糞便鈣衛(wèi)蛋白及血清自身抗體聯(lián)合檢測對炎癥性腸病的診斷價值*

劉國瑞，馬巧蓉，李玲慧，鄭田，嚴孝嶺，李毅，虞偉

(1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 a.解放軍臨床檢驗醫(yī)學研究所，b.解放軍普通外科研究所，南京 210002；2.廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院檢驗科，南寧 530001)

糞便鈣衛(wèi)蛋白及血清自身抗體聯(lián)合檢測對炎癥性腸病的診斷價值*

劉國瑞1a，馬巧蓉2，李玲慧1a，鄭田1a，嚴孝嶺1a，李毅1b，虞偉1a

(1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 a.解放軍臨床檢驗醫(yī)學研究所，b.解放軍普通外科研究所，南京 210002；2.廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院檢驗科，南寧 530001)

目的 探討聯(lián)合檢測血清抗胰腺外分泌腺抗體(PAB)、抗釀酒酵母抗體(ASCA)、抗杯狀細胞抗體(GAB)、抗中性粒細胞胞漿抗體(PANCA)及糞便鈣衛(wèi)蛋白(FC)在炎癥性腸病(IBD)診斷和鑒別診斷中的價值。方法 收集確診的克羅恩病(CD)患者107例及潰瘍性結腸炎(UC)患者98例作為IBD組，非IBD腸病疾病患者79例作為疾病對照組，用間接免疫熒光法檢測血清PANCA、ASCA、GAB和PAB，用雙抗體夾心ELISA法檢測FC濃度。對3組血清PANCA、GAB、PAB、ASCA及FC檢測的數(shù)據(jù)進行對比分析。結果 205例IBD患者血清PANCA、GAB、PAB、ASCA的陽性率分別為36.1%、29.8%、38.0%、4.9%；IBD組、CD組與UC組FC濃度均高于疾病對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，CD組與UC組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PANCA在CD和UC組的陽性率分別為8.4%、66.3%；PAB在CD和UC組的陽性率分別為65.4%、8.2%；PAB、PANCA、GAB、ASCA、FC及5項聯(lián)合在鑒別診斷IBD與非IBD腸道疾病中的敏感性和特異性分別為38.0%、36.1%、29.8%、4.9%、54.1%、63.4%和98.7%、96.2%、94.9%、100%、68.4%、93.7%。5項聯(lián)合鑒別診斷IBD與非IBD腸道疾病的ROC曲線下面積為0.819；PANCA用于UC鑒別診斷的ROC曲線下面積為0.816；PAB用于CD鑒別診斷的ROC曲線下面積為0.823。結論 GAB為一種IBD相關自身抗體，可用于IBD的輔助診斷；PAB和PANCA分別為CD和UC重要的血清學標記物，對該類疾病診斷具有高度敏感性和特異性；將FC與自身抗體聯(lián)合對于IBD與非IBD胃腸道疾病的鑒別具有重要意義，但對于區(qū)分CD或UC價值不大。

炎癥性腸??；克羅恩病；潰瘍性結腸炎；抗體；鈣衛(wèi)蛋白

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種發(fā)病機制不明的腸道非特異性炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis， UC)和克羅恩病(Crohn′s disease， CD)。臨床上鑒別診斷UC和CD主要依賴于臨床和病理學檢查，而且還需排除傳染性疾病和其他類似疾病，有很大局限性。因此，臨床需要方便準確、非侵入性、廉價的檢測指標及方法實現(xiàn)IBD的鑒別診斷、評估分期和療效判定。核周型抗中性粒細胞胞漿抗體(PANCA)、抗杯狀細胞抗體(GAB)、抗胰腺外分泌腺抗體(PAB)和抗釀酒酵母抗體(ASCA)是比較有代表性的相關自身抗體[1-3]，在IBD的診斷和鑒別診斷、活動度分期等方面有不同的作用。糞便鈣衛(wèi)蛋白(fecal calprotectin，F(xiàn)C)能夠很好地反映腸道炎癥嚴重程度且檢測方便，取材容易[4]。本文聯(lián)合檢測上述標志物，探討其對IBD診斷和鑒別診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2016年6月解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院住院患者，均經臨床表現(xiàn)、影像學檢查、消化道內鏡及病理學檢查，符合“2012年IBD診斷與治療的共識意見”擬定的診斷標準[5]。CD組107例，其中男68例，女39例，年齡(33.1±12.9)歲；UC組98例，其中男58例，女40例，年齡(42.1±15.4)歲；同期其他腸病對照組79例(包括小腸潰瘍31例，小腸炎癥23例，小腸息肉13例，腸結核8例，其他胃腸炎4例)，其中男47例，女32例，年齡(42.8±17.1)歲。3組研究對象年齡、性別比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 標本采集

1.2.1 血液樣本 抽取空腹靜脈血2～3 mL，3 500 r/min離心10 min分離血清，置-40 ℃凍存待檢。

1.2.2 糞便樣本 在腸鏡檢查口服清腸藥前3 d內留取受檢者糞便10～20 g，置-40 ℃凍存待檢。

1.3 血清PANCA、ASCA、GAB和PAB抗體檢測 采用間接免疫熒光法，生物馬賽克物薄片購自德國歐蒙公司。所有操作嚴格按試劑說明書要求進行。PANCA、GAB 和PAB抗體檢測樣本采用歐蒙PBS稀釋液1∶10稀釋，ASCA抗體檢測樣本做1∶1 000稀釋，熒光顯微鏡下觀察結果。以標準滴度熒光強度為參照，報告4項自身抗體的血清滴度(此即為半定量結果)。根據(jù)試劑盒說明書推薦的陽性判斷標準，確定PANCA、GAB和PAB滴度cut-off 值為10，ASCA滴度cut-off 值為1 000，以上視為陽性。

1.4 FC檢測 采用雙抗體夾心ELISA法，試劑盒購自瑞士Bühlmann公司。所有操作嚴格按試劑說明書要求進行。用IMARK酶聯(lián)儀(Bio-Rad公司)讀取450 nm波長處吸光度(A)。繪制標準品濃度對相應A值的標準曲線，計算樣本濃度(μg/g)。

1.5 結果賦值與參數(shù)指標值的歸一化 由于FC為定量結果，血清自身抗體為半定量結果，在繪制ROC曲線時，須先將FC及自身抗體進行量化賦值并歸一化。根據(jù)血清自身抗體滴度量化并分為9個等級(ASCA熒光強度值為100倍結果)，見表1。FC檢測結果按試劑說明書標準，以>50 μg/g表示陽性，以實際檢測結果/50進行量化分級。量化值統(tǒng)一是按照單項量化值(x)/單項值總和(sum)取對數(shù)[公式為lg(x/sum×106)]。

表1 血清PANCA、ASCA、GAB 和PAB 自身抗體結果賦值表

1.6 統(tǒng)計學分析 用SPSS 19.0軟件進行。由于FC為非正態(tài)分布，故采用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。血清自身抗體陽性率比較采用卡方檢驗，用配對四格表分別計算檢測項目用于鑒別診斷CD、UC、IBD的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值。繪制ROC曲線，以約登指數(shù)(敏感性+特異性-1)最大時的檢測值確定為診斷的最佳截斷點。以P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FC及4種自身抗體檢測結果 IBD組、CD與UC組FC濃度均高于疾病對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，CD與UC組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PAB在CD組中陽性率為65.4%，高于UC組(8.2%)和對照組(1.3%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PANCA在UC組中的陽性率為66.3%，高于CD組(8.4%)和疾病對照組(3.8%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；GAB在CD、UC和疾病對照組陽性率分別為30.0%、29.6%和5.1%，CD和UC組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但兩組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ASCA在CD、UC和疾病對照組陽性率分別為4.8%、5.1%和0，3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組FC濃度和PAB、GAB、PANCA、ASCA陽性率

注：與疾病對照組比較，#，P<0.01；a，P<0.05；與UC組比較，b，P<0.05。自身抗體陽性判斷依據(jù)：為試劑盒說明書提供的cut-off值。

2.2 FC、自身抗體單項和聯(lián)合檢測用于IBD鑒別診斷的效果評價 根據(jù)ROC曲線，F(xiàn)C單獨應用于鑒別診斷IBD與非IBD腸道疾病的cut-off值為294.3 μg/g，此時敏感性和特異性分別為54.1%和68.4%。血清PAB、PANCA、GAB、ASCA抗體用于鑒別診斷IBD與非IBD腸道疾病的敏感性和特異性分別為38.0%、36.1%、29.8%、4.9%和98.7%、96.2%、94.9%、100%。聯(lián)合FC與血清自身抗體診斷IBD的敏感性可提高至63.4%，特異性為93.7%，陰性預測值49.7%，陽性預測值96.3%，見表3。ASCA、PANCA、PAB、GAB、FC及聯(lián)合5項指標對IBD鑒別診斷ROC曲線下面積分別0.518、0.663、0.685、0.623、0.663和0.819，見圖1。

表3 FC、PAB、PANCA、GAB、ASCA及5項聯(lián)合鑒別診斷IBD的效能

項目敏感性(%)特異性(%)陰性預測值(%)陽性預測值(%)FC*54.168.437.581.6PAB38.098.738.098.7PANCA36.196.236.796.1GAB29.894.934.293.8ASCA4.9100.028.8100.05項聯(lián)合63.493.749.796.3

注：*，cut-off值為294.3 μg/g。

2.3 自身抗體檢測及與FC聯(lián)合檢測用于UC、CD鑒別診斷的效果評價 PAB用于CD鑒別診斷的敏感性為65.4%，特異性98.7%，曲線下面積為0.823，5項聯(lián)合對CD鑒別診斷敏感性為67.3%，特異性為89.97%，曲線下面積為0.810；PANCA用于UC鑒別診斷的敏感性為66.3%，特異性為96.2%，曲線下面積為0.816，5項聯(lián)合對UC鑒別診斷的敏感性為67.3%，特異性為93.7%，曲線下面積為0.828。

圖1 FC、4種抗體單獨及聯(lián)合檢測用于IBD鑒別診斷的ROC曲線分析

3 討論

FC是由Fagerhol等[6]首先從中性粒細胞中分離出來的鈣鋅結合蛋白，存在于中性粒細胞和巨噬細胞中，大約占中性粒細胞蛋白質成分的60%[7]。研究表明，F(xiàn)C有抗菌、免疫調節(jié)、抗增殖活性，在炎癥活動的調節(jié)中起著重要作用[8-9]。FC可以抵抗酶的分解，在室溫下可以穩(wěn)定7 d，不受飲食的影響，很容易在糞便中檢測到[10]。

本研究對205例確診IBD患者及79例非IBD疾病患者血清PANCA、PAB、GAB、ASCA抗體水平及FC進行檢測，發(fā)現(xiàn)PAB在CD中的陽性率為65.4%，其鑒別診斷CD及其他腸道疾病的ROC曲線下面積為0.823，在敏感性為65.4%時，特異性達到98.7%，可用于與UC的鑒別診斷。Joossen等[11]也提出PAB的存在即是CD的標志。GAB在IBD中的陽性率為29.8%，顯著高于對照組的5.1%，其在CD與UC中的陽性率差異無統(tǒng)計學意義，可以認為GAB是一種與IBD相關的自身抗體，可作為IBD的輔助診斷，但不適用于鑒別UC與CD。PANCA在UC中的陽性率為66.3%，其鑒別診斷UC及其他腸道疾病的ROC曲線下面積為0.816，在敏感性為66.3%時，特異性達到96.2%。研究表明，PANCA主要存在于UC患者，文獻報道UC患者PANCA的陽性率為43.4%～70%[12]，與本研究一致。可認為PANCA作為UC的血清標志物，可用于UC與其他腸道疾病的鑒別診斷。FC用于鑒別診斷IBD及其他腸道疾病ROC曲線下面積僅為0.663，將FC與幾種自身抗體聯(lián)合應用對CD診斷的價值與單獨PAB檢測相比，敏感性由65.4%提高為67.3%，但特異性卻從98.7%下降至89.97%；因此，5項指標聯(lián)合檢測對鑒別CD或UC診斷的價值提升不大。但FC與血清IBD相關抗體聯(lián)合應用，對于鑒別IBD與非IBD胃腸道疾病的敏感性可提升至63.4%，特異性仍可保持在93.7%，具有重要價值。

本研究未納入健康人群，也未對不同IBD分期結果進行比較。實際上，聯(lián)合檢測對鑒別IBD與非IBD胃腸道疾病的特異性將會更高。另據(jù)文獻報道，F(xiàn)C有利于對疾病進行動態(tài)監(jiān)測，且FC檢測方便，可以準確地判斷疾病活動度[13-14]。

根據(jù)本研究結果，ASCA在IBD中的陽性率為4.9%，低于國內外文獻報道水平[1,15]，ASCA對IBD的鑒別診斷未見特別價值。分析以上出現(xiàn)差異可能原因為：(1)種族遺傳差異，歐美患者與亞洲人群遺傳背景的不同可能造成彼此血清自身抗體的顯著差異，此可能為主要原因；(2)實驗室和實驗技術手段不同；(3)ASCA檢測試劑盒說明書推薦的cut-off值(1∶1 000)為來自于歐洲人群的參考值，是否適合于中國人群值得思考。另外，本研究檢測的是ASCA-IgG，較ASCA-IgA來說，IgG的陽性率相對更低，聯(lián)合檢測IgG和IgA可能會提高診斷敏感性。由于ASCA 在不同研究機構獲得的數(shù)據(jù)有所不同，故其臨床價值有待于進一步研究證實。

綜上所述，4種抗體對于IBD診斷的敏感性都不高，不適用對IBD患者進行篩查。GAB是與IBD相關的一種自身抗體，可作為IBD的輔助診斷，但不適用于CD與UC的鑒別診斷； PAB可作為CD的血清標志物，PANCA可作為UC的血清標志物，可分別用于CD和UC的鑒別診斷。將FC與上述4種自身抗體聯(lián)合對于IBD與非IBD胃腸道疾病的鑒別診斷具有重要價值，但對于鑒別診斷CD或UC疾病的價值提升意義不大。

[1]Kuna AT. Serological markers of inflammatory bowel disease[J]. Biochemia Medica, 2013, 23(1):28-42.

[2]Nguyen DL, Nguyen ET, Bechtold ML. pANCA positivity predicts lower clinical response to infliximab therapy among patients with IBD[J]. South Med J, 2015, 108(3):139-143.

[3]Homsak E, Miceti-Turk D, Bozic B. GAB and PAB in inflammatory bowel disease: prevalence, characteristics and diagnostic value[J]. Wien Klin Wochenschr, 2010, 122(Suppl 2):19-25.

[4]麻婧, 吳開春. 糞鈣衛(wèi)蛋白在炎癥性腸病應用中的優(yōu)勢探討[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2016, 25(2): 231-234.

[5]中華醫(yī)學會消化病學會炎癥性腸病學組．炎癥性腸病診斷與治療的共識意見[J]．中華消化雜志, 2012, 32(12): 796-813.

[6]Fagerhol MK, Dale I, Anderson T. Release and quantitation of a leucocyte derived protein[J]. Scand J Haematol, 1980, 24:393-398.

[7]Olaison G, Smedh K, Sjodahl R. Natural course of Crohn′s disease after ileocolic resection: endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms[J]. Gut, 1992, 33(3): 331-335.

[8]Rutgeerts P. Strategies in the prevention of post-operative recurrence in Crohn′s disease[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2003, 17(1): 63-73.

[9]Rutgeerts P, Geboes K, Vantrappen G, et al. Predictability of the postoperative course of Crohn′s disease[J]. Gastroenterology, 1990, 99(4): 956-963.

[10]Johne B, Fagerhol MK, Lyberg T,etal. Functional and clinical aspects of the myelomonocyte protein calprotectin[J]. Mol Pathol, 1997, 50(3): 113-123.

[11]Joossen S，Vermeire S，Van Steen K，etal． Pancreatic autoantibodies in inflammatory bowel disease[J]．Inflamm Bowel Dis，2004，10：771-777．

[12]Zhou F,XiaB,WangF,etal.The prevaience and diagnostic value of perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies and anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies in patients with inflammatory bowel disease in mainland China[J]. Clin Chim Acta, 2010, 411(19-20): 1461-1465.

[13]Schoepfer AM, Beglinger C, Straumann A,etal. Fecal calprotectin correlates more closely with the Simple Endoscopic Score for Crohn′s disease (SES-CD) than CRP, blood leukocytes, and the CDAI[J]. Am J Gastroenterol, 2010, 105(1): 162-169.

[14]Schoepfer AM, Beglinger C, Straumann A,etal. Ulcerative colitis: correlation of the Rachmilewitz endoscopic activity index with fecal calprotectin, clinical activity, C-reactive protein and blood leukocytes[J]. Inflamm Bowel Dis, 2009, 15(12): 1851-1858.

[15]張玲玲, 許鐘, 黃國美, 等. 血清抗體檢測在炎癥性腸病中的臨床應用研究[J]. 中國實用醫(yī)藥, 2016, 26(11): 1-3.

(本文編輯：劉群)

Diagnostic value of combined detection of fecal calprotectin and serum autoantibodies in inflammatory bowel diseases

LIUGuo-rui1a,MAQiao-rong2,LILing-hui1a,ZHENGTian1a,YANXiao-ling1a,LIYi1b,YUWei1a

(1.a.InstituteofClinicalLaboratoryMedicineofPLA,b.InstituteofGeneralSurgeryofPLA,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing210002,Jiangsu; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangxiMinzuHospitalAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity,Nanning530001,Guangxi,China)

Objective To investigate the values of combined detection of serum pancreas autoantibodies(PAB), anti-saccharomyces cerevisiae antibodies(ASCA), goblet cell autoantibodies(GAB) and antineutrophil cytoplasmic antibodies(PANCA) and fecal calprotectin(FC) in the diagnosis and differential diagnosis of inflammatory bowel diseases(IBD). Methods The serum and feces samples from IBD patients, including 107 with definite Crohn′s disease(CD) and 98 with definite ulcerative colitis(UC), and 79 non-IBD patients as the control were collected. Serum PANCA, ASCA, GAB and PAB were detected by an indirect immunofluorescence assay, and FC concentration by double-antibody sandwich ELISA. The results from different patients were compared and analyzed. Results The positive rates of serum PANCA, GAB, PAB and ASCA in 205 IBD patients were 36.1%, 29.8%, 38.0% and 4.9%, respectively. The FC concentrations in IBD, CD and UC patients were significantly higher than that in the control(P<0.01), while there was no statistical difference between CD and UC patients(P>0.05). The positive rates of PANCA in CD and UC patients were 8.4% and 66.3%, respectively, while those of PAB in CD and UC patients were 65.4% and 8.2%, respectively. The sensitivity and specificity of PAB, PANCA, GAB, ASCA, FC and their combination in the differential diagnosis of IBD and non-IBD were 38.0%, 36.1%, 29.8%, 4.9%, 54.1%, 63.4% and 98.7%, 96.2%, 94.9%, 100%, 68.4%, 93.7%, respectively. The area under the ROC of the combination of 5 markers was 0.819 in differentially diagnosing IBD and non-IBD. The area under the ROC of PANCA for the differential diagnosis of UC was 0.816, while that of PAB for the differential diagnosis of CD was 0.823. Conclusion GAB is an autoantibody associated with IBD, which may be helpful for the auxiliary diagnosis of IBD. PAB and PANCA are the important serological markers for the diagnosis of CD and UC, respectively. The combination of FC with PAB, PANCA, GAB and ASCA may be used for the differential diagnosis of IBD and non-IBD, but has little value in distinguishing CD and UC.

inflammatory bowel disease; Crohn′s disease; ulcerative colitis; antibody; calprotectin

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.06

國家自然科學基金(81670471)。

劉國瑞，1979年生，男，主管技師，主要從事臨床免疫學實驗室診斷工作。

虞偉，教授，碩士研究生導師，E-mail:yuwei211@126.com。

2016-11-10)