中性蛋白酶酶解制備花生蛋白肽的研究

王 可，張洪梅，王 薇，謝金蓮

(長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032)

中性蛋白酶酶解制備花生蛋白肽的研究

王 可，張洪梅，王 薇，謝金蓮

(長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032)

以生花生粕作為原料，以水解度和DPPH清除率為衡量指標(biāo)，選擇酶解溫度、酶解pH值、酶比底物濃度為考察因素，研究中性蛋白酶制備花生蛋白肽的酶解工藝。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)三種因素進(jìn)行了擇優(yōu)選擇，在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析因素間的交互作用和最優(yōu)工藝參數(shù)。結(jié)果表明，在溫度為42 ℃，pH值為8.25，酶比底物濃度為9 %時(shí)，水解度達(dá)到最優(yōu)值46.13 %；在溫度為47.5 ℃，pH值為8.5，酶比底物濃度為9 %時(shí)，DPPH清除率達(dá)最優(yōu)值39.68 %。

花生蛋白肽；中性蛋白酶；水解度；DPPH清除率

花生蛋白相比大豆蛋白，其含脹氣因子較少，相比菜籽、棉籽蛋白，其毒性較低[1]，利用花生蛋白可以改變食品的某些加工特征，用于多種食品添加劑之中[2]?；ㄉ墒羌庸せㄉ偷母碑a(chǎn)品，顏色為深褐色或淡褐色，主要由種皮、外殼、碎果仁組成，因其含有豐富的植物蛋白、不飽和脂肪酸、淀粉、糖及多種維生素，被廣泛應(yīng)用于飼料、釀酒、肥料之中[3-4]。然而，目前關(guān)于花生蛋白在蛋白水解物和生物活性方面的研究仍較少[5]。將花生粕中的蛋白水解物進(jìn)行分解及提取，加工成相應(yīng)功能性食品材料，是花生農(nóng)副產(chǎn)物加工領(lǐng)域中亟待解決的問(wèn)題之一[6-9]。本研究旨在從酶解工藝角度，探討花生蛋白肽的制備方式及方法，并初步探究其抗氧化能力，為花生蛋白肽的工業(yè)化生產(chǎn)及活性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料及試劑

生花生粕(長(zhǎng)春長(zhǎng)白山榨油廠)；中性蛋白酶(食品級(jí)，南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司)；DPPH(分析純，德國(guó)SIGMA公司)；甲醇、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純，北京化工廠)。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

RT-6000酶標(biāo)儀(美國(guó)雷杜公司)；BGZ-240電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；Starter-300 pH計(jì)(北京奧豪斯儀器有限公司)；DS-1高速組織搗碎機(jī)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；1000 μL單道移液器(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；3-18KHS臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)；SE602F電子天平(長(zhǎng)春維拖電子衡器有限公司)；85-2恒溫磁力攪拌器(常州潤(rùn)華儀器有限公司)；篩網(wǎng)(80目，孔徑0.10 mm，浙江上虞道墟儀器篩具廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理方法

將生花生粕平鋪于實(shí)驗(yàn)盤中，厚度為1 cm，預(yù)熱干燥箱，待箱內(nèi)溫度達(dá)到60 ℃后，將花生粕置于干燥箱中，設(shè)置烘干時(shí)間為4 h。將烘干后的花生粕于室溫下冷卻后放入高速組織搗碎機(jī)中搗碎，設(shè)置轉(zhuǎn)速為10000 r/min，操作時(shí)間1 min。用篩網(wǎng)(80目0.10 mm)篩取生花生粕粉，以備酶解。

1.2.2 生花生粕的酶解方法

稱取5 g篩后生花生粕粉放入250 mL的燒杯中，加入適當(dāng)蒸餾水溶解，配置成濃度為5 %的花生粕溶液，將燒杯置于恒溫水浴鍋中，用磁力攪拌器不斷攪拌花生粕溶液，控制溫度為100 ℃，加熱10 min，使蛋白質(zhì)變性；溶液冷卻至一定酶解溫度(45 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃，65 ℃)，保持溫度恒定不變；使用pH計(jì)測(cè)溶液的pH值，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至一定酶解pH值(7.5,8,8.5,9,9.5)，待酶解溫度和pH值穩(wěn)定后，按照一定酶比底物濃度[E]/[S](3 %，5 %，7 %，9 %，11 %)加入適量中性蛋白酶；適當(dāng)添加0.1 mol/L NaOH，保持pH值恒定不變，并記錄添加量。酶解3 h后，將酶解液水浴加熱至100 ℃，滅酶10 min，冷卻至室溫后，放入離心機(jī)，設(shè)置溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速10000 r/min，離心10 min，取上清液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，獲得花生蛋白肽。

1.2.3 水解度的測(cè)定方法

水解度用于表示蛋白質(zhì)水解狀態(tài)下，其肽鍵裂解的百分比，可用于研究蛋白質(zhì)的酶解條件及酶解程度，本研究選用pH-stat法[10]進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式如下：

其中,

h：被水解的肽鍵數(shù)；

V：酸或堿的滴定量(mL)；

C：酸或堿的濃度(mol/L)；

Mp：參加水解的蛋白質(zhì)總量(g)；

htot：每克蛋白質(zhì)中肽鍵的克當(dāng)量數(shù)(mmol/g)；

α：氨基酸的平均離解度。

1.2.4 DPPH清除率的測(cè)定方法

采用比色法對(duì)花生蛋白肽的DPPH清除率進(jìn)行定量分析[11]。在酶標(biāo)板中依次加入100 μL酶解液、100 μL甲醇和100 μL 0.6 mM的DPPH甲醇溶液，避光靜置30 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在515 nm波長(zhǎng)下的吸光度，記為AS，另外。用甲醇作空白，測(cè)定空白的吸光度，記為AB，DPPH清除率計(jì)算公式如下：

其中,

AB：空白的吸光度；

AS：實(shí)驗(yàn)樣品的吸光度。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為研究酶解的溫度(T)、酶解pH值和酶與底物濃度比([E]/[S])對(duì)中性蛋白酶酶解花生蛋白肽水解度及花生蛋白肽DPPH清除率的影響，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，方案設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

中性蛋白酶水解花生粕實(shí)驗(yàn)中，需考慮到每個(gè)影響因素之間交互作用，本研究將酶解溫度、酶解pH值、酶比底物濃度作為響應(yīng)值，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[12]，以確定最優(yōu)工藝參數(shù)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)編碼設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 花生蛋白肽水解度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(a)溫度對(duì)花生蛋白肽DH的影響

(b)pH值對(duì)花生蛋白肽DH的影響

(c)酶比底物濃度對(duì)花生蛋白肽DH的影響

由圖1(a)可知，花生蛋白肽的DH隨著酶解溫度的升高逐漸降低，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，DH值最高，為22.92 %；由圖1(b)可以看出，DH隨著pH值的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，升高至8.5時(shí)，DH值達(dá)到最高，為13.35 %，而隨著pH值繼續(xù)升高，DH逐漸降低；由圖1(c)可知，DH隨著酶比底物濃度的增加亦呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶比底物濃度升高至7 %時(shí)，DH值達(dá)到最高，為18.45 %，隨著酶比底物濃度繼續(xù)增加，DH逐漸降低。

2.1.2 花生蛋白肽DPPH清除率單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2(a)可知，花生蛋白肽的DPPH清除率隨著酶解溫度的升高逐漸降低，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)DPPH清除率最高，為33.65 %；由圖2(b)可知，DPPH清除率隨著pH值得升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值升高至8.5時(shí)，DPPH清除率達(dá)到最高，為38.02 %，繼續(xù)升高pH值，DPPH清除率反而降低；由圖2(c)可知，DPPH清除率隨著酶比底物濃度的增加亦呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶比底物濃度升高至7 %時(shí)，DPPH清除率最高，為49.21 %，繼續(xù)增加酶比底物濃度，DPPH清除率顯著降低。

(a)溫度對(duì)花生蛋白肽DPPH清除率的影響

(b)pH值對(duì)花生蛋白肽DPPH清除率的影響

(c)酶比底物濃度對(duì)花生蛋白肽DPPH清除率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以研究所選因素對(duì)花生蛋白肽DH和DPPH清除率的綜合影響，響應(yīng)面分析見(jiàn)表3。

表3 DH響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)分析

2.2.2 響應(yīng)面3D圖分析

對(duì)表3的結(jié)果利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，得到花生蛋白肽水解度實(shí)驗(yàn)回歸模型的交互作用及響應(yīng)面3D圖。如圖3(a)所示，將酶比底物濃度設(shè)為0水平時(shí)，花生蛋白肽的DH隨著溫度由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，而隨著pH值由-1升至1水平，表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。由圖3(b)可知，將pH值設(shè)為0水平時(shí)，花生蛋白肽的DH隨著溫度由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，而隨著酶比底物濃度由-1升至1水平，表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。由圖3(c)可知，將溫度設(shè)為0水平時(shí)，花生蛋白肽的DH隨著pH值由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，而隨著酶比底物濃度由-1升至1水平，表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)；而且，酶解溫度和pH值的交互作用明顯，酶解溫度和酶比底物濃度的交互作用明顯，pH值和酶比底物濃度的交互作用明顯。

(a)溫度與pH值交互作用3D圖

(b)溫度與[E]/[S]的交互作用3D圖

(c)pH與[E]/[S]的交互作用3D圖

花生蛋白肽DPPH清除率實(shí)驗(yàn)回歸模型的交互作用及響應(yīng)面3D圖如圖4所示。由圖4(a)可知，將酶比底物濃度設(shè)為0水平時(shí)，花生蛋白肽的DPPH清除率隨著溫度由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，而隨著pH值由-1升至1水平，表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。由圖4(b)可知，將pH值設(shè)為0水平，花生蛋白肽的DPPH清除率隨著溫度由-1升至1水平，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，而隨著酶比底物濃度由-1升至1水平，變化不明顯；而且，酶解溫度和pH值的交互作用明顯，酶解溫度和酶比底物濃度的交互作用明顯，pH值和酶比底物濃度的交互作用不明顯。

2.2.3 確定最優(yōu)參數(shù)

通過(guò)響應(yīng)面軟件分析可知，以水解度為指標(biāo)，中性蛋白酶酶解花生蛋白肽的最優(yōu)工藝參數(shù)是：溫度為42 ℃、pH為8.25、[E]/[S]為9 %，在此條件下，得到花生蛋白肽的水解度最優(yōu)，為46.13 %；以DPPH清除率為指標(biāo)，最優(yōu)酶解工藝參數(shù)是：溫度為47.5 ℃、pH為8.5、[E]/[S]為9 %，在此條件下，得到花生蛋白肽的DPPH清除率最優(yōu)，為39.68 %。

3 討論

近年來(lái)研究表明，花生粕中氨基酸分布很廣，比例與動(dòng)物蛋白很相似，很利于人體吸收[12]。儀凱[13]利用中性蛋白酶研究水解花生粕制備花生蛋白肽的最佳水解條件發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)時(shí)間3 h，控制溫度44 ℃，pH為6.7，酶比底物濃度6 %時(shí)的理論水解度為7.63 %。本研究選用中性蛋白酶對(duì)花生粕進(jìn)行水解度和DPPH清除率進(jìn)行測(cè)試，在已知研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化了水解條件，水解效果較為理想，且酶解產(chǎn)物花生蛋白肽表現(xiàn)出了一定的抗氧化性，經(jīng)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以兩個(gè)指標(biāo)衡量花生蛋白肽的最佳工藝，[E]/[S]均為9 %，但酶解溫度和pH值不同。由于DPPH清除率響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的回歸模型失擬度顯著，因此其軟件分析獲得的最優(yōu)結(jié)果低于酶比底物濃度單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果。

(a)溫度與pH值交互作用3D圖

(b)溫度與[E]/[S]的交互作用3D圖

(c)pH與[E]/[S]的交互作用3D圖

4 結(jié)論

本文選用中性蛋白酶對(duì)生花生粕進(jìn)行水解，選用水解度和DPPH清除率作為衡量指標(biāo)，在單因素分析法的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解條件中的不同因素進(jìn)行綜合分析，獲得了最優(yōu)酶解工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在溫度為42 ℃，pH值為8.25，酶比底物濃度為9 %時(shí)，花生蛋白肽的水解度達(dá)到最優(yōu)值46.13 %；在溫度為47.5 ℃，pH值為8.5，酶比底物濃度為9 %時(shí)，花生蛋白肽的DPPH清除率達(dá)到最優(yōu)值39.68 %。

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Hydrolysis Preparation of Peanut Protein Peptides by Neutral Protease

WANG Ke, ZHANG Hong-mei, WANG Wei, XIE Jin-lian

(School of Life Science,Changchun Normal University, Changchun Jilin 130032, China)

In this research, the hydrolysis preparation of peanut protein peptides by neutral protease was studied, the peanut meal was used as the raw material, the degree of hydrolysis and DPPH inhibition were detected as indicators, and the enzyme digestion temperature, pH, and [E]/[S] were used as single factors. Selection of merit was analyzed in single factor experiment, and these factors interact with each other and optimal process parameters were analyzed by the response surface experiment design. The results showed that, for hydrolysis degree of peanut protein peptides experiment, the optimal parameters were: temperature of 42 ℃, pH of 8.25, [E]/[S] of 9 %, the DH could reach 46.13 %. And for DPPH inhibition experiment, the optimal parameters were: temperature of 47.5 ℃, pH of 8.5, [E]/[S] of 9 %, the DPPH inhibition could reach 39.68 %.

peanut protein peptides; neutral protease; degree of hydrolysis; DPPH inhibition

2016-11-15

王 可(1988-)，女，碩士研究生，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)及功能性食品研究。

TS201.1

A

2095-7602(2017)02-0071-07