基因芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的臨床應(yīng)用

陳瑤 吳英松

基因芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的臨床應(yīng)用

陳瑤 吳英松★

目的評價基因芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的效果。方法選取我院結(jié)核科2014年3月至2016年3月收治的涂片陽性的肺結(jié)核住院患者238例，取其痰標(biāo)本，分別用基因芯片、傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗3種方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的異煙肼耐藥性檢測和利福平耐藥性檢測；把羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗的結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，評價基因芯片技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。結(jié)果基因芯片技術(shù)檢測涂片陽性患者痰標(biāo)本異煙肼耐藥的情況與金標(biāo)準(zhǔn)無顯著差異（P＞0.05）；利福平耐藥的情況與金標(biāo)準(zhǔn)相比也無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論基因芯片能夠快速、準(zhǔn)確地檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥情況，是一種值得推廣的臨床實驗室檢測方法。

基因芯片技術(shù)；結(jié)核分枝桿菌；耐藥性；檢測

結(jié)核作為一種慢性傳染病，在我國每年因結(jié)核病死亡的患者多達(dá)13萬［1］。由于耐藥的結(jié)核分枝桿菌增加［2］，預(yù)計將來結(jié)核病的流行態(tài)勢可能會以耐藥菌為主；因此，耐藥結(jié)核病的防治將會成為一項重要課題。臨床上，傳統(tǒng)的實驗室檢測方法有細(xì)菌培養(yǎng)、抗酸染色等，但是這些方法存在耗時較長、假陽性高和靈敏度低等問題［3］。基因芯片技術(shù)是近年來開展的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，時效性較傳統(tǒng)方法要高［4］。目前，對結(jié)核分枝桿菌的檢測，多以分離菌株為檢測對象；以痰標(biāo)本為檢測對象的報道少見。從結(jié)核防治的實際出發(fā)，本研究以痰標(biāo)本為檢測對象，以傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，評估基因芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌的異煙肼和利福平耐藥性的檢測效果；為評價這項技術(shù)在臨床上的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 研究對象和方法

1.1 一般資料

選擇我院結(jié)核科2014年3月至2016年3月收治的涂片陽性肺結(jié)核住院患者238例作為研究對象。其中男128例，女110例，年齡21～65歲，平均年齡45.6±6.7歲。

1.2 采集患者的痰標(biāo)本

每例患者留取清晨第一口痰標(biāo)本，每人3份，每份5 mL；經(jīng)檢測后，留取涂片陽性級別較高（2+以上）的2份，各取1 ml混勻，進(jìn)行基因芯片檢測；剩下的痰標(biāo)本做羅氏培養(yǎng)。

涂片陽性級別的判斷方法：①陰性：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；②可疑陽性：1～8條抗酸桿菌/300視野；③1+：3～9條抗酸桿菌/100視野；④2＋：1～9條抗酸桿菌/10視野；⑤3＋：1～9條抗酸桿菌/每視野；⑥4＋：≥10條抗酸桿菌/每視野。

1.3 基因芯片技術(shù)

整個檢測過程大約24 h，具體流程如下：

1.3.1 樣品制備

向盛有痰液的無菌盒加入4%氫氧化鈉10 mL，對收集到的痰標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理；隨后進(jìn)行細(xì)菌核酸提?。贿M(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增儀由博奧生物有限公司提供。

每管PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中Mtb分離株DNA模板為2 μL，PCR擴(kuò)增試劑1、PCR擴(kuò)增試劑2和PCR擴(kuò)增試劑3各18 μL。PCR產(chǎn)物1為對照產(chǎn)物，與兩種微陣列都進(jìn)行雜交。PCR產(chǎn)物2為rpoB基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，與利福平微陣列相對應(yīng)；PCR產(chǎn)物3為katG基因及inhA基因啟動子的擴(kuò)增產(chǎn)物，與異煙肼微陣列相對應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序為：37℃600 s，94℃600 s；94℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，35個循環(huán)；然后94℃30 s，72℃60 s，10個循環(huán)；最后置72℃420 s。

1.3.2 芯片反應(yīng)

PCR擴(kuò)增完畢，完成變性后，將產(chǎn)物加入Mtb耐藥性檢測試劑盒（北京百奧瑞生物技術(shù)有限公司提供）的芯片點(diǎn)陣中，完成芯片雜交反應(yīng)，并洗去非特異性雜交的核酸片段。

取雜交緩沖液9 μL，分別加入同一樣品的PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2各3 μL，或者加入PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物3各3 μL。置于PCR擴(kuò)增儀中于95℃變性5 min，然后冰浴3 min；將13.5 μL雜交反應(yīng)混合物經(jīng)蓋片的加樣孔加入，迅速蓋上雜交盒并密封；放入50℃預(yù)熱的恒溫水浴鍋中120 min；水平取出雜交盒，拆開取出芯片，洗滌后離心甩干。

1.3.3 結(jié)果判讀

甩干后，將芯片載入LuxScan 10KB微陣列芯片掃描儀（博奧生物有限公司提供），判讀檢測結(jié)果。

1.4 傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗

以傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗作為金標(biāo)準(zhǔn)，對238例患者的痰標(biāo)本進(jìn)行羅氏培養(yǎng)，陽性的痰標(biāo)本做藥物敏感性試驗。整個過程大約2～3個月。

1.4.1 羅氏培養(yǎng)

在預(yù)處理之前，將痰標(biāo)本接種到酸性改良的羅氏培養(yǎng)基上，觀察菌落的生物學(xué)特點(diǎn)。羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為7 mL/支。

1.4.2 藥敏試驗

觀察結(jié)核桿菌的菌落，取菌落接種，配制菌懸液（1 mg/mL），稀釋濃度至10?2mg/mL和10?4mg/ mL，分別接種到含異煙肼（0.2 μg/mL）和利福平（40 μg/mL）的藥敏培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)6周，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有的數(shù)據(jù)采用SPSS19.0處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；真實性采用靈敏度和特異度評估；可靠性用Kappa值評估，Kappa值為0.41～0.6為中度一致性，0.61～0.8為高度一致性，0.8～1.0為最強(qiáng)一致性。

2 結(jié)果

2.1 檢測的一般情況

238例患者的痰標(biāo)本中，培養(yǎng)結(jié)果陰性15例，剩余的痰標(biāo)本中，非結(jié)核分枝桿菌感染5例，耐藥檢測結(jié)果不完整者14例，最終納入分析的患者為204例。初治涂片陽性155例，復(fù)治涂片陽性49例。

2.2 異煙肼耐藥性檢測結(jié)果

2.2.1 初治涂片陽性患者痰液結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的結(jié)果

檢測結(jié)果，異煙肼耐藥24例，17例為katG基因突變，7例為inhA基因突變。結(jié)果顯示，與金標(biāo)準(zhǔn)相比無顯著差異（P＞0.05）；對于初治涂片陽性的患者，采用基因芯片技術(shù)，靈敏度是86.67%，特異度是92.14%；kappa值為0.81，一致性為高度（表1）。

表1 初治涂片陽性患者痰液結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的結(jié)果Table 1 The Results of Mycobacterium tuberculosis sputum stain detection of isoniazid resistance in patients with smear positive at the first treatment

2.2.2 復(fù)治涂片陽性患者痰液結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的結(jié)果

檢測結(jié)果，異煙肼耐藥13例，9例為katG基因突變，4例為inhA基因突變。結(jié)果顯示，與金標(biāo)準(zhǔn)無顯著差異（P＞0.05）；對于復(fù)治涂片陽性的患者，采用基因芯片，靈敏度是90.91%，特異度是92.11%；kappa值為0.83，一致性為最強(qiáng)（表2）。

表2 復(fù)治涂片陽性患者痰液結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的結(jié)果Table 2 The results of Mycobacterium tuberculosis sputum stain detection of Isoniazid resistance in patients with smear positive in the second treatment

2.3 利福平耐藥性檢測結(jié)果

2.3.1 初治涂片陽性患者痰液結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對利福平耐藥性的結(jié)果

檢測結(jié)果，利福平耐藥32例，均為rpoB基因突變。結(jié)果顯示，與金標(biāo)準(zhǔn)無顯著差異（P＞0.05）；對于初治涂片陽性的患者，采用基因芯片技術(shù)，靈敏度是90.48%，特異度是91.44%；kappa值為0.85，一致性為最強(qiáng)（表3）。

表3 初治涂片陽性患者痰液結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對利福平耐藥性的結(jié)果Table 3 The results of Mycobacterium tuberculosis sputum stain detection of rifampicin resistance in patients with smear positive at the first treatment

2.3.2 復(fù)治涂片陽性患者痰液結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對利福平耐藥性的結(jié)果

檢測結(jié)果，利福平耐藥15例，均為rpoB基因突變。結(jié)果顯示，與金標(biāo)準(zhǔn)無顯著差異（P＞0.05）；對于復(fù)治涂片陽性的患者，采用基因芯片技術(shù)，靈敏度是81.82%，特異度是84.21%；kappa值為0.790，一致性為高度（表4）。

表4 復(fù)治涂片陽性患者痰液結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對利福平耐藥性的結(jié)果Table 4 The results of Mycobacterium tuberculosis sputum stain detection of rifampicin resistance in patients with smear positive in the second treatment

3 討論

基因是染色體上具有遺傳效應(yīng)的DNA片段［5］。基因芯片技術(shù)是一項新興的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，其原理是對待測的DNA用另一個已知核酸序列的DNA按堿基互補(bǔ)配對的原則雜交，然后通過計算機(jī)處理，得到待測DNA的序列［6］。基因芯片技術(shù)的靈敏性和特異性都比較高，因此這項技術(shù)也逐步成為診斷疾病的尖端技術(shù)，對于指導(dǎo)臨床合理、及時、準(zhǔn)確地用藥提供了很大的方便。

異煙肼和利福平是最主要的一線抗結(jié)核藥［7］，快速檢測結(jié)核分枝桿菌對這兩種藥物的敏感性在抗結(jié)核治療的過程中十分重要。目前，國內(nèi)外已經(jīng)開始運(yùn)用基因芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進(jìn)行檢測［8］，檢測的對象主要是結(jié)核分枝桿菌的分離菌株。然而，臨床結(jié)核防治過程中，檢測的主要對象是以患者的痰為標(biāo)本?？紤]到這一點(diǎn)，本次研究收集所有患者的痰液后，對結(jié)核分枝桿菌的主要突變基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測，如katG、inhA和rpoB等［9］，評價基因芯片技術(shù)對異煙肼和利福平耐藥性檢測的真實性與可靠性。

國外研究發(fā)現(xiàn)，與DNA測序相比，采用基因芯片技術(shù)，檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性，靈敏度達(dá)到84.1%，特異度達(dá)到100%；對利福平的耐藥性分別是100%和95.3%［10］。另外，相對于藥敏試驗，檢測對異煙肼耐藥性的靈敏度是88.59%，特異度是91.53%，對利福平耐藥性分別是85.39%和88.45%［11］。本研究的檢測結(jié)果顯示：采用基因芯片技術(shù)，與藥敏試驗相比，檢測對異煙肼耐藥性的靈敏度和特異度分別為86.67%～90.91%和92.11%～92.14%；檢測對利福平耐藥性的靈敏度和特異度分別為81.82%～90.48%和84.21%～91.44%。與國外的研究結(jié)果比較接近，表明在結(jié)核防治工作中，采用基因芯片檢測技術(shù)，以痰標(biāo)本作為檢測對象，檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，結(jié)果是可靠的。

Guo Y等［12］以痰標(biāo)本為檢測對象，用基因芯片技術(shù)檢測異煙肼和利福平耐藥性，同藥敏試驗比較，其一致性分別是80.3%和84.2%。本文的結(jié)果顯示，相對于藥敏試驗，基因芯片技術(shù)對于異煙肼耐藥檢測結(jié)果的Kappa值為0.81～0.83，其一致性為最強(qiáng)；對于利福平耐藥檢測結(jié)果的Kappa值為0.79～0.85；其一致性也為最強(qiáng)。這同Guo Y等［12］的研究結(jié)果基本一致。上述檢測結(jié)果表明，在結(jié)核臨床防治工作中，采用基因芯片檢測技術(shù)，以痰標(biāo)本作為檢測對象，檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，結(jié)果可靠。

綜述所述，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢驗結(jié)核分枝桿菌對異煙肼和利福平的耐藥性，真實性和可靠性都得到了實驗數(shù)據(jù)的驗證，在結(jié)核病的臨床快速診療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Clinical application of gene chip technology in the detection of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis

CHEN Yao,WU Yingsong★
(School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong, China,510515)

ObjectiveTo evaluate the effect of gene chip technology on the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis.Methods238 patients with smear positive pulmonary tuberculosis admitted to our hospital from March 2014 to March 2016 were selected as the subjects.Three methods were used to detect isoniazid resistance and rifampicin resistance of Mycobacterium tuberculosisin sputum samples:gene chip, traditional Roche culture and a drug sensitivity test.The results of Roche culture and drug sensitivity test were used as the gold standard to evaluate the value of gene chip technology.ResultsThere was no significant difference in the resistance rate of smear positive patients with isoniazid detected with gene chip and the gold standard(P＞0.05).Similarly,there was no significant difference between the rifampin resistance rate determined by gene chip and the gold standard(P＞0.05).ConclusionGene chip technology can rapidly and accurately detect the resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isoniazid,and it is a valuable clinical laboratory diagnostic method.

Gene chip technology;Tuberculosis;Drug resistance;Detection

重大傳染病創(chuàng)新檢測試劑的研制和應(yīng)用研究（廣州市協(xié)同創(chuàng)新重大專項，201400000004?1）

南方醫(yī)科大學(xué)檢驗與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：吳英松，E?mail：wg@smu.edu.cn