橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB表達(dá)的影響研究

陳明喆 何偉

·論著·

橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB表達(dá)的影響研究

陳明喆 何偉

目的 研究橙皮苷對IgA 腎病大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB表達(dá)的影響，探討橙皮苷對腎臟是否有保護(hù)作用及其作用機(jī)理。方法 雄性SD大鼠60只隨機(jī)分為正常組、模型組和橙皮苷治療組，IgA模型建立成功后，橙皮苷治療組給予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃治療，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，治療4周后、8周后分別處死大鼠，檢測其24小時尿蛋白、血尿素氮、血白蛋白、白介素-1(interleukin-1，IL-1)和白介素-6 (IL-6)，免疫組化、RT-PCR以及Western blot檢測腎組織中TLR-4和NF-κB表達(dá)。結(jié)果 在整個實(shí)驗(yàn)過程中，正常組飲食正常，精神良好，模型組和橙皮苷治療組在造模成功后表現(xiàn)有一定的食欲不振和精神萎靡，使用橙皮苷治療后，上述情況有所緩解；與正常組相比，模型組24小時尿蛋白、血尿素氮、IL-1和IL-6明顯升高(P<0.05)，白蛋白明顯下降(P<0.05)，治療4周后，上述指標(biāo)有明顯改善，治療8周后其基本和治療4周后一致；RT-PCR、Western blot和免疫組化可見，相較于正常組，模型組TLR-4和NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，橙皮苷治療4周后，其有明顯降低，治療8周后，表達(dá)更弱(P<0.05)。結(jié)論 橙皮苷可明顯下調(diào)TLR-4和NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)，改善腎功能，最終保護(hù)腎臟組織。

橙皮苷； IgA腎??； Toll樣受體4； 自然細(xì)胞殺傷因子-κB

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是臨床中最為常見的一種腎小球原發(fā)性疾病，本病多見于青少年兒童，其臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的血尿以及不同程度的蛋白尿[1]。由于本病多和自身免疫力相關(guān)，所以在發(fā)病前長伴有一定的上呼吸道病史，此外本病預(yù)后良好，但是在臨床中仍有25%到30%的患者預(yù)后不理想，進(jìn)而發(fā)展為終末期腎病[2]。對于本病的治療西藥多以激素治療為主，而中草藥在治療此病時具有很好療效，但是中草藥在向國際推廣時，面臨著藥物成分復(fù)雜，藥理作用不明確的尷尬境地，所以采用現(xiàn)代化思維來研究中藥是具有實(shí)踐意義的[3]。橙皮苷是從橙皮中提取的一類苷類化合物，本次研究用橙皮苷治療IgA腎病大鼠，觀察治療后其腎臟組織中TLR-4和NF-κB的表達(dá)特點(diǎn)，以明確橙皮苷是否可以緩解IgA腎病大鼠癥狀以及其治療機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本次實(shí)驗(yàn)共購買SD大鼠60只，所有大鼠均購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠體質(zhì)量為180～200 g，所有大鼠購買后均給予定時定量飲水，同時勤換墊料的基礎(chǔ)上適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，2周后開始構(gòu)建IgA腎病模型。

1.1.2 主要試劑和材料 本次藥物橙皮苷購于湖北合天化工有限公司；造模用試劑牛血清蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)以及四氯化碳(CCl4)購于中國國藥公司；造模用花生油購于山東魯花有限公司；造模用蓖麻油購于上海化學(xué)有限公司；TLR-4抗體，NF-κβ抗體購于英國abcam公司，總RNA提取試劑盒購于天根生物公司，引物合成由南京金斯瑞生物工程公司完成。

1.2 動物模型的建立以及分組

所有大鼠在造模前均給予一次檢測血液腎功能，腎功能沒有異常后開始分組和造模，60只大鼠采用隨機(jī)原則分為正常對照組、模型對照組(IgA腎病組)，以及橙皮苷治療組，每組為20只，模型對照組和橙皮苷治療組在分組后即給予造模，造模按照經(jīng)典方法進(jìn)行[4]，首先每天給予1次牛血清蛋白灌胃，灌胃量為400 mg/(kg·d)，共灌胃10周；大鼠每周注射一次0.5 mL蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，共9周；分別于第6周后、第8周后給予大鼠脂多糖0.05 mg尾靜脈注射；為使實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確，在造模時正常對照組每天給予等量的生理鹽水灌胃，注射也為等量生理鹽水，10周后，觀察其造模成功，造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：可見明顯血尿以及鏡下檢測可發(fā)現(xiàn)有30%的紅細(xì)胞。

1.3 大鼠治療方法

大鼠在造模成功后開始治療，橙皮苷治療組給予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃治療(10 mg橙皮苷溶于1 mL的生理鹽水中)，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，分別于治療4周后、8周后處死大鼠，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。

1.4 組織提取方法

大鼠處死時采用3%的戊巴比妥麻醉，麻醉后沿腹中線切開大鼠腹部，首先從心尖處取血，取血后立即離心，離心速度為4000 rpm，離心后提取上清液置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆脵z測(-86℃)，之后迅速取出腎臟，統(tǒng)一取左側(cè)腎臟切取十分之一置于10%的中性福爾馬林溶液中保存，其余置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆?-86℃)。

1.5 生化指標(biāo)檢測

大鼠生化指標(biāo)的檢測采用全自動生化儀完成，檢測指標(biāo)為24小時尿蛋白定量、血尿素氮以及白蛋白，炎性因子白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)和IL-6的檢測采用Elisa試劑盒，試劑盒購于武漢bio-sweap公司，檢測方法為雙抗體夾心法。

1.6 免疫組化

本次檢測用免疫組化法檢測大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB的表達(dá)具體方法如下：(1)首先將多聚甲醛固定好的腎臟組織取出，酒精梯度脫水后將其置于融化的石蠟組織中進(jìn)行包埋，包埋后進(jìn)行切片，切片厚度為3～5 μm，之后將切片置于60℃恒溫箱中烘烤20分鐘；(2)烘烤后將組織進(jìn)行脫蠟、之后用PBS洗滌3次，每次5分鐘；(3)上述完成后采用3%的雙氧水浸泡，浸泡后洗滌，洗滌完成后修復(fù)抗原，之后加入相應(yīng)一抗、二抗后，DAB顯色，顯色后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察染色程度以及蛋白的表達(dá)位置。

1.7 腎組織TLR-4和NF-κB mRNA的檢測

腎組織TLR-4和NF-κB mRNA的檢測采用半定量RT-PCR法，具體為稱取30 mg腎臟組織，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，提取后定量調(diào)平，之后行逆轉(zhuǎn)率以及擴(kuò)增反應(yīng)，引物設(shè)計為TLR-4，上游：5′-GGCGAGCGTCATGTACACACAAC-3′，下游：5′TGGAAAGCCGACGCAGACGCTGC-3′，產(chǎn)物長度為296 bp；NF-κB上游：5′CTCGAAATACTCACAAGGTCCCGGCGAT-3′，下游：5′ AC GGTACAACGAGTAAAGAAGAC-3′，產(chǎn)物長度為296 bp；內(nèi)參為β-actin，其中上游為：5′CAGGCGTAAGCTCCGCCACTTCCGTAT-3′，下游為：5′GGCCGGCACCAAGCTTCTTCGGTAC，產(chǎn)物長度為521 bp。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，之后同樣溫度變性30秒，48.6℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共35個循環(huán)；最后再延伸5分鐘。完成后每組各取2 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完成后采用凝膠成像儀照片，并分析電泳帶灰度值，全組以β-actin為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)的檢測

腎組織TLR-4和NF-κB蛋白質(zhì)的表達(dá)檢測采用Western blot法，首先用總蛋白提取試劑盒提取腎臟組織中總蛋白，之后總蛋白用BCA法定量，定量后立即給予調(diào)平，再測定一次后進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)，首先設(shè)置好實(shí)驗(yàn)分組，之后每組各取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后切取目標(biāo)蛋白，之后將其立即轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(美國Santa公司)，轉(zhuǎn)移后用脫脂牛奶封閉2小時洗滌3次后加入一抗，洗滌3次，之后加入二抗洗滌3次，洗滌完成后進(jìn)行ECL熒光照片，全組實(shí)驗(yàn)以β-actin作為內(nèi)參，凝膠成像儀分析系統(tǒng)掃描并定量膠片條帶灰度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

在分組前所有大鼠飲食均正常，同時皮毛光滑有明顯的光澤，而造模成功后，模型組和橙皮苷治療組大鼠活動明顯減少，同時精神萎靡，毛色發(fā)黃，橙皮苷開始治療后，皮毛等明顯有好轉(zhuǎn)，飲食和飲水也有明顯改善，精神活動雖有一定改善，但不明顯。

2.2 腎功能相關(guān)指標(biāo)

由表1可見，模型組與對照組相比，血尿素氮和24小時尿蛋白明顯升高(P<0.05)；白蛋白明顯降低，橙皮苷治療4周，血尿素氮和24小時尿蛋白均明顯降低(P<0.05)，白蛋白明顯升高，治療8周后，上述指標(biāo)進(jìn)一步改善(P<0.05)。

表1 治療4周后和8周后大鼠腎功能基本指標(biāo)評價

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.3 血清IL-1和IL-6的測定

與正常組比較，模型組大鼠IL-1和IL-6明顯升高(P<0.05)。橙皮苷治療4周后，其水平較模型組均明顯下降(P<0.05)，治療8周后進(jìn)一步降低。詳見表2。

表2 治療4周后和8周后大鼠血清中IL-1以及IL-6含量變化

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.4 免疫組化

免疫組化可見，正常對照組只有少量的NF-κB和TLR-4分泌(圖中褐色部分所見)，模型組NF-κB和TLR-4明顯增高，橙皮苷治療后上述兩個指標(biāo)分泌均明顯下降，治療8周后下降更明顯，詳見圖1和圖2。

圖1 大鼠腎臟組織中NF-κB免疫組化圖

圖2 大鼠腎臟組織中TLR-4免疫組化圖

2.5 蛋白表達(dá)

與正常組相比，模型對照組NF-κB和TLR-4蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，治療4周后NF-κB和TLR-4明顯降低(P<0.05)，治療8周后基本和治療4周后一致，詳見圖3和表3。

2.6 mRNA表達(dá)

與正常組相比，模型對照組NF-κB和TLR-4的mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，治療4周后NF-κB和TLR-4明顯降低(P<0.05)，治療8周后基本和治療4周后一致，詳見圖4和表4。

圖3 治療4周后和8周后大鼠腎臟組織中NF-κB和TLR-4的蛋白表達(dá)

表3 治療4周后和8周后大鼠腎臟組織中NF-κB和TLR-4的蛋白的相對表達(dá)量

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

圖4 治療4周后和8周后大鼠腎臟組織中NF-κB和TLR-4的mRNA表達(dá)

表4 治療4周后和8周后大鼠腎臟組織中NF-κB和TLR-4的mRNA的相對表達(dá)量

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

3 討論

IgA腎病簡而言之就是一種以血清中IgA明顯升高，造成其在腎臟中過度聚集，進(jìn)而引發(fā)病變的一種病癥[5]。目前已有大量的研究顯示[6-8]，IgA腎病與遺傳和基因表達(dá)異常密切相關(guān)，是典型的免疫系統(tǒng)疾病。單純的降低免疫反應(yīng)危害較大，非急性患者使用會帶來很多不良反應(yīng)，而目前西藥治療本病沒有特效藥，因此積極研究和開發(fā)治療本病的藥物是十分必要的。已有的研究表明，IgA免疫球蛋白的異常增高可以造成其在腎臟的沉積，而沉積最主要的危害就是引起腎臟炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)必須積極消除，否則會反作用于已經(jīng)受損的腎臟，造成其后續(xù)并發(fā)終末期腎炎、腎臟衰竭等[9]。因此治療本病的原則除降低免疫反應(yīng)外，依靠藥物降低免疫炎癥介質(zhì)，使其不易在腎臟中沉積是治療本病的一個方向。

橙皮是經(jīng)典中藥材之一，其價格便宜但效果較好，臨床中多用其配合其他中藥材合用，具有化痰理氣、健脾導(dǎo)滯等疾病，此外其還可以用于治療感冒咳嗽，食欲不振，胸腹脹痛以及腸鳴便瀉等[10-11]，橙皮苷是從橙皮中提取的一類化合物，研究顯示橙皮苷具有維持患者滲透壓、增強(qiáng)患者毛細(xì)血管的韌性、降低膽固醇等方面作用，而近年來關(guān)于其可以調(diào)節(jié)腎功能，改善一些腎病也有文獻(xiàn)報道[12]，但是目前關(guān)于其是否可以治療IgA腎病還沒有文獻(xiàn)報道，本次采用經(jīng)典造模法構(gòu)建IgA腎病模型，該造模方法雖然造模時間長，但其主要作用為破壞大鼠免疫能力，因此將其用于IgA腎病發(fā)生后的研究是有意義的，研究顯示，與正常組相比，模型組24小時尿蛋白、血肌酐、白介素1和白介素6明顯升高(P<0.05)，白蛋白明顯下降(P<0.05)，治療4周后24小時尿蛋白、血肌酐、白介素1和白介素6明顯降低，白蛋白明顯升高，而治療8周后，上述指標(biāo)基本與治療4周后一致，這提示橙皮苷對IgA腎病大鼠短期內(nèi)具有一定的調(diào)節(jié)作用，但是遠(yuǎn)期效應(yīng)一般。

白介素1和白介素6的降低表明其對炎癥反應(yīng)具有很好的調(diào)節(jié)作用，但具體是哪種酶的調(diào)節(jié)還需明確，由于炎癥反應(yīng)首先發(fā)生于IgA免疫蛋白集結(jié)于腎病后，因此降低炎癥反應(yīng)說明其可以緩解IgA腎病的進(jìn)展，臨床中TLRs是既參與免疫反應(yīng)又參與炎癥反應(yīng)的重要因子，本因子可在肝臟、腎臟、脾以及肺中廣泛表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其靶向介導(dǎo)炎性因子較多，其中激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是最為直接的一環(huán)，NF-κB是炎癥反應(yīng)最典型介質(zhì)之一，其可以殺傷壞死的細(xì)胞，但是在殺傷的同時也會激活大量炎癥因子，諸如IL-1和IL-6，最終影響免疫和炎癥反應(yīng)[13-16]。本次研究采用免疫組化、Western blot以及RT-PCR重點(diǎn)觀察其治療后NF-κB和TLR-4表達(dá)明顯降低，這提示橙皮苷對IgA腎病具有很好的調(diào)節(jié)作用。

綜合提示：橙皮苷可明顯下調(diào)IgA腎病大鼠腎臟組織中TLR-4和NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)，改善腎功能，最終保護(hù)腎臟，但其調(diào)控炎癥反應(yīng)遠(yuǎn)期效應(yīng)較差，具體原因仍有待于后期研究進(jìn)行。

[1] 周勝元，楊洪濤. IgA腎病中醫(yī)分型的研究進(jìn)展[J]. 西部中醫(yī)藥，2007，20(8)：85-87.

[2] Sena LD，Deressa WA，Ali AA. Analysis of trend of malaria prevalence in south-west Ethiopia：a retrospective comparative study[J]. Malaria Journal，2014，13(1)：343-343.

[3] Soltani S，Hafshejani A M，Salehiniya H. Trend of disability prevalence in Iran：An evidence to improve disability data.[J]. Journal of Research in Medical Sciences，2015，20(5)：531-532.

[4] 彭偉，劉鄭榮. 兩種IgA腎病大鼠模型的比較[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，28(10)：1842-1845.

[5] 汪力，王少清. IgA腎病的發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2015(15)：2712-2714.

[6] 鄒粵，于雪蓮. IgA腎病現(xiàn)代研究進(jìn)展[J]. 光明中醫(yī)，2015，(3)：663-665.

[7] 周朝敏. IgA腎病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 器官移植內(nèi)科學(xué)雜志，2015，(2)：56-62.

[8] 呂繼成. IgA腎病治療進(jìn)展及思考[J]. 臨床內(nèi)科雜志，2014，31(5)：297-299.

[9] Fliser D，Bahlmann FH. Anemia and Progression of Chronic Kidney Disease[M]// Studies on Renal Disorders. Humana Press，2011：611-630.

[10] 黃燕玲，羅宗銘. 橙皮提取物的抗氧化作用研究[J]. 廣東化工，2001，28(4)：32-33.

[11] 方巖雄，張焜. 橙皮的綜合利用[J]. 廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，(S1)：86-91.

[12] 殷章紅，羅鵬程，王才英. 橙皮苷抑制JNK信號通路輔助治療2型糖尿病大鼠[J]. 長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，31(3)：460-462.

[13] 徐佳，崔蕊. IgA-I號治療IgA腎病腎組織IL-1β,IL-6檢測分析[J]. 黑龍江醫(yī)學(xué)，2008，32(9)：663-665.

[14] 劉小平，胡順金，方琦. 大鼠IgA腎病模型的建立及血清中IL-6、FN、NO的檢測[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(1)：5-8.

[15] 王菁，程曉東，張小寧，等. IgA腎病患者血清IgA及治療前后尿液IL-6水平改變的臨床價值[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25(6)：55-57.

[16] Schneeman T A，Bruno M E，Schjerven H，et al. Regulation of the polymeric Ig receptor by signaling through TLRs 3 and 4：linking innate and adaptive immune responses.[J]. Journal of Immunology，2005，175(1)：376-384.

(本文編輯： 董歷華)

Effect of hesperidin on TLR-4 and NF-κB in kidney tissue of IgA nephropathy rats

CHENMingzhe，HEWei.TheNephrologyDepartmentofHuangshiCentralHospital，Huangshi435000，China

Correspondingauthor：HEWei，E-mail：hsyiyuantougao@163.com

Objective To study the effect of hesperidin on TLR-4 and NF-kB in IgA nephropathy rats，and discuss whether hesperidin have the protective effect to kidney and its protection mechanism. Methods 60 male SD rats were randomly divided into normal group，model group and hesperidin treatment group，after the IgA model was successfully established，hesperidin treatment group was given hesperidin (10 mg/kg·d) to lavage treatment，the normal group and model group was given equal saline lavage，and after 4 weeks and 8 weeks of treatment, rats were sacrificed to detect the 24h urine protein，serum BUN，blood albumin，interleukin 1 and interleukin-6，immunohistochemistry，RT-PCR and Western Blot was used to detect the expression of TLR-4 and NF-κB in renal tissue. Results In the process of the whole experiment，the normal group was fed with normal diet and the spirit was good，model group and the hesperidin group has certain anorexia and depression after molding， the above situation was improved after using hesperidin; Compared with normal group，model group in 24h urinary protein，serum BUN，interleukin-6 and interleukin-1 rise obviously，albumin was significantly lower，after 4 weeks of treatment，those indices were improved significantly，results of 8 weeks and 4 weeks of treatment were basically the same; Compared with normal group，TLR-4 and NF-kB protein and mRNA expression in model group were significant increased，after 4 weeks of treatment of hesperidin, these indices were significantly reduced，after 8 weeks of treatment，the expression was more less (P<0.05). Conclusion Hesperidin can obviously decrease the expression of TLR-4 and NF-kB and inflammatory reaction，it also can improve renal function，eventually to protect kidney.

Hesperidin； IgA nephropathy； Toll-like receptor 4； NF-κB

435000 黃石中心醫(yī)院自籌項(xiàng)目(2014HS023)

鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院腎內(nèi)科(陳明喆)，老年病科(何偉)；湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院(何偉)

陳明喆(1981- )，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療老年病。E-mail：12616918@qq.com

何偉(1980- )，碩士，主治醫(yī)師，講師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療腎病。E-mail：hsyiyuantougao@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.01.002

2016-07-09)