蛋白質(zhì)含量測定方法概述

趙燕萍

摘要：食品中蛋白質(zhì)含量是衡量其營養(yǎng)價值高低的一項重要指標(biāo)，因此有關(guān)蛋白質(zhì)的分析檢測對于人和動物健康來說尤為重要。目前所采用的蛋白質(zhì)含量檢測方法主要有凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法等，本文就實驗室常用的幾種蛋白質(zhì)檢測方法及其特點分別作簡單介紹。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)含量測定；方法；特點

蛋白質(zhì)含量的測定是目前生物化學(xué)中常用的一項指標(biāo)測定。目前國內(nèi)外所采用的檢測方法主要有凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲分光光度法、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）、Lowry法、二辛可酸比色法（BCA法）、熒光光度法、電流法、毛細(xì)管電泳分析法、羅丹明生物探針法以及高效光譜遙感技術(shù)分析法等。

每種測定法都有其優(yōu)勢，但也不可避免存在一定缺點。實驗中，應(yīng)綜合考慮各方面因素再選擇最佳使方法。實驗對測定所要求的靈敏度和精確度、蛋白質(zhì)的性質(zhì)、溶液中存在的干擾物質(zhì)、測定所要花費的時間等因素都會影響最終實驗方法的選擇。

本文主要就幾種常見的蛋白質(zhì)測定方法的原理及特點作一簡單概述、比較。

1 凱氏定氮法

1.1基本原理

凱氏定氮法包括微量定氮法和全量定氮法兩種方法，其測定蛋白質(zhì)含量的過程主要包括消化、蒸餾、吸收、滴定等步驟。

含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨，此過程稱為“消化”。濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，溶液中氫離子濃度降低。用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止，即可根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)計算出待測物中的總氮量。蛋白質(zhì)中的氮含量一般為16%，據(jù)此推斷蛋白質(zhì)含量。

1.2 方法特點

該方法儀器裝置簡單，試劑用量少且廉價易得。精密度、準(zhǔn)確度高，最低可檢出0.05mg氮，且樣品用量少。但操作較繁瑣費時，不利于大批樣品的測定，且測定的結(jié)果只能是粗蛋白質(zhì)的含量，處理未知樣品時，其誤差還有變大的危險。

1.3適用場合

適用于一切形態(tài)的食品與生物樣品。對于不溶和渾濁的樣品，其他許多方法不能進(jìn)行測定，凱氏定氮法是唯一可行的分析方法。

2雙縮脲法

2.1基本原理

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出1個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以一個中間碳原子相連的肽鍵，都有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)時，紫色絡(luò)合物顏色的深淺與其濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用以測定蛋白質(zhì)含量。

2.2方法特點

該方法操作簡便，試劑單一，可快速測定蛋白質(zhì)含量，測定受蛋白質(zhì)種類和環(huán)境溫度的影響小。但靈敏度差，測定范圍僅為1～20mg蛋白質(zhì)。

2.3適用場合

適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定，常用于谷物蛋白質(zhì)含量測定。

3紫外吸收法

3.1基本原理

蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的能力。在280nm具有吸光度是蛋白質(zhì)的一種普遍性質(zhì)。一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在280nm的吸光度與其濃度成正比。

3.2方法特點

該方法不消耗樣品，測定后樣品仍能回收，低濃度鹽類不干擾測定，且簡便、靈敏、快速。但也存在缺點：①在測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。②若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì)，會對結(jié)果產(chǎn)生較大干擾。③蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此樣品與標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的pH值若不同，會影響樣品中蛋白含量的測定。

3.3 適用場合

適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中（特別是在柱層析分離中）廣泛應(yīng)用。

4 考馬斯亮藍(lán)法

4.1 基本原理

考馬斯亮藍(lán)法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的?？捡R斯亮藍(lán)是一種有機(jī)染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，在蛋白質(zhì)含量為1～1000μg范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。

4.2方法特點

該法易于操作，干擾物質(zhì)少，所用試劑較少，顯色劑易于配制。同時考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而穩(wěn)定，2min左右即達(dá)到平衡，其結(jié)合物室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5～20min之間，顏色的穩(wěn)定性最好。

但由于各種蛋白質(zhì)中的堿性氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考馬斯亮藍(lán)法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用γ-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

4.3適用場合

該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質(zhì)的測定。

5總結(jié)

蛋白質(zhì)測定方法有十幾種，在常用測定方法中，考馬斯亮藍(lán)法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍。凱氏定氮法測定結(jié)果較為準(zhǔn)確，靈敏度高，故往往以該法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。但凱氏定氮法操作過程比較復(fù)雜繁瑣，測定也較費時，且會產(chǎn)生大量有毒有害氣體，危害操作者的身體健康，污染環(huán)境。紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法都是較為快速的測定方法。另外，不同方法下不同物質(zhì)對蛋白測定的干擾也不同。故對于不同樣品，應(yīng)選擇合適方法測定，如對測定結(jié)果要求較高，則往往需要結(jié)合多種方法測定，并分析測定結(jié)果，最終得出最準(zhǔn)確蛋白含量值。

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