凝膠電泳分離-液相色譜-質(zhì)譜法分析林蛙油及其偽品中的特異性蛋白

林 燕，徐 蕾，李重九，馬曉東

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100193)

凝膠電泳分離-液相色譜-質(zhì)譜法分析林蛙油及其偽品中的特異性蛋白

林 燕，徐 蕾，李重九，馬曉東

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100193)

本研究應(yīng)用凝膠電泳分離、蛋白酶酶解、納升液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等技術(shù)，建立了林蛙油及偽品青蛙輸卵管、牛蛙卵巢、牛蛙輸卵管和明太魚輸卵管中特異性蛋白的鑒定方法。根據(jù)定性肽段數(shù)量、肽段的響應(yīng)高低，蛋白在電泳圖譜中條帶位置的特異性等因素綜合判斷，篩選出林蛙油及其相關(guān)偽品的特異性蛋白，通過對(duì)特異性蛋白的分析測(cè)定，判斷樣品的真?zhèn)巍２捎迷摲椒▽?duì)市場(chǎng)上的4種林蛙油產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，通過分析特異性蛋白，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的樣品均為林蛙油偽品。研究結(jié)果表明，利用凝膠電泳分離液相色譜質(zhì)譜法構(gòu)建的特異性蛋白識(shí)別技術(shù)可以有效檢測(cè)林蛙油產(chǎn)品的真?zhèn)巍?/p>

林蛙油；凝膠電泳分離；液相色譜-質(zhì)譜；特異性蛋白

中國(guó)林蛙(RanatemporariachensinensisDavid) 屬蛙科動(dòng)物，民間俗稱哈士蟆、黃蛤蟆等，《本草圖經(jīng)》和《本草綱目》中所記載的“山蛤”即為林蛙。中國(guó)林蛙主要生長(zhǎng)在長(zhǎng)白山山脈，全身可入藥，特別是林蛙油，更以稀少而珍貴。林蛙油(Oviductusranae)又稱為蛤蟆油、田雞油、雪蛤，來源于中國(guó)林蛙雌蛙的干燥輸卵管?，F(xiàn)代研究表明，林蛙油主要含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、激素和維生素等成分，不僅具有抗衰駐顏的神奇功效，還具有抗疲勞、降血脂、提高機(jī)體免疫功能和增強(qiáng)應(yīng)激性等作用，是一種兼具藥用、食補(bǔ)和美容的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)品[1-7]。

近些年，由于森林資源的過度利用，中國(guó)林蛙的生存環(huán)境遭到破壞，然而市場(chǎng)上對(duì)于林蛙油的需求越來越大，致使林蛙油偽品大量出現(xiàn)。常見的林蛙油偽品以牛蛙輸卵管、牛蛙卵巢、青蛙卵巢和明太魚輸卵管等制成。中國(guó)林蛙油的傳統(tǒng)鑒定方法可參見《中國(guó)藥典》林蛙油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，主要包括樣品基源、膨脹度、顯微結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等，一般用于鑒定未經(jīng)加工的林蛙油干品，難以鑒定深度加工后失去原始形狀或改變理化性質(zhì)的加工品，無法控制林蛙油的質(zhì)量[8-9]。所以，亟待開發(fā)準(zhǔn)確、快速、可靠的檢測(cè)方法用于林蛙油及其制品的真?zhèn)舞b定。

質(zhì)譜技術(shù)憑借高靈敏度、高通量等特點(diǎn)在蛋白質(zhì)檢測(cè)及鑒定方面得到快速發(fā)展，現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)和生物大分子研究領(lǐng)域的重要分析技術(shù)[10-18]。林蛙油作為動(dòng)物源產(chǎn)品，富含蛋白質(zhì)，但是目前尚無林蛙油特異性蛋白的研究報(bào)道。

本研究以林蛙油(即林蛙輸卵管組織)為材料，將蛋白提取后分離純化，酶解后進(jìn)行質(zhì)譜分析。同時(shí)，對(duì)林蛙油相關(guān)偽品牛蛙輸卵管、牛蛙卵巢、青蛙卵巢和明太魚輸卵管組織中的蛋白進(jìn)行分析，并與林蛙油中的蛋白進(jìn)行比較，確定每種樣品的特異性蛋白。通過對(duì)市場(chǎng)上林蛙油產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，找出其中的特異性蛋白，研究以林蛙油中特異性蛋白作為真?zhèn)舞b別的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Ultimate 3000 RSLCnano 納升液相色譜儀，配有Nanospray Flex納噴離子源(NSI)，LTQ XL質(zhì)譜儀，美國(guó) Thermo公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物儀器公司產(chǎn)品；MIKRO 220R型高速冷凍離心機(jī)：Hettich Zentrifugen公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇、胰蛋白酶：美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；三氟乙酸、吲哚-3-乙酸、PBS(pH 7.5)、SDS-PAGE上樣緩沖液、蛋白Marker：北京康為試劑生物科技有限公司產(chǎn)品；丙酮、尿素、NH4HCO3、醋酸、乙腈、甲酸：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

林蛙油樣品：2013年10月采自吉林省長(zhǎng)白山市，于-80 ℃保存，備用；青蛙輸卵管、牛蛙輸卵管、牛蛙卵巢樣品：2013年11月采自廣東省東莞市，于-80 ℃保存，備用；明太魚輸卵管樣品：2013年12月采自遼寧省大連市，于-80 ℃保存，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 細(xì)胞破碎及蛋白提取(TCA 丙酮沉淀法)

將動(dòng)物組織用 PBS沖洗后置于研缽中，液氮條件下研磨樣品至粉末，加入裂解液后制成組織懸濁液，冰上孵育30 min。超聲裂解組織懸濁液，功率300 W，間隔2 s超聲2 s，共計(jì)有效超聲時(shí)間3 min；然后于4 ℃以10 000 r/min離心30 min，將蛋白提取液加入-20 ℃預(yù)冷丙酮中，混勻后于-20 ℃沉淀過夜，最后去除丙酮溶液，向沉淀中加入8 mol/L Urea渦旋溶解，備用。

1.3.2 SDS-PAGE電泳 將1.3.1節(jié)得到的溶液和5倍上樣緩沖液按1∶4比例混合，置于EP管中；水浴加熱，95 ℃保持2 min，冷卻后以10 000 r/min離心20 min。

將分離得到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE膠分離，其濃縮膠12%，分離膠5%。電泳經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，保存于含有5%醋酸溶液的培養(yǎng)皿中。

1.3.3 蛋白酶解 按照分子質(zhì)量將凝膠蛋白條帶切成若干塊，切下的膠塊放入EP管中，用50 mmol/L NH4HCO3溶液和乙腈脫色后，加乙腈脫水至膠塊完全變白，氮?dú)獯蹈伞Ｏ驑悠分屑尤?0 μL 10 mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)，56 ℃水浴恒溫1 h；冷卻后加入80 μL 55 mmol/L IAM(碘乙酰胺)，置于黑暗處，室溫保持45 min；用25 mmol/L NH4HCO3溶液清洗樣品后，氮?dú)獯蹈?。加入Trypsin酶液進(jìn)行酶解，然后加入25 mmol/L NH4HCO3溶液，37 ℃水浴過夜(8～12 h)；最后加入2%甲酸溶液終止反應(yīng)，取上清液，備用。

1.3.4 質(zhì)譜分析 樣品經(jīng)反相高效液相色譜C18柱(75 μm×15 mm×2 μm) 分離后，進(jìn)入LTQ XL 系統(tǒng)分析。樣品在反相柱上的洗脫梯度是2%～40%乙腈(含0.1%甲酸)，洗脫時(shí)間43 min，流速300 nL/min。

質(zhì)譜參數(shù)：離子傳輸線溫度350 ℃；電噴霧電壓1.85 kV；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z350～1 800，從中選取信號(hào)最強(qiáng)的10個(gè)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析；CID碰撞能量35 eV。

1.3.5 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 將質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Thermo Proteome Discoverer1.4軟件進(jìn)行分析處理，采用氧化、磷酸化和加脲甲基基團(tuán)修飾蛋白，檢索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(數(shù)據(jù)庫(kù)名稱uniprot-organism-frog.fasta和uniprot-Theragra+chalcogramma.fasta)，得到相應(yīng)的蛋白信息。分析蛋白覆蓋率、肽段以及保留時(shí)間，并在http:∥www. uniprot.org/網(wǎng)站上檢索蛋白名稱及功能。

1.3.6 市場(chǎng)上林蛙油產(chǎn)品真?zhèn)蔚蔫b定 分別提取不同廠家林蛙油樣品中的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行凝膠電泳分離、液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)。得到的結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)分析檢索，與林蛙油及其偽品的特異性蛋白分析比對(duì)，判定樣品的來源及真?zhèn)巍?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE電泳

樣品組織的蛋白提取液SDS-PAGE電泳譜圖示于圖1。可以看出，林蛙油與青蛙輸卵管、牛蛙卵巢、牛蛙輸卵管及明太魚輸卵管樣品的蛋白條帶分布存在明顯區(qū)別。

注：條帶1—marker、2—林蛙輸卵管(林蛙油)、3—青蛙輸卵管、4—牛蛙卵巢、5—牛蛙輸卵管、6—明太魚輸卵管；marker左側(cè)為條帶對(duì)應(yīng)蛋白大小(kDa)圖1 林蛙油及部分代表性偽品的電泳譜圖Fig.1 SDS-PAGE of protein from Oviductus ranae and its adulterants

市場(chǎng)樣品一般經(jīng)過深度加工，可能有兩種或兩種以上樣品同時(shí)存在，所以電泳圖譜不能作為判定林蛙油樣品真?zhèn)蔚囊罁?jù)，只能作為質(zhì)譜檢測(cè)的預(yù)分離。

2.2 林蛙油及其相關(guān)偽品的蛋白質(zhì)譜分析

將凝膠分為3個(gè)區(qū)域：175～42 kDa(編號(hào)1)、42～22 kDa(編號(hào)2)、22～10.5 kDa(編號(hào)3)。將樣品切膠、脫色、二硫鍵還原和烷基化后，用Trypsin 酶酶解，多肽溶液經(jīng)納升液相色譜-質(zhì)譜儀分析。

原始數(shù)據(jù)文件采用Thermo Proteome Discoverer 1.4軟件搜索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，可得到蛋白或肽段有關(guān)信息。根據(jù)蛋白編碼分析蛋白，整合分析結(jié)果中的類型、覆蓋率、蛋白片段、保留時(shí)間、分子質(zhì)量等信息，經(jīng)檢索和樣品間的比對(duì)，林蛙油樣品、青蛙輸卵管樣品、牛蛙卵巢樣品、牛蛙輸卵管樣品和明太魚輸卵管樣品分別有38、115、96、105和14個(gè)差異蛋白。

2.3 林蛙油與其偽品的差異蛋白分析

根據(jù)2.2節(jié)對(duì)林蛙油及其偽品的蛋白分析結(jié)果，取覆蓋率較高的前10個(gè)差異蛋白，肽段置信度為中等(FDR<=0.05)，每個(gè)蛋白中最低特異性肽段數(shù)為1。根據(jù)分子質(zhì)量大小、肽段響應(yīng)情況以及保留時(shí)間，找出該蛋白所對(duì)應(yīng)的膠點(diǎn)位置，篩選出用于真?zhèn)舞b別的特異性蛋白，其結(jié)果列于表1。樣品總離子流色譜圖和代表性的定性肽段質(zhì)譜圖示于圖2～6。

從林蛙油中篩選出的特異性蛋白分布在電泳圖譜的42～22 kDa區(qū)間。因此，如果分析市場(chǎng)上的樣品是否含有林蛙油成分，只需將電泳膠條區(qū)域編號(hào)為2的部分進(jìn)行質(zhì)譜分析，尋找林蛙油的特異性蛋白即可。

表1 林蛙油及其相關(guān)偽品的特異性蛋白Table 1 Specific proteins in Ovidutus ranae and its adulterants

圖2 林蛙油樣品總離子流色譜圖(a)和特異性蛋白Q6DDC2的定性肽段GDLLFLTNFQEDPIR的二級(jí)質(zhì)譜圖(b)Fig.2 TIC of Oviductus ranae (a) and mass spectra of qualitative peptide GDLLFLTNFQEDPIR from the specific protein Q6DDC2 (b)

圖3 青蛙輸卵管樣品總離子流色譜圖(a)和特異性蛋白Q6DK74的定性肽段VTVVDVNEAR的二級(jí)質(zhì)譜圖(b)Fig.3 TIC of Rana nigromaculata fallopian tube (a) and mass spectra of qualitative peptide VTVVDVNEAR from the specific protein Q6DK74 (b)

圖4 牛蛙卵巢樣品總離子流色譜圖(a)和特異性蛋白F6QFQ2的定性肽段 LEVGMVGVNEGLLSSVECPFGGVK的二級(jí)質(zhì)譜圖(b)Fig.4 TIC of Rana catesbeiana ovary (a) and mass spectra of qualitative peptide LEVGMVGVNEGLLSSVECPFGGVK from the specific protein F6QFQ2 (b)

圖5 牛蛙輸卵管樣品總離子流色譜圖(a)和特異性蛋白Q5BKM2的定性肽段TIVALGSIAVTK的二級(jí)質(zhì)譜圖(b)Fig.5 TIC of Rana catesbeiana fallopian tube (a) and mass spectra of qualitative peptide TIVALGSIAVTK from the specific protein Q5BKM2 (b)

圖6 明太魚輸卵管樣品總離子流色譜圖(a)和特異性蛋白Q8AV86的定性肽段KLVIIESDLER的二級(jí)質(zhì)譜圖(b)Fig.6 TIC of Theragra chalcogramma fallopian tube (a) and mass spectra of qualitative peptide KLVIIESDLER from the specific protein Q8AV86 (b)

2.4 市場(chǎng)樣品的測(cè)定

對(duì)4種市場(chǎng)上的林蛙油產(chǎn)品進(jìn)行分析，產(chǎn)品信息列于表2。

表2 市場(chǎng)樣品信息Table 2 Information of market samples

對(duì)市場(chǎng)樣品進(jìn)行蛋白提取后，采用電泳分離法分析3個(gè)電泳膠條區(qū)域。通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析檢索和比對(duì)，市場(chǎng)樣品中所含的特異性蛋白情況列于表3。

表3 市場(chǎng)樣品中特異性蛋白檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of specific protein in the market samples

注：“√”表示樣品中檢出特異性蛋白；“×”表示樣品中未檢出特異性蛋白

經(jīng)分析，1號(hào)樣品為牛蛙輸卵管，2號(hào)和3號(hào)樣品為林蛙油和牛蛙輸卵管混合物，4號(hào)樣品為明太魚輸卵管。

3 結(jié)論

采用SDS-PAGE電泳分離、納升液相色譜-質(zhì)譜法分析林蛙油及其相關(guān)偽品的蛋白質(zhì)，根據(jù)定性肽段數(shù)量、肽段響應(yīng)高低、蛋白在電泳圖譜中條帶位置的特異性等因素，篩選出林蛙油及其相關(guān)偽品的特異性蛋白。通過對(duì)林蛙、青蛙和牛蛙生殖組織中的蛋白進(jìn)行生物質(zhì)譜分析，分別找出其中的特異性蛋白，并比對(duì)特異性蛋白檢測(cè)結(jié)果，該方法可以有效地判斷樣品的真?zhèn)巍?/p>

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Analysis of Specific Proteins inOviductusRanaeand its Adulterants by Gel Electrophoresis Coupled LC/MS

LIN Yan, XU Lei, LI Chong-jiu, MA Xiao-dong

(CollegeofScience,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

A method for the identification ofOviductusranaesamples was established by gel electrophoresis combined with nano liquid chromatography-mass spectrometry(LC/MS). The samples includingOviductusranae, Rana catesbeiana fallopian tube, Rana catesbeiana ovary, Rana nigromaculata ovary and walleye pollack fallopian tube were extracted by using the TCA acetone precipitation method. Comprehensive application of gel electrophoresis, enzymatic hydrolysis, nano liquid chromatography, series spectrum detection and database retrieval technology were carried on the analysis to the proteins ofOviductusranae. At the same time, the proteins of market samples were analyzed using the same method and compared with the proteins inOviductusranae. The results show that the specific protein bands distribution ofOviductusranaeand the counterfeits are different, so the authenticity ofOviductusranaesamples is able to be detected by the comparation of the specific protein bands. The method is reliable for the recognition of specific proteins inOviductusranae.

Oviductusranae; gel electrophoresis; liquid chromatography-mass spectrometry; specific proteins

2016-03-09;

2016-07-06

科技部支撐計(jì)劃《功能食品質(zhì)量安全保障技術(shù)研究》(2012BAD33B02)資助

林 燕(1974—)，女(漢族)，福建人，副研究員，從事分析化學(xué)研究。E-mail: linyan@cau.edu.cn

馬曉東(1975—)，男(漢族)，山西人，副教授，從事分析化學(xué)研究。E-mail: dongxm@cau.edu.cn

時(shí)間：2016-12-28；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20161228.0937.030.html

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0227-07

10.7538/zpxb.youxian.2016.0068