn)物Formazan為非水溶性的，需要有機(jī)溶劑（DMSO、異丁醇等）才能溶解，且在吸出培養(yǎng)液時(shí)可能會(huì)因操作不當(dāng)，丟失部分Formazan，導(dǎo)致結(jié)果可重復(fù)性差。針對(duì)MTT法的不足，研究發(fā)現(xiàn)了很多水溶性的四氮唑藍(lán)類：如XTT法[2]、MTS法[3]、Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）法[4]等。本文以兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，探討MTT法和CCK-8法對(duì)細(xì)胞活性檢測的最佳實(shí)驗(yàn)條件，并對(duì)二者的優(yōu)缺點(diǎn)做一比較。

1儀器與材料

11儀器E680酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-RAD公司）。

12[JP3]材料MTT試劑（南京凱基批號(hào)：2016114）；CCK-8試劑（日本同仁化學(xué)，貨號(hào)：CK04）；DMSO（Aladdin，CAs Number：67-68-5）；第5代兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。[JP]

2方法

21最佳檢測波長和最佳孵育時(shí)間的確定取對(duì)數(shù)生長期的兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，025%胰蛋白酶消化約3min，計(jì)數(shù)，以每孔細(xì)胞密度5×103個(gè)，接種于96孔板內(nèi)，每孔100μL的細(xì)胞懸液，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，96孔板四周用PBS填充，以避免孔內(nèi)液體蒸發(fā)，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。CCK-8組每孔加入10μL CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱孵育1、2、3、4、6h后，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔不同波長下的OD值；MTT組每孔加入50μL的MTT試劑，放入培養(yǎng)箱孵育1、2、3、4、6h后，吸出上清液，每孔加150μL的DMSO，避光搖床放置10min，用酶標(biāo)儀檢測各孔不同波長下的OD值。酶標(biāo)儀的內(nèi)置檢測波長均為405、450、490、570、590nm。

22細(xì)胞數(shù)量與吸光度的關(guān)系將對(duì)數(shù)生長期的兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，以025%胰蛋白酶消化約3min，低速離心，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，使每組細(xì)胞密度從高到低依次稀釋成2×104、1×104、5×103、25×103、125×103、63×102、31×102個(gè)/孔，接種于96孔板內(nèi)，每個(gè)濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，分別加入10μL CCK-8試劑和50μL MTT試劑，在酶標(biāo)儀上測量其OD值。

3結(jié)果

31最佳檢測波長的確定如圖1、2所示，在檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性時(shí)，MTT法和CCK-8法在不同的檢測波長條件下，OD值均變化明顯。其中MTT法在570nm波長處時(shí)，吸光峰值最高且最敏感；CCK-8法在波長450nm處時(shí)，吸光峰值最精準(zhǔn)。因此，實(shí)驗(yàn)中MTT法的最佳檢測波長應(yīng)選570nm處，CCK-8法的最佳檢測波長選擇450nm處。

32最佳檢測時(shí)間的確定如圖1、2所示，MTT法在1～4h孵育時(shí)間內(nèi)，表現(xiàn)為隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，OD值越來越高，呈上升趨勢，在4h時(shí)間點(diǎn)OD值達(dá)到最大，4～6h時(shí)段有下降趨勢；CCK-8法顯示：在1～6h不同孵育時(shí)間段內(nèi)，其OD值與培養(yǎng)時(shí)間表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系。因此，在檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性時(shí)，MTT法的最佳檢測時(shí)間應(yīng)選擇在加入試劑孵育后的4h，CCK-8法的最佳檢測時(shí)間在加入試劑孵育后4～6h時(shí)間段都是可以的。

33細(xì)胞數(shù)量與吸光度OD值的關(guān)系由圖3可知，當(dāng)兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞數(shù)在31×102～2×104時(shí)，MTT法和CCK-8法均表現(xiàn)為隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，OD值呈上升趨勢。其中MTT法細(xì)胞數(shù)在125×103～2×104之間時(shí)表現(xiàn)為良好的線性關(guān)系，CCK-8法適宜的細(xì)胞檢測范圍是125×103～1×104。

4討論

[JP2]MTT法原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，將MTT[3-（4，5Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，簡稱噻唑藍(lán)]還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞此酶消失，MTT不被還原。由于Formazan的生成量與活細(xì)胞數(shù)量及代謝活性有關(guān)，測定一定波長下光密度值（OD）的大小，可定量地反映活細(xì)胞數(shù)量及其活性的改變。研究表明，在一定的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，光密度值的大小與活細(xì)胞的數(shù)量成正比[5]。CCK-8法的實(shí)驗(yàn)原理與常規(guī)MTT法略有差異，CCK-8試劑中含有WST-8（水溶性四唑鹽），其在電子載體（1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸二甲酯）存在的情況下，可被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原成水溶性的橙黃色結(jié)晶，無需使用裂解液，也不需要吸棄培養(yǎng)液，可直接進(jìn)行比色。[JP]

實(shí)驗(yàn)探討了MTT法和CCK-8法檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性的最佳實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)果表明：MTT法最佳檢測波長為570nm處，最佳孵育時(shí)間為4h，結(jié)果與前人研究[6]相似，且不受細(xì)胞株的影響，合適的細(xì)胞檢測數(shù)量為125×103～2×104；CCK-8法最佳檢測波長為450nm處，最佳孵育時(shí)間為4～6h，適宜的細(xì)胞檢測范圍在125×103～1×104之間，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量少于125×103或高于1×104時(shí)，檢測結(jié)果均較差。說明MTT法和CCK-8法在檢測兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性時(shí)，MTT法較CCK-8法細(xì)胞檢測范圍更廣，孵育時(shí)間更短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為穩(wěn)定。

近年來，Cell Counting kit-8試劑由于其生成產(chǎn)物具有高度水溶性，無需裂解液裂解沉淀，同時(shí)也不需要吸出培養(yǎng)液，對(duì)貼壁和懸浮細(xì)胞均適用，且檢測后的細(xì)胞可重復(fù)利用[7]，具有操作簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，普遍受到人們的青睞。但缺點(diǎn)是CCK-8試劑價(jià)格較為昂貴，且試劑顏色為淡紅色，與含有酚紅的培養(yǎng)液顏色極其相似，加入試劑之后不會(huì)立即顯色，因此很容易造成漏加或者多加，并且CCK-8試劑加入量很少，如果不小心沾到壁上，很可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的可重復(fù)性不是很好。相比較而言，MTT試劑價(jià)格低廉，試劑顏色為黃色，加入即刻顯色，不容易產(chǎn)生漏加現(xiàn)象，缺點(diǎn)是步驟繁瑣，由于其生成產(chǎn)物為水不溶性的，需要有機(jī)溶劑（如DMSO、異丁醇等）才能溶解，DMSO不僅具有一定的細(xì)胞毒性[8]，且對(duì)人體也有一定的危害。此外，MTT法在溶解Formazan之前，需要先吸棄培養(yǎng)液，因此此法不太適用于懸浮細(xì)胞，這也造成了一定的局限性，而且在溶解產(chǎn)物Formazan這一步驟中，還有可能會(huì)因Formazan溶解不了或溶解不充分，造成一定的結(jié)果偏差。針對(duì)傳統(tǒng)MTT法的不足之處，研究人員又進(jìn)一步提出了改良的MTT法，可在不吸出培養(yǎng)液的情況下，通過添加一些有機(jī)溶劑如酸化SDS[9]、SDS-DMF酸性溶解液[10]等，可使Formazan直接溶解，并取得了不錯(cuò)的效果。

自MTT法建立以來，不斷被改良，憑借其經(jīng)濟(jì)、數(shù)據(jù)穩(wěn)定、無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)[11]、生物活性因子的活性檢測[12]、腫瘤細(xì)胞藥敏檢測[13]、抗腫瘤藥物大規(guī)模篩選[14]等。而且目前針對(duì)細(xì)胞毒性的檢測，《美國藥典》中已采用MTT法進(jìn)行定量測定[15]。綜合比較發(fā)現(xiàn)，MTT法較CCK-8法應(yīng)用前景更為廣闊，且相信隨著MTT法的不斷改進(jìn)和完善，勢必會(huì)在實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域占據(jù)重要地位。

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