MALDI-TOF MS磷脂質(zhì)組學(xué)快速分析三文魚肌肉組織

沈 清，馮俊麗，金仁耀，薛 靜，鄭振霄，戴志遠(yuǎn)

(浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012)

MALDI-TOF MS磷脂質(zhì)組學(xué)快速分析三文魚肌肉組織

沈 清，馮俊麗，金仁耀，薛 靜，鄭振霄，戴志遠(yuǎn)

(浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012)

建立了基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)快速分析三文魚肌肉組織磷脂質(zhì)組學(xué)的方法。以非自然磷脂酰膽堿DMPC(14∶0/14∶0)和磷脂酰乙醇胺DPPE(15∶0/15∶0)為標(biāo)準(zhǔn)品，分析其在正離子模式下的主要分子峰與干擾峰，并進(jìn)行方法學(xué)驗證。實驗結(jié)果表明，各化合物平均加標(biāo)回收率在74%～83%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%，日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于8.5%。將三文魚磷脂提取物進(jìn)樣分析，共鑒定出28種磷脂分子 ，其中m/z806.40([PC38:6+H]+和[PE38:4+K]+)信號最強(qiáng)。三文魚中多不飽和磷脂種類豐富，如m/z824.38([PC38:8+Na]+和[PE42:5+H]+)，m/z832.41([PC40:7+H]+，[PC38:4+Na]+和[PE40:5+H]+)，部分磷脂分子的脂肪酸鏈達(dá)到了滿不飽和，如[PC42:11+H]+，其sn-1和sn-2上兩條脂肪酸鏈分別為二十碳五烯酸鏈(EPA-)和二十二碳六烯酸鏈(DHA-)。該方法穩(wěn)定可靠，可用于鑒定三文魚肌肉組織中的磷脂分子結(jié)構(gòu)，并從脂質(zhì)組學(xué)角度為三文魚營養(yǎng)評價提供理論依據(jù)。

三文魚；脂質(zhì)組學(xué)；基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)；磷脂

三文魚是生長在挪威、美國和加拿大等高緯度地區(qū)的鮭科魚類，屬冷水性洄游魚類，其肉色一般呈紅色或橘色，肉質(zhì)細(xì)嫩、口感鮮美，是魚類中的珍品。三文魚富含脂溶性維他命A、維他命D以及水溶性維他命B12和維他命B6，是ω-3不飽和脂肪酸的重要來源，其蛋白質(zhì)含量高，膽固醇和熱量含量低，是營養(yǎng)價值較高的高檔水產(chǎn)品之一[1]。三文魚具有較高的食用價值和保健價值，能有效防治心腦血管、糖尿病等疾病，具有緩解血管炎癥和安撫神經(jīng)的功效[2]。目前，對于三文魚脂類的研究主要集中在小分子脂肪酸[3]，而分子水平磷脂質(zhì)組學(xué)研究則尚未見報道。

脂質(zhì)組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后又一迅速發(fā)展的學(xué)科，研究內(nèi)容包括生物體內(nèi)脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)鑒定與定量，以及其在生物代謝、疾病、免疫等過程中所扮演的角色分析。自Han等[4]首次提出脂質(zhì)組學(xué)這一概念以來，脂質(zhì)組學(xué)于近幾年迅猛發(fā)展，并得到了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。然而，目前關(guān)于脂質(zhì)組學(xué)的研究主要集中在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而在食品脂質(zhì)組學(xué)的研究報道較少。Dasila等[5]采用脂質(zhì)組學(xué)分析了食物中EPA和DHA含量比值對代謝綜合征的影響；Kim等[6]發(fā)現(xiàn)用磷脂標(biāo)記物可區(qū)分人參不同種類、年份和部位；Shen等[7]用殼核材料提取并用親水色譜從蝦中分析得到了大量多不飽和磷脂。

脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展得益于近幾年分析技術(shù)的進(jìn)步，如高效液相色譜(HPLC)、核磁共振波譜(NMR)、熒光光譜(FLR)、串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)、基質(zhì)輔助激光解析電離(MALDI)成像技術(shù)等。其中質(zhì)譜已經(jīng)成為當(dāng)前脂質(zhì)組學(xué)研究的主流技術(shù)手段，主要分析方法是采用三重四極桿質(zhì)譜(QqQ)、四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Q-TOF)、飛行時間-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(TOF-TOF)、靜電場軌道阱質(zhì)譜(Orbitrap)等檢測器，配以電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)等離子源。不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜在檢測靈敏度和工作效率方面各有優(yōu)缺點，如QqQ在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的定量能力強(qiáng)，但分辨率較低，且檢測分子質(zhì)量上限約為2 000 u；而TOF-TOF分離能力更高，適合分析大分子蛋白，但定量能力稍弱[8-9]?；|(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)最早用于蛋白質(zhì)、糖類及核酸等分析，已被證實是一種快速有效的分析手段，每個樣品的分析可以控制在幾秒鐘以內(nèi)。Shen等[10-12]建立了MALDI-TOF MS快速分析橄欖、杏仁、牛油果的脂質(zhì)組學(xué)方法。

在水產(chǎn)品科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)開展脂質(zhì)組學(xué)的研究不僅對水產(chǎn)品的高效綜合利用有重要意義，還可以為水產(chǎn)品鑒偽、溯源、污染監(jiān)測等提供科學(xué)依據(jù)，但我國脂質(zhì)組學(xué)研究尚屬初級階段。因此，本研究擬采用MALDI-TOF MS法快速分析三文魚肌肉組織中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的分子種類，并根據(jù)磷脂脂肪酸鏈長度與不飽和度對三文魚進(jìn)行營養(yǎng)評價。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

AB4800串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有基質(zhì)輔助激光解吸離子源、200 Hz三倍頻Nd:YAG脈沖355 nm激光及4000 Series Explorer數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

磷脂酰膽堿(DMPC，14∶0/14∶0)和磷脂酰乙醇胺(DPPE，15∶0/15∶0)標(biāo)準(zhǔn)品：美國Avanti公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈及甲酸：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；2,5-二羥基苯甲酸(DHB)：質(zhì)譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；挪威三文魚樣品：購自杭州物美超市，新鮮度佳。

分別準(zhǔn)確稱取0.01 g DMPC和DPPE標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇-氯仿溶液(1∶1,V/V)溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，分別配制成1.0 g/L儲備液，于4～6 ℃冷藏，備用；稱取30 mg DHB，溶解于70%甲醇水溶液中，并定容至1 mL，備用。

1.3 樣品處理

取0.1 g均質(zhì)后的三文魚肌肉組織樣品于5 mL離心管中，加入1.75 mL氯仿-甲醇溶液(1∶2，V/V)，振蕩混勻。于探頭式超聲(25 kHz，60%變幅)冰浴中提取10 min，然后向離心管中加入1.25 mL純水，振蕩混勻。混合物用冷凍離心機(jī)以8 000 r/min離心15 min，待離心管內(nèi)溶液上下分層，三文魚肌肉組織樣品則呈餅狀居于兩相中間。用200 μL移液槍將下相溶液轉(zhuǎn)移到另一新的移液管中，繼續(xù)向上相和樣品中加入2 mL氯仿，重復(fù)上述操作2次。合并3次提取的有機(jī)相，氮?dú)獾蜏卮蹈?，甲醇水溶液?fù)溶。

分別將100 μL磷脂提取液和100 μL DHB基質(zhì)加入到1.5 mL離心管中，振蕩混勻后靜置；將0.5 μL溶液點在MALDI點樣板上，于空氣中干燥結(jié)晶后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4 質(zhì)譜條件

正離子反射模式，加速電壓20 kV，離子萃取時間延遲450 ns，質(zhì)量掃描范圍m/z450～950，激光能量調(diào)整至高于建議閾值的5%～10%。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用4000 Series Explorer v3.5.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所有譜圖均經(jīng)同位素校正，以確保微量磷脂的離子峰不受其他高濃度磷脂離子峰干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷脂提取條件的優(yōu)化

脂質(zhì)的有效提取是影響脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果的重要因素之一。由于磷脂極性官能團(tuán)的作用導(dǎo)致親水性較強(qiáng)，實驗分別采用Bligh&Dyer，F(xiàn)olch和Nicols方法從三文魚脂質(zhì)粗提物中提取磷脂。其中，Bligh&Dyer法的提取效率相對較高，達(dá)78%，且實驗結(jié)果較為穩(wěn)定；Folch法的提取效率相對較低，為60%，這可能是在提取過程中形成了乳濁液，導(dǎo)致分離過程不可控；Nicol法采用異丙醇作為提取液，盡管提取率達(dá)到82%，但是結(jié)果的穩(wěn)定性較差，相對偏差大于10%。因此，本實驗選取Bligh&Dyer法提取三文魚肌肉組織中磷脂。

2.2 磷脂離子化分析

MALDI離子源用于小分子化合物檢測時，離子峰成分較為復(fù)雜，這給后期數(shù)據(jù)解析造成一定的困難。因此，分析磷脂在激光誘導(dǎo)下的離子化規(guī)律有利于對復(fù)雜磷脂進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。在負(fù)離子模式下，磷脂酰膽堿(PC)極易失去[CH3]生成[PC-15]-，該產(chǎn)物易與磷脂酰乙醇胺[PE-H]-發(fā)生質(zhì)譜峰重疊，從而影響后期磷脂結(jié)構(gòu)解析，故實驗采用正離子模式。對DMPC和DPPE進(jìn)行離子化規(guī)律分析的結(jié)果示于圖1?？梢?，DMPC在正離子模式下的質(zhì)譜圖較為干凈，加氫峰[M+H]+信號最強(qiáng)，其次為加鈉峰[M+Na]+；DPPE質(zhì)譜圖則相對較為復(fù)雜，[M+Na]+信號最強(qiáng)，[M+H]+次之，此外還有[M+K]+、[M+2Na-H]+、[M+Na+K-H]+等加合峰。因較多的加合峰不利于譜圖解析，在分析三文魚樣品時，應(yīng)排除[PC+Na]+和PE多加合峰的假陽性干擾。

2.3 方法學(xué)驗證

分別取6份預(yù)處理后的空白樣品，添加高、中、低3個水平的DMPC和DPPE標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)水平做6次平行實驗，計算方法的日內(nèi)精密度和回收率；連續(xù)測定5天，計算日間精密度，結(jié)果列于表1。結(jié)果表明，各化合物的平均加標(biāo)回收率在74%～83%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%，日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過8.5%。

圖1 正離子模式下，磷脂酰膽堿(a)和磷脂酰乙醇胺(b)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of the standards of DMPC (a) and DPPE (b) in positiveion mode

表1 基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜磷脂質(zhì)組學(xué)方法的精密度與回收率
Table 1 Precisions and recoveries of MALDI MS based phospholipidomics method

化合物添加濃度/(mg/L)日內(nèi)精密度均值RSD/%日間精密度RSD/%回收率/%均值RSDDMPC21.84.97.3835.154.65.87.9796.3109.26.18.5746.9DPPE2.52.44.56.9814.954.76.17.7776.8109.36.98.1766.7

2.4 三文魚磷脂檢測

將三文魚磷脂提取物進(jìn)樣分析，其質(zhì)譜圖示于圖2。根據(jù)偶氮規(guī)則，PC和PE的質(zhì)荷比為偶數(shù)，由此可初步判斷磷脂峰主要分布在m/z750～900區(qū)域，而m/z500～600區(qū)域主要為溶血性磷脂酰膽堿(LPC)，如m/z518.20、542.2、580.23分別為[LPC18:3+H]+、[LPC20:5+H]+和[LPC22:0+H]+。溶血性磷脂是磷脂被磷脂酶A水解生成的一種化合物，其含量變化通常與某些代謝疾病相關(guān)。磷脂是三文魚的主要極性脂類，由Lipids_MS_Predictor共鑒定出28種磷脂分子，其中信號最強(qiáng)的是m/z806.40；經(jīng)MS2檢測到其PC特征峰m/z184，碎片峰m/z623.4([M+H-183]+)和m/z627.4([M+H-141]+)，其中m/z183為膽堿，m/z141為乙醇胺，故推斷離子峰m/z806.40是[PC38:6+H]+和[PE38:4+K]+的重疊。實驗還發(fā)現(xiàn)，三文魚中高不飽和磷脂種類豐富，如m/z824.38([PC38:8+Na]+和[PE42:5+H]+)、m/z832.41([PC40:7+H]+，[PC38:4+Na]+和[PE40:5+H]+)等。部分磷脂分子甚至達(dá)到了滿不飽和度，如[PC42:11+H]+，其sn-1和sn-2上兩條脂肪酸鏈分別為二十碳五烯酸鏈(EPA-)和二十二碳六烯酸鏈(DHA-)。

影響化合物離子化效率的主要因素是基團(tuán)的偶極矩，磷脂的偶極矩主要存在于極性頭，而兩條脂肪酸鏈幾乎不含偶極矩，同一類磷脂的離子化強(qiáng)度只受其濃度影響，而碳鏈長度與不飽和度的影響幾乎可以忽略。因此，采用歸一化法以DMPC對所有PC磷脂分子和以DPPE對所有PE磷脂分子進(jìn)行定量分析，結(jié)果列于表2?？梢姡琺/z806.40([PC38:6+H]+和[PE38:4+K]+)的總量占20%以上，m/z826.41、852.38、856.40和878.39雙鏈均為EPA鏈或DHA鏈的磷脂占12.38%。實驗結(jié)果表明，三文魚磷脂種類豐富，多不飽和磷脂含量較高。

圖2 正離子模式下，三文魚肌肉組織脂質(zhì)提取物的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of the phospholipids extracted from salmon muscle in positive ion mode

表2 三文魚中主要磷脂及其豐度
Table 2 Molecular species and contents of phospholipids in salmon

m/z化學(xué)結(jié)構(gòu)豐度m/z化學(xué)結(jié)構(gòu)豐度754.39[PC34:4+H]+0.79804.39[PC38:7+H]+,[PC36:4+Na]+,[PE38:5+K]+3.42756.40[PC34:3+H]+1.05806.40[PC38:6+H]+,[PE38:4+K]+20.95758.39[PC34:2+H]+1.04808.42[PC38:5+H]+,[PC36:2+Na]+,[PE38:3+K]+2.21760.43[PC34:1+H]+,[PE36:5+Na]+4.50814.40[PC38:2+H]+,[PE40:6+Na]+,1.33766.41[PE38:5+H]+,[PE36:2+Na]+1.77818.41[PC38:0+H]+,[PE42:7+H]+,[PE40:4+Na]+1.07768.40[PE38:4+H]+,[PE36:1+Na]+2.32824.40[PC38:8+Na]+,[PE42:5+H]+0.79780.39[PC36:5+H]+,[PC34:2+Na]+7.90826.41[PC40:10+H]+,[PC38:7+Na]+,[PE42:3+H]+2.33782.40[PC36:4+H]+,[PC34:1+Na]+,[PE36:2+K]+3.76828.38[PC40:9+H]+,[PC38:6+Na]+,[PE42:2+H]+5.71784.40[PC36:3+H]+,[PC34:0+Na]+,[PE36:1+K]+1.46830.41[PC40:8+H]+,[PC38:5+Na]+,[PE42:1+H]+2.57786.41[PC36:2+H]+,[PE38:6+Na]+,[PE36:0+K]+1.64832.42[PC40:7+H]+,[PC38:4+Na]+,[PE40:5+H]+5.41792.43[PE40:6+H]+,[PE38:3+Na]+,[PC34:4+K]+8.50834.44[PC40:6+H]+,[PC38:3+Na]+,[PE40:4+H]+0.62794.40[PE40:5+H]+,PE38:2+Na]+,[PC34:3+K]+1.50852.38[PC42:11+H]+,[PC40:8+Na]+,[PE42:9+K]+5.22800.41[PC36:6+Na]+,[PE38:7+K]+0.97856.40[PC42:10+H]+,[PC40:7+Na]+,[PE42:8+K]+2.00802.40[PC38:8+H]+,[PC36:5+Na]+,[PE38:6+K]+2.78878.39[PC44:12+H]+,[PC42:9+Na]+,[PE44:10+K]+2.83

3 結(jié)論

本研究建立了MALDI-TOF MS分析三文魚肌肉組織磷脂質(zhì)組學(xué)的方法。結(jié)果表明，各化合物的平均加標(biāo)回收率在74%～83%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%，日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過8.5%，該方法穩(wěn)定可靠，可快速分析三文魚中磷脂組成輪廓。實驗鑒定了脂質(zhì)提取物中28種磷脂分子，結(jié)果顯示，三文魚中多不飽和磷脂的種類豐富，含量較高，可作為人體攝取多不飽和脂質(zhì)的重要來源。

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Phospholipidomics Profiling of Salmon Muscle by MALDI-TOF MS

SHEN Qing, FENG Jun-li, JIN Ren-yao, XUE Jing, ZHENG Zhen-xiao, DAI Zhi-yuan

(InstituteofSeafood,ZhejiangGongshangUniversity,Hangzhou310012,China)

Phospholipids are considered as nutrients with putative health benefits, which play critical roles in lipid digestion, transport, inflammatory processes and signaling pathways. As to the nutritive value for human body, salmon contains abundant components of polyunsaturated fatty acyl phospholipids, and it has the beneficial function of lowering the blood fat and cholesterol, reducing the risk of cardiovascular disease. However, lipidomics study of salmon is still missing due to the lack of efficient specific analytical method. In this study, a fast lipidomics method of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) was developed for the analysis of phospholipids from salmon muscle tissue. In brief, 0.1 g salmon sample was accurately weighted, placed in 5 mL polytetrafluoroethylene tube, and mixed with 1.75 mL of chloroform/methanol (2∶1,V/V) solution. After ultrasonic assisted extracting for 10 min, a potion of 1.25 mL water was added and the tube was centrifuged at 8 000 g for 15 min in order to separate the solvent phase. Then, the lower organic phase was recovered and transferred to a new glass tube by pipette. The aqueous phase was re-extracted with 2 mL chloroform for another two times and treated as described before. The collected organic phase were combined and evaporated under nitrogen flow. The sample spots under investigation was directly analyzed using MALDI-TOF MS in positive ion reflection mode at an accelerating potential of 20 kV, with a delayed ion extraction time of 450 ns according to the mass range under observation (m/z450-1 000) allowing for baseline isotopic mass resolution. The unnaturally occurred DMPC (14∶0/14∶0) and DPPE (15∶0/15∶0) were selected as standards for studying their ions in positive ion mode. The method was validated in terms of precision and recovery, and it was found that the recoveries of DMPC and DPPE were in the range of 74%-83%, and relative standard derivation (RSD) was lower than 7%. The RSDs of intra-day and inter-day precision were both lower than 8.5%. After analyzing the lipid extract of salmon, a total of 28 phospholipid molecular species was identified, among which the peak atm/z806.40 ([PC38:6+H]+and [PE38:4+K]+) showed the highest abundance. There is a variety of polyunsaturated phospholipids in salmon, for examples, the peak atm/z824.38 ([PC38:8+Na]+and [PE42:5+H]+),m/z832.41 ([PC40:7+H]+, [PC38:4+Na]+and [PE40:5+H]+). Part of the phospholipids were fully unsaturated, for example, the [PC42:11+H]+was composed with eicosapentaenoic acyl chain (EPA-) and docosahexaenoic acyl chain (DHA-) at sn-1 and sn-2 position, respectively. The method is precise and robust, which can provide theoretical support for the nutritional study of salmon in view of lipidomics.

salmon; lipidomics; matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS); phospholipids

2016-04-13;

2016-07-22

國家自然科學(xué)青年基金(31601542)；國家國際科技合作專項(2014DFA32880)；浙江省自然科學(xué)基金(LQ16C200001)；浙江工商大學(xué)高等教育研究課題(xgy16075)資助

沈 清(1986—)，男(漢族)，浙江杭州人，博士研究生，從事水產(chǎn)品加工與貯藏研究。E-mail: leonqshen@163.com

戴志遠(yuǎn)(1958—)，男(漢族)，浙江杭州人，研究員，從事水產(chǎn)品加工與貯藏研究。E-mail: dzy@zjgsu.edu.cn

時間：2016-12-28；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20161228.0937.026.html

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0211-06

10.7538/zpxb.youxian.2016.0071