狗棗獼猴桃葉多糖分離純化及抗氧化活性研究

常清泉，楊宗毅，褚友情，王艷麗，吳揚武，苑 容，魯 焰，陸 娟

(長春師范大學化學學院，吉林長春 130032)

狗棗獼猴桃葉多糖分離純化及抗氧化活性研究

常清泉，楊宗毅，褚友情，王艷麗，吳揚武，苑 容，魯 焰，陸 娟

(長春師范大學化學學院，吉林長春 130032)

本文對狗棗獼猴桃葉的多糖進行分離純化，同時對其抗氧化活性進行研究。先后利用DEAE-Sepharose Fast Flow柱色譜、葡聚糖凝膠Sephadex G-200柱色譜進行分離純化得到APs-2-1、APs-3-1、APs-3-2三部分均一多糖；利用苯酚-硫酸法測得三部分均一多糖的總糖含量分別為91.26%、90.23%、88.63%，利用硫酸-咔唑法測得糖醛酸的含量分別為16.20%、27.20%、6.90%；此外，還對狗棗獼猴桃葉多糖及所分離的三種均一多糖的總抗氧化能力(FRAP值)、對羥基自由基和DPPH自由基的清除能力進行測定，結果表明所分離的三種多糖及狗棗獼猴桃葉多糖均具有一定的抗氧化能力，但是抗氧化能力均低于Vc。

狗棗獼猴桃葉；多糖；分離純化；抗氧化活性

狗棗獼猴桃是獼猴桃科、獼猴桃屬落葉藤本植物，產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、河北、四川、云南等省，其中以東北三省最盛，吉林省長白山區(qū)資源較為豐富，四川其次，蘇聯(lián)遠東、朝鮮和日本也有分布[1]。狗棗獼猴桃葉和果實均可入藥[2]。據(jù)文獻報道，狗棗獼猴桃葉中含大量黃酮及黃酮苷、有機酸、多糖、揮發(fā)油類等化合物，金永日、陸娟[3-6]等從狗棗獼猴桃葉中分離鑒定出多種黃酮類、萜類化合物，常曉麗[7-8]等對狗棗獼猴桃葉中其他成分進行了鑒定。狗棗獼猴桃果實富含維生素C，可食、釀酒。

多糖是生物體內(nèi)重要的大分子活性化合物，與維持生物機能密不可分[9]，研究發(fā)現(xiàn)狗棗獼猴桃果實中含有較多的水溶性多糖，其含量大約是3.5%～7.8%[10]。狗棗獼猴桃葉的多糖是其重要的藥效物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用，頗具研究開發(fā)價值[11]。

本文對狗棗獼猴桃葉多糖進行分離純化，同時對所分離均一多糖的抗氧化活性進行研究，為長白山區(qū)狗棗獼猴桃葉的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

紫外-可見分光光度計(UV-2450，島津儀器有限公司)；電子天平(FA/JA，上海精密科學儀器有限公司)；中壓快速純化制備系統(tǒng)(科穗科技有限公司)；微量分析型超純水機(WP-UP-WF-20，四川沃特爾水處理設備有限公司)等。

透析袋(分子量3500 Da，北京瑞達恒輝科技有限公司)；DEAE纖維素DE-52(弱陰離子瓊脂糖凝膠,上海安研生物有限公司)；葡聚糖凝膠G-200(美國GE Healthcare)； 2,4,6-反式2-吡啶基三嗪(TPTZ，北京化工廠)、番紅花、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(國藥集團化學試劑有限公司)，抗壞血酸(上海試劑二廠)，無水乙醇、95%乙醇、葡萄糖等均為分析純，實驗用超純水為實驗室自制。供試用狗棗獼猴桃葉采自吉林省靖宇縣，晾干，粉碎，備用。

1.2 狗棗獼猴桃葉多糖制備

稱取100 g狗棗獼猴桃葉，加入3000 mL蒸餾水,利用超聲波輔助技術提取。提取溫度60 ℃，提取功率900 w，提取時間30 min，提取液減壓濃縮至一定體積，加4倍無水乙醇置冰箱中醇沉24 h，離心得沉淀，分別用無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮等溶劑洗滌沉淀，干燥得狗棗獼猴桃葉粗多糖。粗多糖加蒸餾水溶解，利用Sevage法除蛋白，利用H2O2法脫色后，將所得多糖溶液裝入透析袋(分子量3500 Da)，自來水、蒸餾水透析24 h，透析液濃縮、凍干得狗棗獼猴桃葉多糖粉末。

1.3 離子交換柱層析分離狗棗獼猴桃葉多糖

準確稱取500 mg 狗棗獼猴桃葉多糖，加入約10 mL Tris-HCl 緩沖溶液溶解后，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，將濾液加入DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱，并將層析柱與快速制備色譜儀連接，分別用蒸餾水、0.1 mol/L、0.2 mol/L 的NaCl 溶液洗脫，收集洗脫分離的樣品(5 mL/管)，用苯酚-硫酸法[12]測定490 nm 處吸光度 A 值，繪制洗脫管數(shù)與 A 關系的曲線。根據(jù)洗脫曲線收集單一對稱峰，冷凍干燥。

1.4 凝膠柱層析分離多糖

取離子交換柱分離得到狗棗獼猴桃葉多糖樣品，加入2 ml蒸餾水溶解后，加入已準備好的Sephadex G-200層析柱，并將層析柱與快速制備色譜儀連接，以蒸餾水洗脫，收集洗脫分離的樣品(5 mL/管)，用苯酚-硫酸法測定490 nm 處吸光度 A 值，繪制洗脫管數(shù)與 A 的關系曲線。收集單一峰，根據(jù)洗脫曲線收集單一對稱峰，冷凍干燥。

1.5 多糖紅外光譜分析

取樣品與適量KBr粉末(質(zhì)量比約為1∶100)混合后，在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片，在4000～400 cm-1波長范圍內(nèi)進行紅外掃描。

1.6 均一多糖中總糖及糖醛酸含量測定

總糖含量以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法[12]測定總糖含量。糖醛酸含量以葡萄糖醛酸為標準，利用硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量[13]。

1.7 均一多糖抗氧化活性研究

1.7.1 總抗氧化活性(FRAP)測定

根據(jù)參考文獻[14]，將醋酸緩沖液(300 mmol/L，pH 3.6)、TPTZ (10 mmol/L，溶于40 mmol/L鹽酸中)、 FeCl3(20 mmol/L)溶液按照10∶1∶1的比例混合配制成新鮮的 FRAP工作液，分別取5 μL不同濃度的樣品溶液(0.1～3.0 mg/mL)加入96孔板中，迅速加入FRAP工作液150 μL，以FRAP工作液為空白，測定4 min時樣品的吸光度值，同時以FeSO4·7H2O為標準品，按照樣品測定操作，在100～2000 mmol/L 范圍內(nèi)，繪制工作曲線，計算樣品的FRAP值。

1.7.2 對羥基自由基的清除作用

利用Fenton反應[14]，整個反應體系含有2 mL EDTANa2-Fe(Ⅱ) (0.15 mmol/L), 800 μL水楊酸 (2 mmol/L), 2 mL H2O2(6 mmol/L)和0.2 mL不同濃度的樣品溶液(0.1～3.0 mg/mL)，混勻后于37 ℃水浴保溫30 min，以蒸餾水為空白，在510 nm測吸光度值，同時按照上述操作，測定Vc的吸光度值。按照以下公式計算羥基自由基清除率：

式中：A1為反應體系的吸光度，A0為空白溶液的吸光度，A2為不加樣品或不加H2O2時體系的吸光度。

1.7.3 對DPPH自由基的清除作用

根據(jù)參考文獻[14-15]方法，移取不同濃度的多糖溶液2 ml于10 ml比色管中，分別加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液2 ml，在暗處充分反應30min，在517 nm處測量其吸光度，按照公式計算清除率：

其中，ADPPH為DPPH溶液吸光度值，As為樣品+DPPH溶液吸光度。同時，用相應的Vc溶液代替多糖溶液，測定Vc的清除能力。

2 結果與分析

2.1 離子交換柱層析分離結果

狗棗獼猴桃葉多糖經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow 柱層析，洗脫曲線見圖1。由圖1可知，多糖經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow 柱層析，分別用蒸餾水、0.1 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl 溶液洗脫后，得到5個不同峰，收集5個部分，冷凍干燥，分別命名為APs-1、APs-2、APs-3、APs-4、APs-5。由圖 1可知，APs-2、APs-3峰形瘦高，對稱性好，峰面積大，含量較多，故收集該組分用于下一步實驗。

圖1 狗棗獼猴桃葉多糖DEAE洗脫曲線

2.2 凝膠柱層析分離結果

利用Sephadex G-200凝膠柱層析分離APs-2、APs-3，洗脫曲線見圖2，其中(1)為APs-2的洗脫曲線，(2)為APs-3的洗脫曲線。分別合并濃縮、凍干得三部分固體樣品，命名為APs-2-1、APs-3-1、APs-3-2。三部分多糖經(jīng) HPLC 檢測，其峰形為單一對稱峰，證明為均一多糖組分。

2.3 多糖總糖及糖醛酸含量測定結果

利用苯酚-硫酸法測得三種均一多糖的總糖含量分別為91.26%、90.23%、88.63%；利用硫酸-咔唑法測得三種均一多糖的糖醛酸含量分別為16.20%、27.20%、6.90%。

圖2 APs-2、APs-3經(jīng)葡聚糖凝膠G-200洗脫曲線

2.4 紅外光譜分析

APs-2-1、APs-3-1、APs-3-2的紅外光譜見圖3。從圖中可知，3380.000 cm-1附近(3369.569 cm-1、3396.568 cm-1、3385.479 cm-1)的特征峰為O-H伸縮振動，2930.000 cm-1附近(2934.931 cm-1、2930.019 cm-1、2936.541 cm-1)為多糖類物質(zhì)C-H伸縮振動，1608.000 cm-1附近(1622.819 cm-1、1608.850 cm-1、1608.850 cm-1)為羰基上O-C-O非對稱伸縮振動，1410.000cm-1附近(1448.302 cm-1、1416.964 cm-1、1417.251 cm-1)是C-H的變角振動；通過對以上數(shù)據(jù)的分析可知分離純化得到的三個均一多糖均具有多糖類物質(zhì)的一般特征吸收峰[15]。

圖3 三種均一多糖紅外吸收光譜圖

2.5 多糖抗氧化活性結果

2.5.1 總抗氧化活性(FRAP值)

狗棗獼猴桃葉多糖的FRAP值如圖4，由圖可知狗棗獼猴桃葉多糖，在低濃度時，除APs-3-2外，多糖的 FRAP 值都大于200 mmol/L，隨著濃度的增加，多糖總抗氧化能力逐漸變強，且APs-2-1抗氧化能力高于其他兩種均一多糖，而總糖APs的抗氧化能力卻高于APs-3-2，但四種多糖的抗氧化能力明顯低于Vc。

2.5.2 對羥基自由基、DPPH自由基的清除能力

圖4 狗棗獼猴桃葉多糖總抗氧化能力

圖5 狗棗獼猴桃葉多糖對羥基自由基的清除率

圖6 狗棗獼猴桃葉多糖對DPPH自由基的清除率

狗棗獼猴桃葉多糖對羥基自由基、DPPH自由基的清除能力見圖5、圖6。由圖5可知狗棗獼猴桃葉多糖，羥基自由基的清除率都大于20%，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，多糖羥基自由基的清除率逐漸變強，但是都低于Vc對羥基的清除率。圖6為多糖對DPPH自由基的清除作用，由圖6可知，狗棗獼猴桃葉多糖和APs-2-1、APs-3-1、APs-3-2三種均一多糖都具有清除DPPH的能力，且在一定的濃度范圍內(nèi)多糖濃度的高低與多糖消除DPPH有機自由基能力的強弱成正比關系，即隨著多糖濃度的增加，其清除能力(即抗氧化活性能力)逐漸變強，但是多糖與三部分均一多糖的抗氧化性能力比Vc的抗氧化性能力要低。

3 結論

本文將狗棗獼猴桃葉精致多糖利用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析初步分離后，再利用葡聚糖凝膠Sephadex G-200進一步分離得到了APs-2-1、APs-3-1、APs-3-2三種均一多糖；利用苯酚-硫酸法測得三種均一多糖中的總糖含量分別為91.26%、90.23%、88.63%，利用硫酸-咔唑法測得三部分多糖糖醛酸的含量分別為16.20%、27.20%、6.90%；同時還對所分離的三種均一多糖的總抗氧化能力(FRAP值)及對羥基自由基、DPPH自由基的清除能力進行測定，結果表明所分離的三種多糖及狗棗獼猴桃葉多糖均具有一定的抗氧化能力，但是抗氧化能力均低于Vc。

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Study on Separation and Purification and Antioxidant Activity of Polysaccharides From the Leaves of Actinidia Kolomikta(Rupr. et Maxim. ) Planch

CHANG Qing-quan, YANG Zong-yi ,CHU You-qing, WANG Yan-li, WU Yang-wu, YUAN Rong, LU Yan, LU Juan

(Faculty of Chemistry,Changchun Normal University, Changchun Jilin 130032, China)

In this paper, the polysaccharides were separated and purified to obtain three homogeneous polysaccharides. And the total sugar and uronic acid of the three homogeneous polysaccharides were determined. The total sugar was separated using DEAE-Sepharose Fast Flow and Sephadex G-200 column, and to gain three homogeneous polysaccharides, named APs-2-1, APs-3-1, APs-3-2. The total sugar contents of the three homogeneous polysaccharides were 91.26%，90.23% and 88.63% by phenol - sulfuric acid method. The uronic acid content were 16.20%, 27.20% and 6.90% by sulfuric - carbazole method. The antioxidant activity of total sugar and the three homogeneous polysaccharides were measured according total antioxidant capacity (FRAP) and the hydroxyl free radical scavenging capacity and DPPH radical scavenging.The experimental results showed that the separation of three homogeneous polysaccharides and total polysaccharide had certain antioxidant capacity, but lower than that of Vc.

leaves of Actinidia kolomikta(Rupr. et Maxim.)Planch; polysaccharides; separation and purification; antioxidant activity

2016-10-12

2016-2017年度吉林省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目“長白山產(chǎn)狗棗獼猴桃葉多糖的制備、表征及抗氧化活性研究”(201610205057)。

常清泉(1995- )，女，碩士研究生，從事天然有機化合物研究。

陸 娟(1982- )，女，副教授，碩士生導師，博士，從事天然有機化合物研究。

Q946-33

A

2095-7602(2017)02-0049-06