HPLC法分析山西不同大豆品種皂醇含量

王衛(wèi)東,趙巧玲,高春燕,郭春絨,趙晉忠,杜維俊,岳愛琴*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院， 山西 太谷 030801; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

HPLC法分析山西不同大豆品種皂醇含量

王衛(wèi)東1,趙巧玲1,高春燕1,郭春絨1,趙晉忠1,杜維俊2,岳愛琴2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院， 山西 太谷 030801; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]評價(jià)不同粒重、種皮顏色和生態(tài)類型大豆材料中皂醇含量的差異性，篩選高皂醇含量基因型大豆材料，為大豆高皂醇含量品種選育和機(jī)理研究提供理論依據(jù)。[方法]以具有代表性生態(tài)類型的72個大豆品種(系)為材料，用HPLC法對大豆皂醇含量進(jìn)行了測定。[結(jié)果]供試大豆品種總皂醇含量變異范圍為0.92～4.02 mg·g-1；小粒型材料皂醇A、皂醇B和總皂醇含量顯著高于中粒型和大粒型材料；黑色種皮大豆材料皂醇A和總皂醇含量顯著高于黃色和綠色；野生大豆材料皂醇A和總皂醇含量顯著高于栽培種；不同組織胚中皂醇A、皂醇B和總皂醇含量最高，種皮最低。[結(jié)論]不同大豆品種皂醇含量差異顯著，且小粒、黑色、野生大豆材料中皂醇含量最高。

大豆； 皂苷； 皂醇； HPLC

大豆皂苷屬于三萜類齊墩果酸型皂苷，目前已發(fā)現(xiàn)54種大豆皂苷[1]。大豆皂苷主要由苷元(皂醇A和B)連接一個或兩個糖鏈組成[2,3]。大豆皂苷具有多種對人體有益的生理功能[4～6]，如降血脂、防癌、抗癌和增強(qiáng)免疫等生理活性[7～11]。

大豆皂苷通過酸、微生物和酶水解為大豆苷元即大豆皂醇A和B[12](圖1)。近年來研究表明，大豆皂醇的生物活性高于大豆皂苷，且大豆皂醇B的生物活性最高[13]。大豆皂醇和大豆皂苷具有不同的生理功能，如皂醇具有抗血小板凝集、預(yù)防和治療免疫疾病、抑制HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的生長等生理活性[14～18]。大豆皂苷具有苦澀味，但水解為大豆皂醇后苦澀味顯著降低[19]。由于大豆皂苷種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺乏各類皂苷的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測大豆皂苷各組分含量有一定的困難，對大豆皂醇A和B的含量進(jìn)行測定則較容易。因此，本研究利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法對大豆皂醇A和B的含量進(jìn)行研究。

圖1 大豆皂苷的水解示意圖Fig.1 The hydrolysis of soyasaponin

Kim等[20]對來源于中國、美國、韓國3個國家大豆材料的大豆皂醇A和B含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)中國大豆材料中皂醇含量最高，但我國對不同大豆材料皂醇A和B含量的研究尚無報(bào)道。因此本研究選用山西72個大豆品種(系)種質(zhì)為材料，通過HPLC法測定不同材料種子和不同組織中大豆皂醇A和皂醇B含量，旨在明確不同品種、不同組織大豆皂醇A和皂醇B的變異范圍，以期挖掘大豆皂醇含量的特異種質(zhì)資源，為大豆功能保健食品的開發(fā)以及品質(zhì) 育種改良(提高大豆皂醇B含量，降低皂醇A含量)提供優(yōu)異材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為適宜山西種植的72份大豆材料，詳見表1。種子用震動球磨儀GT200粉碎后備用。鼓粒期取野生大豆材料SNWS38的根、莖和葉，經(jīng)冷凍干燥后，用震動球磨儀GT200粉碎后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆皂苷提取液的制備

準(zhǔn)確稱取0.4 g樣品置于離心管中，加入30 mL的80%乙醇，漩渦震蕩儀上震蕩2 min,室溫下浸提24 h，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，室溫下避光保存。

1.2.2 大豆皂苷的水解

參照J(rèn)ane等[21]人水解方法，對其做了進(jìn)一步的改進(jìn)。取20 mL的提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37 ℃旋干，75 ℃水浴鍋中水解195 min，使之充分水解，用0.22 μm 的微孔濾膜過濾。

1.2.3 皂醇含量的測定

采用高效液相色譜法測定大豆種子皂醇含量。大豆皂醇A和B標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司, 色譜純。

采用Agilent 12600高效色譜儀和ZORBAX SB-C18(5 μm，25 cm×4.6 mm)色譜柱進(jìn)行定量分析。流動相A為0.1%的乙酸乙腈溶液，流動相B為0.1%乙酸水溶液；洗脫梯度為：0～10 min，55%A；10～20 min，55%～60%A；20～30 min，60%A；30～50 min，60%～70%A；50～60 min，70%A；60～65 min，70%～55%A；流速1.0 mL·min-1，檢測波長為205 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量30 μL，運(yùn)行65 min。

表1 本研究所用的大豆材料來源

Table 1 The resource of Soybean variety used in the research

序號No.材料名稱Accession產(chǎn)地Origin序號No.材料名稱Accession產(chǎn)地Origin18157山西37SNWS48山西2汾豆56山西38SNWS94山西3汾豆78山西39SNWS194山西4晉大47山西40SNWS201山西5晉大53山西41SNWS222山西6晉大70山西42SNWS258山西7晉大73山西43SNWS273山西8晉大74山西44SNWS285山西9晉豆19山西45SNWS343山西10晉豆25山西46SNWS346山西11晉豆39山西47SNWS474山西12晉豆52山西48SNWS600山西13晉科1號山西49SNWS601山西14晉科4號山西50太谷小黑豆山西15晉遺30山西51武鄉(xiāng)小黑豆山西16晉遺31山西52襄汾小黑豆山西17晉遺52山西53早16山西18黑青豆山西54山寧16號山東19L-6山西55強(qiáng)豐1號山東20呂梁黃豆山西56奇農(nóng)1號北京21柳林小黑豆山西57中黃13北京22綠青豆山西58中黃24北京23千斤豆山西59中黃37北京24平南山西60中黃42北京25青黑豆山西61中黃55北京26SNSZ17山西62石豆1號河北27SNSZ23山西63許豆6號河南28SNSZ174山西64周豆11河南29SNSZ218山西65遼豆21遼寧30SNSZ259山西66遼豆22遼寧31SNSZ310山西67鐵豐29遼寧32SNSZ319山西68鐵豐31遼寧33SNSZ533山西69四粒莢北京34SNWS25山西70鐵桿千斤豆湖北35SNWS38山西71中噸大豆山東36SNWS47山西72清來4號不詳

準(zhǔn)確稱取大豆皂醇標(biāo)準(zhǔn)品皂醇A和B各1.0 mg，溶于1.0 mL甲醇，配成1.0 g·L-1的儲備液。將各儲備液逐級稀釋為50、100、150、200、250、300 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液?；貧w方程分別為：YA=19.841 37X，R2=0.9973，線性范圍為0～300 mg·L-1，YB=21.362 9X，R2=0.997 3；線性范圍為0～300 mg·L-1。利用回歸方程計(jì)算皂醇A和皂醇B的含量，總皂醇含量為皂醇A和皂醇B含量之和。

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用 Pearson 相關(guān)分析對皂醇各組分進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆皂醇含量的分析

用HPLC法對供試材料大豆種子中大豆皂醇含量進(jìn)行分析測定，結(jié)果表明不同品種大豆種子中總皂醇、皂醇A和B含量差異較大。供試材料種子中皂醇A、皂醇B和總皂醇的變異范圍分別為0.19～1.54 mg·g-1、0.63～2.69 mg·g-1和0.92～4.02 mg·g-1，其中晉科4號總皂醇含量最低，野生大豆材料SNWS38總皂醇含量最高(譜圖見圖2)。大豆皂醇B和A的比值的變異范圍為1.36～6.46(表2)。

表2 不同大豆品種皂醇A和大豆皂醇B含量分析

Table 2 Analysis on the content of soyasapogenol A and B in soybean varieties

大豆皂醇A/mg·g-1SoyasapogenolA大豆皂醇B/mg·g-1SoyasapogenolB總皂醇/mg·g-1TotalSoyasapogenolB/A最大值1.542.694.026.46最小值0.190.630.921.36平均值0.591.592.182.90標(biāo)準(zhǔn)差0.220.420.640.95CV/%38276533

2.2 不同粒重類型大豆皂醇含量分析

對不同粒重類型種子中大豆皂醇含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明大豆皂醇A、B和總皂醇含量依次為小粒型(<13 g)>中粒型(13～24 g)>大粒型(>24 g)。小粒型材料種子中大豆皂醇A、B和總皂醇含量分別為0.77、1.86和2.63 mg·g-1。小粒、中粒型材料種子中大豆皂醇A、B含量顯著高于大粒型大豆材料；小粒型材料種子中總皂醇含量顯著高于中粒型和大粒型材料(圖3)。

圖2 晉科4號和SNWS38液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography (HPLC) figure of JinKe 4 and SNWS38

圖3 不同粒重類型大豆皂醇含量分析Fig.3 Statistical analysis of soyasapogenol content in different seed weight types 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Note:Different small letters show significant difference at the 0.05 level, the same below.

2.3 不同種皮顏色大豆材料皂醇含量的分析

對不同種皮顏色大豆材料種子中大豆皂醇含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同種皮顏色大豆材料皂醇A、B及總皂醇含量差異顯著，依次為黑色類型>綠色類型>黃色類型(圖4)。黑色種皮類型大豆材料皂醇A、B和總皂醇含量最高，分別為0.76、1.86、2.62 mg·g-1；黃色類型材料皂醇A、B和總皂醇含量最低，分別為0.51、1.47、1.98 mg·g-1。黑色種皮類型大豆材料皂醇A含量和總皂醇含量顯著高于黃色類型和綠色類型。黃色種皮大豆材料皂醇A、B和總皂醇含量與綠色類型差異均不顯著。

圖4 不同種皮顏色大豆材料皂醇含量分析Fig.4 Statistical analysis on the content of soyasapogenol in different color types of soybeans

2.4 野生、半野生、栽培大豆材料皂醇含量分析

圖5 野生、半野生和栽培大豆材料種子中大豆皂醇含量分析Fig.5 Statistical analysis of soyasapogenol content in Wild, Semi-wild and Cultivated Soybean seed

不同生態(tài)類型大豆材料總皂醇和皂醇A含量差異顯著，依次為野生>半野生>栽培(圖5)。野生、半野生大豆材料皂醇B含量顯著高于大豆栽培品種，而野生和半野生大豆材料之間差異不顯著。

2.5 大豆皂醇含量與籽粒性狀的相關(guān)分析

分析大豆皂醇A、B和總皂醇含量之間及其與籽粒性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明大豆皂醇A、B與總皂醇含量呈極顯著正相關(guān)，其中皂醇B與總皂醇含量相關(guān)系數(shù)達(dá)0.952(表3)。粒長、粒寬、子葉重和胚重與大豆皂醇A、B和總皂醇含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表3 大豆皂醇A和B與總量的相關(guān)性分析

注：*表示差異性達(dá)顯著水平(P<0.05)；**表示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。

Note:* represent significant differencesd level at the 0.05 level,**show significant differencesd level at the 0.01 level.

2.6 不同組織中大豆皂醇含量分析

對大豆材料SNWS38不同組織中皂醇A、皂醇B和總皂醇含量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不同組織間皂醇含量差異顯著。胚中皂醇A、皂醇B和總皂醇含量分別為11.52、9.13和20.64 mg·g-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織中的含量，種皮中皂醇含量最低，僅為0.22 mg·g-1(表4)。子葉中皂醇B含量與皂醇A的比值為2.64，胚中比值僅為0.79。

表4 不同組織中皂醇含量分析

Table 4 Analysis of soyasapogenol content in different tissues of soybean

不同組織Differenttissues皂醇A/mg·g-1SoyasapogenolA皂醇B/mg·g-1SoyasapogenolB總皂醇/mg·g-1TotalSoyasapogenolB/A胚11.52±0.65a9.13±0.67a20.64±1.18a0.79子葉0.66±0.05c1.74±0.10b2.39±0.06b2.64種皮0.14±0.01d0.08±0.01d0.22±0.02cd0.57葉0.20±0.05bc1.42±0.08b1.62±0.06b7.10莖0.08±0.03b0.81±0.07c0.89±0.09bc10.13根0.24±0.04bc0.57±0.05cd0.81±0.08bc2.38

3 討論與結(jié)論

大豆[GlycinemaxL. Merr.]是重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，大豆籽粒除含有人類食用的植物蛋白質(zhì)和油脂外[22]，還富含許多對人體有益的生物活性物質(zhì)如大豆異黃酮、大豆皂苷等[23]。

大豆皂苷是大豆生長發(fā)育過程中的重要次生代謝產(chǎn)物之一，具有許多對人體有益的生理功能，同時(shí)也是導(dǎo)致大豆食品苦澀味的主要原因之一[4～6,24]。大豆皂苷的水解產(chǎn)物為大豆皂醇A和大豆皂醇B，大豆皂醇的生物活性高于大豆皂苷，并且可以降低大豆制品的苦澀味[19]。因此本研究通過對山西不同生態(tài)類型大豆材料種子中大豆皂苷水解產(chǎn)物皂醇含量進(jìn)行分析，有助于我們了解山西不同大豆種質(zhì)皂醇變異范圍，對今后大豆品質(zhì)改良具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，參試品種籽粒中總皂醇平均值為2.18 mg·g-1，顯著高于Vasantha Rupasinghe等[25]利用HPLC法對加拿大大豆品種籽粒中總皂醇的測定含量(2.00 mg·g-1)，同時(shí)高于Kim等[20]對來自美國和韓國大豆品種籽粒中總皂醇含量，本研究測定總皂醇含量的變異范圍也比較大(0.92～4.02 mg·g-1)，說明我們具有皂醇含量變異豐富的的大豆資源，有利于今后開展大豆皂苷品質(zhì)育種工作。

本研究還發(fā)現(xiàn)野生大豆材料籽粒中皂醇A、皂醇B和總皂醇含量最高，其次為半野生材料，栽培品種最低，該結(jié)論與Hu等[26]的結(jié)論一致。同時(shí)本研究對不同組織皂醇含量測定發(fā)現(xiàn)，大豆胚中皂醇含量最高，種皮最低。該結(jié)論與Vasantha Rupasinghe、Berhow等[25,27]對大豆皂醇含量分布的研究結(jié)果類似。

研究表明大豆皂醇B的生物活性顯著高于大豆皂醇A[13]。本研究參照J(rèn)ane等[21]人水解方法利用1N HCl-甲醇溶液對山西72份大豆品種(系)種質(zhì)材料和優(yōu)異種質(zhì)材料SNWS38鼓粒期不同組織大豆皂苷提取物進(jìn)行水解，得到大豆皂醇A和B。通過HPLC法測定分析，結(jié)果表明參試品種籽粒中大豆皂醇B與A比值的介于1.36～6.46，大于Vasantha Rupasinghe等[25]測定的皂醇B與A比值的變異范圍(2.5～4.5)，進(jìn)一步說明我們具有皂醇含量變異豐富的的大豆資源，有利于我們選擇含有優(yōu)異皂醇組分(皂醇B/A比值大)的種質(zhì)資源進(jìn)行品質(zhì)育種。

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(編輯：武英耀)

Analysis of soyasapogenol contents of different soybean varieties in Shanxi by HPLC method

Wang Weidong1, Zhao Qiaoling1, Gao Chunyan1, Guo Chunrong1, Zhao Jinzhong1, Du Weijun2, Yue Aiqin2*

(1.CollegeofArtsandSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]To provide theoretical basis for the selection and mechanism study of soybean varieties with high content of soyasapogenol, the difference of soyasapogenol contents in different grain weight, seed coat color and ecological type of soybean materials were evaluated, soybean genotype materials with high soyasapogenol content were screened. [Methods]The contents of soyasapogenol were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) method with 72 soybean varieties from Shanxi as materials.[Results]We found that the soyasapogenol contents of 72 soybean varieties ranged from 0.92 to 4.02 mg·g-1; the contents of soyasapogenol A, B and the total soyasapogenol of small grain materials were significantly higher than those of medium grain and large grain type materials; the soyasapogenol A and total soyasapogenol contents of soybean varieties with black seed coat were significantly higher than those with yellow or green seed coat; the contents of soyasapogenol A and the total soyasapogenol in the wild soybean were significantly higher than those in the cultivated species; In different tissues, the content of soyasapogenol A, B and total soyasapogenol in hypocotyl was the highest, and the content of soyasapogenol in seed coat was the lowest. [Conclusion]The content of soyasapogenol was significantly different in different soybean varieties,the content of soyasapogenol in the variety with the characteristics of small grains, black seed coat, wild materials was the highest.

Soybean， Saponin， Soyasapogenol， HPLC

2016-10-17

2016-12-26

王衛(wèi)東(1989-)，男(漢)，山西平魯人，碩士研究生，研究方向：大豆品質(zhì)育種

*通信作者：岳愛琴，副教授，碩士生導(dǎo)師,Tel:18734484606；E-mail:yueaiqinnd@126.com

山西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20120311005-3)；山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目(2015148)；山西省自然科學(xué)基金(201601D011076)

S331

A

1671-8151(2017)03-0201-06