陳 靜,崔寶弟,孫震曉
(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102)
去甲斑蝥素作用早期對人肝癌細(xì)胞活性氧及NF-E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件信號通路的激活
陳 靜*,崔寶弟*,孫震曉
(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102)
目的探究去甲斑螯素(NCTD)誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及G2/M期阻滯的早期事件,分析NCTD作用早期HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)的變化規(guī)律及NCTD對NF-E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2/ARE)信號通路的影響。方法NCTD30,60和120 μmol·L-1分別作用于體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞3,6,12,24,48和72 h,MTT法檢測NCTD對細(xì)胞存活的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測NCTD 60 μmol·L-1作用細(xì)胞12,24和48 h對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響;DCFH-DA探針結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測NCTD 30,60和120 μmol·L-1作用于3,6和12 h對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響;熒光素酶法測定NCTD同時轉(zhuǎn)染ARE和熒光素酶報告基因的HepG2C8細(xì)胞的熒光強度;實時熒光定量PCR檢測對血紅素氧合酶-1(HO-1)和醌氧化還原酶-1(NQO1)mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果NCTD 30,60和120 μmol·L-1作用3和6 h對HepG2細(xì)胞存活無明顯影響,而作用24,48和72 h對HepG2細(xì)胞有明顯生長抑制作用(P<0.01);NCTD 60 μmol·L-1作用12 h后可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡及G2/M期阻滯,12,24和48 h凋亡細(xì)胞比例分別由12 h細(xì)胞對照組(4.00±1.98)%增加到(12.10±1.70)%,24 h對照組(4.05±0.21)%增加到(31.80± 6.50)%,48 h對照組(3.90±0.85)%增加到(33.30±1.41)%;12,24和48 h G2/M期細(xì)胞比例分別由12 h對照組的(16.51±1.58)%增加到(40.89±0.18)%,24 h對照組的(16.99±1.32)%增加到(55.29±3.99)%,48 h對照組的(14.45±0.59)%增加到(50.66±5.88)%,相應(yīng)各時相NCTD處理組G1期細(xì)胞比例明顯下降(P<0.01);NCTD 30,60和120 μmol·L-1作用HepG2細(xì)胞3,6和12 h,ROS無明顯變化,作用HepG2C8細(xì)胞6和12 h可明顯激活Nrf2/ARE信號通路,下游基因HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論NCTD作用HepG2細(xì)胞早期可明顯激活Nrf2/ARE信號通路;ROS激活可能不是NCTD誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及G2/M期阻滯的主要原因。
去甲斑蝥素;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞周期;Nrf2/ARE信號通路;活性氧自由基;血紅素加氧酶-1;NAD(P)H:醌氧化還原酶-1
去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是我國自主研發(fā)的一種新型抗腫瘤藥物,兼有抗腫瘤和升高外周血白細(xì)胞的作用,近年來主要用于消化道腫瘤和肺癌的治療,其中對肝癌的治療效果最好[1],也可與其他化療藥物聯(lián)用來提高療效、減少副作用[2]。盡管有關(guān)NCTD抗癌活性研究已經(jīng)有不少報道[3-8],但對其細(xì)胞毒作用的早期事件仍缺乏研究。
研究表明,高濃度活性氧(reactive oxygen species,ROS)或低濃度ROS長時間作用于細(xì)胞,均可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯[9]或細(xì)胞凋亡[10],而低濃度ROS短期作用可以引起細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,激活NF-E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(NF-E2-related factor 2/ antioxidant response element,Nrf2/ARE)信號通路[11],Nrf2/ARE信號通路在機體抵抗內(nèi)外氧化和化學(xué)刺激等方面均發(fā)揮重要作用。本研究主要在NCTD體外作用人肝癌HepG2細(xì)胞的時效、量效關(guān)系基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索NCTD對細(xì)胞內(nèi)ROS及細(xì)胞氧化應(yīng)激信號通路Nrf2/ARE的影響,進(jìn)一步揭示NCTD的抗癌機制。
1.1 試劑和藥品
1640培養(yǎng)基,胎牛血清,MEM非必需氨基酸購自美國Gibco公司;Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司;無RNA酶水購自美國AMERESCO公司;PrimeScriptTM1ststrand cDNA Synthesis試劑盒購自日本TaKaRa公司;PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;RNA酶抑制劑購自美國Promega公司;DCFH-DA探針購自美國Sigma公司。
1.2 主要儀器
低溫高速臺式離心機購自美國Kendro儀器公司,小動物活體成像儀購自美國Caliper公司,熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購自日本Bio-Rad公司,流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司,微量RNA濃度檢測儀購自美國Biotek公司。
1.3 細(xì)胞系
人肝癌HepG2細(xì)胞,北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥實驗室凍存;HepG2C8細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了抗氧化元件ARE和熒光素酶基因的HepG2細(xì)胞,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部余四旺老師惠贈。
1.4 細(xì)胞培養(yǎng)
HepG2細(xì)胞用含10%(V/V)胎牛血清,1%雙抗(青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1)的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d換液傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞為實驗對象。HepG2C8細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[12-13],用含10%(V/V)胎牛血清,1%雙抗,1% MEM非必需氨基酸的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d換液傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞為實驗對象。
1.5 MTT法檢測細(xì)胞存活
將HepG2細(xì)胞以每孔2×103的密度鋪于96孔板中,培養(yǎng)24 h后用NCTD 30,60和120 μmol·L-1處理。每個濃度設(shè)置8個平行孔,細(xì)胞對照組的孔內(nèi)加入正常培養(yǎng)基作為對照。分別于3,6,12,24,48和72 h加入終濃度為0.5 g·L-1的MTT繼續(xù)孵育4 h后,吸去孔內(nèi)MTT。每孔加入150 μL DMSO,置微量振蕩器上振蕩10 min,在酶標(biāo)儀570 nm波長處讀取吸光度值(A),并計算NCTD對HepG2細(xì)胞的增殖抑制率(%)。抑制率(%)=(1-加藥組A570nm/對照組A570nm)×100%。
1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡與周期
將HepG2細(xì)胞以每孔6×104的密度鋪于6孔板中,24 h后用NCTD 60 μmol·L-1處理12,24和48 h后,收集每個孔中的全細(xì)胞,每個時間點設(shè)置3個平行對照,實驗完全獨立得重復(fù)3次。細(xì)胞對照組細(xì)胞加入正常培養(yǎng)基作為對照。按說明書用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和周期變化。
1.7 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測
將HepG2細(xì)胞以每孔3×105的密度接種于6孔板中,24 h后實驗組換含濃度分別為NCTD30,60和120 μmol·L-1的完全培養(yǎng)基,細(xì)胞對照組細(xì)胞加入正常培養(yǎng)基作為對照。分別于3,6和12 h后收集每個孔中的全細(xì)胞,加入終濃度為100 μmol·L-1的DCFH-DA探針溶液黑暗孵育30 min后,洗去多余的探針,用流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波下檢測熒光強度[14-15],熒光強度數(shù)值與ROS水平成正相關(guān)關(guān)系。每個時間點、每個濃度設(shè)置3個平行對照。
1.8 熒光素酶法檢測HepG2C8細(xì)胞熒光強度
將轉(zhuǎn)染ARE及熒光素酶報告基因的HepG2細(xì)胞HepG2C8細(xì)胞以每孔1×104的密度常規(guī)接種于96孔板中,24 h后實驗組換含濃度分別為NCTD 30,60和120 μmol·L-1的完全培養(yǎng)基,叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)為Nrf2的激活劑,以tBHQ為陽性藥,分別在3,6和12 h時,在96孔板中添加100 μL用PBS稀釋的熒光素酶底物,立即用小動物成像儀檢測96孔板中每個孔的總熒光強度。
1.9 qRT-PCR技術(shù)檢測血紅素加氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶-1〔NAD(P)H:quinoneoxidoreductase 1,NQO1〕mRNA的表達(dá)
將HepG2細(xì)胞以每孔3×105的密度接種于6孔板中,24 h后實驗組換含濃度分別為NCTD 30,60和120 μmol·L-1的完全培養(yǎng)基,分別在3,6和12h后收集每個孔中全細(xì)胞,按照Trizol說明書提取RNA,合成cDNA;實時qRT-PCR的反應(yīng)條件:95℃,10 min;95℃,15 s;60℃,1 min,共40個循環(huán),以β肌動蛋白為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)水平。qRT-PCR引物見表1。
1.10 統(tǒng)計學(xué)分析
Tab.1 Prime sequence of qRT-PCR
2.1 去甲斑蝥素對HepG2細(xì)胞存活的影響
NCTD 30,60和120 μmol·L-1在3和6 h內(nèi),NCTD 30和60 μmol·L-1在12 h內(nèi)對HepG2細(xì)胞生長無明顯抑制作用;NCTD 120 μmol·L-1作用12 h、NCTD 30,60和120 μmol·L-1作用24,48和72 h對HepG2細(xì)胞生長有明顯抑制作用(P<0.01),抑制作用與用藥濃度及時間呈正比(圖1)。3,6,12,24,48和72 h的濃度效應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為0.479,0.544,0.892(P<0.01),0.797(P<0.01),0.900(P<0.01)和0.941(P<0.01)。30,60和120 μmol·L-1的時間效應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為0.829(P<0.01),0.899(P<0.01)和0.933(P<0.01)。
NCTD對HepG2細(xì)胞存活的影響發(fā)現(xiàn),NCTD 30,60和120 μmol·L-1分別作用3,6和12 h,除120 μmol·L-1作用12 h對HepG2細(xì)胞生長有一定抑制作用外,其他作用濃度和時間對該細(xì)胞生長均無明顯抑制作用,故選擇NCTD 30,60和120 μmol·L-1作用3,6和12 h研究其對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響。
Fig.1 Inhibitory rate of norcantharidin(NCTD)on HepG2 cells for 3-72 h by MTT assay.,n=3.**P<0.01,compared with cell control group.The inhibitory rate of cell control was taken as 0%.
2.2 去甲斑蝥素對HepG2細(xì)胞凋亡的影響
流式結(jié)果(圖2)顯示,NCTD 60 μmol·L-1作用HepG2細(xì)胞12 h即可以檢測到明顯的細(xì)胞凋亡,12,24和48 h凋亡細(xì)胞比例分別由12 h由細(xì)胞對照組的(4.00±1.98)%增加到NCTD 60 μmol·L-1組的(12.10±1.70)%(P<0.05),24 h細(xì)胞對照組的(4.05±0.21)%增加到NCTD 60 μmol·L-1組的(31.80±6.50)%(P<0.01),48 h細(xì)胞對照組的(3.90±0.85)%增加到NCTD 60 μmol·L-1組的(33.30±1.41)%(P<0.01)。
Fig.2Apoptosis of HepG2 cells induced by NCTD detected by flow cytometry analysis.A1:cell control group for 12 h;B1:cell control group for 24 h;C1:cell control group for 48 h;A2:NCTD 60 μmol·L-1for 12 h;B2:NCTD 60 μmol·L-1for 24 h;C2:NCTD 60 μmol·L-1for 48 h.
2.3 去甲斑蝥素對HepG2細(xì)胞周期的影響
如流式結(jié)果(圖3)所示,NCTD 60 μmol·L-1處理HepG2細(xì)胞12 h即誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯,由細(xì)胞對照組的(16.51±1.58)%增加到NCTD 60 μmol·L-1組的(40.89±0.18)%(P<0.01),24 h由細(xì)胞對照組的(16.99±1.32)%增加到NCTD 60 μmol·L-1組的(55.29±3.99)%(P<0.01),48 h由細(xì)胞對照組的(14.45±0.59)%增加到NCTD 60 μmol·L-1組的(50.66±5.88)%(P<0.01)。
Fig.3 Cell cycle of HepG2 cells induced by NCTD. A1:cell control group for 12 h;B1:cell control group for 24 h;C1;cell control group for 48 h;A2:NCTD 60 μmol·L-1for 12 h;B2:NCTD 60 μmol·L-1for 24 h;C2:NCTD 60 μmol·L-1for 48 h.
2.4 去甲斑蝥素對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響
NCTD在所選濃度范圍內(nèi)作用HepG2細(xì)胞3~12 h,對細(xì)胞ROS含量的影響無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。
Fig.4 Effect of NCTD on reactive oxygen species(ROS)content in HepG2 cells.FI:fluorescence intensity.
2.5 去甲斑蝥素對HepG2C8細(xì)胞中Nrf2/ARE信號通路的激活作用
NCTD 30 μmol·L-1作用6和12 h對HepG2C8細(xì)胞中ARE均有顯著激活作用(P<0.05,P<0.01),NCTD 60和120 μmol·L-1在3,6和12 h內(nèi)對HepG2C8細(xì)胞中ARE均有明顯激活作用(P< 0.05,P<0.01)。隨著NCTD濃度的增加,同一時間點激活作用逐漸增強。與細(xì)胞對照組相比,NCTD 60 μmol·L-1作用6 h對ARE的激活作用達(dá)到1.7倍,NCTD 120 μmol·L-1作用6和12 h對ARE的激活作用分別達(dá)到3.3和5.4倍(圖5)。
Fig.5 Effect of NCTD on activation of ARE in epG2C8 cells trasfected with ARE and luciferase report gene in HepG2 cells.tBHQ:tert-butylhydroquinone,positive control.n=3.*P<0.05,**P<0.01,compared with cell control group.
2.6 去甲斑蝥素對HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)的影響
與細(xì)胞對照組比較,NCTD30,60和120μmol·L-1作用HepG2細(xì)胞3 h對HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)無明顯影響,作用6 h,對HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)均有明顯激活作用(對HO-1 mRNA表達(dá)激活分別為P<0.05,P<0.05,P<0.01;對NQO1 mRNA表達(dá)激活均為P<0.01),作用12 h仍保持明顯激活作用(對HO-1 mRNA表達(dá)激活分別為P<0.05,P<0.01,P<0.01;對NQO1 mRNA表達(dá)激活分別為P<0.05,P<0.05,P<0.01),HO-1mRNA表達(dá)與6 h基本持平(30 μmol·L-1)或顯著增強(60和120 μmol·L-1)(均P<0.01),而NQO1 mRNA的表達(dá)12 h比6 h明顯減弱(30 μmol·L-1)(P<0.01)(圖6)。
Fig.6 Effect of NCTD on mRNA expression of heme oxygenase-1(HO-1)(A)and NAD(P)H:quinoneoxido?reductase 1(NQO1)(B)in HepG2 by qRT-PCR.*P<0.05,**P<0.01,compared with cell control group;##P<0.01,compared with corresponding 6 h treatment group.
本研究結(jié)果表明,NCTD在一定作用時間和濃度下對HepG2細(xì)胞存活有明顯抑制作用,且抑制效果與藥物作用時間和濃度成正相關(guān)。從NCTD對HepG2細(xì)胞凋亡和周期的影響可見,HepG2細(xì)胞在NCTD作用12 h后發(fā)生明顯的G2/M期阻滯及凋亡,因而探究發(fā)生在NCTD作用HepG2細(xì)胞12 h內(nèi)的早期生物學(xué)事件對理解NCTD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯有重要價值。
曾有報道,NCTD可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞ROS的產(chǎn)生并進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡[19-20],但本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),NCTD 30~120 μmol·L-1作用3~12 h對HepG2細(xì)胞中ROS水平無明顯影響,推測這個階段ROS產(chǎn)生可能不是NCTD誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及G2/M期阻滯的主要原因,NCTD對腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響可能受細(xì)胞系[19]及ROS分析方法的影響[20],目前研究數(shù)據(jù)雖不支持細(xì)胞內(nèi)ROS激活與NCTD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與周期阻滯有正相關(guān)性,但不排除NCTD作用腫瘤細(xì)胞更早期時產(chǎn)生的ROS已打開細(xì)胞凋亡或周期阻滯相關(guān)信號通路,二者的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。我們在NCTD對其他腫瘤細(xì)胞的抑制作用中曾發(fā)現(xiàn),NCTD對腫瘤細(xì)胞中微管的聚合有明顯的抑制作用[21-22],推測NCTD直接作用于細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)繼而引起細(xì)胞周期阻滯或凋亡在NCTD誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯和凋亡中占主要地位。
本研究根據(jù)Nrf2/ARE信號通路激活機制,用轉(zhuǎn)染了ARE的HepG2C8細(xì)胞作為實驗工具,檢測NCTD對Nrf2/ARE信號通路的激活作用。結(jié)果顯示,在12 h內(nèi),NCTD 30,60和120 μmol·L-1有明顯激活Nrf2/ARE信號通路的作用,且激活效率有一定濃度依賴性。已知細(xì)胞內(nèi)ROS可以作為第二信使激活Nrf2/ARE抗氧化信號通路[23],在本研究觀察時間內(nèi)雖然未檢測到NCTD對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響,NCTD對HepG2細(xì)胞內(nèi)Nrf2/ ARE信號通路的激活仍有可能與更早期的ROS產(chǎn)生有關(guān)。有研究表明,Nrf2/ARE信號通路與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)[24],Nrf2/ARE抗氧化信號通路的激活可以抵抗細(xì)胞內(nèi)ROS的過量生成,若ROS與NCTD的抗腫瘤作用相關(guān),Nrf2/ARE信號通路抑制劑與NCTD聯(lián)合用藥可能會增強NCTD的抗腫瘤作用,需進(jìn)一步開展聯(lián)合用藥及效果評估研究。另外,大量研究表明,細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移與細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生有關(guān)[25],NCTD可以激活Nrf2/ARE信號通路,為NCTD作為一種癌癥預(yù)防藥物的研發(fā)提供了思路。
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Early events of norcantharidin reactive oxygen species and NF-E2-related factor 2/antioxidant response element pathway of HepG2 cells
CHEN Jing*,CUI Bao-di*,SUN Zhen-xiao
(College of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China)
OBJECTIVETo investigate the early events of norcantharidin(NCTD)induced cell apoptosis and cell cycle arrest,the variation of reactive oxygen species(ROS)and the NF-E2-relate?dactor 2/antioxidant response element(Nrf2/ARE)pathway in human HepG2 cells.METHODSThe cyto?toxicity was measured by MTT assay.Apoptosis and cell cycle was analyzed by flow cytometry.The intra toxicity ROS production was evaluated by flow cytometry analysis with DCFH-DA probe and the effect of NCTD on Nrf2/ARE pathway was detected by luciferase assay in HepG2C8 cells under the same condition. The mRNA expression of heme oxygenase-1(HO-1)and NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1(NQO1) antioxidase gene in Nrf2/ARE pathway downstream was evaluated by quantitative real-time PCR.RESULTSNo significant cytotoxicity was detected after HepG2 cells were treated with NCTD 30,60 and 120 μmol·L-1for 3 and 6 h,but cellular viability was inhibited significantly by NCTD 30,60 and 120 μmol·L-1for 24,48 and 72 h(P<0.01).Cell apoptosis and G2/M phase arrest occurred after HepG2 cells were treated with NCTD 60 μmol·L-1for 12,24 and 48 h.The percentage of apoptosis increased from(4.00±1.98)%to(12.10±1.70)%for 12 h,from(4.05±0.21)%to(31.8±6.50)%for 24 h,and from (3.90±0.85)%to(33.30±1.41)%for 48 h,respectively.The percentage of G2/M phase increased from (16.51±1.58)%to(40.89±0.18)%for 12 h,from(16.99±1.32)%to(55.29±3.99)%for 24 h,and from (14.45±0.59)%to(50.66±5.88)%for 48 h,respectively.Compared with cell control group,the percentage of G1phase had a significant decrease in the group with NCTD treated at different time points(P<0.01).No significant change in ROS in HepG2 cells was detected after the treatment with NCTD 30,60 and 120 μmol·L-1for 3,6 and 12 h.Nrf2/ARE pathway in HepG2C8 cells was activated by NCTD 30,60 and 120 μmol·L-1for 6 and 12 h.mRNA expression of HO-1 and NQO1 had a signifi?cant activation in HepG2 cells after treatment with NCTD 30,60 and 120 μmol·L-1for 6 and 12 h(P<0.05).CONCLUSIONNCTD can activate Nrf2/ARE pathway in the early stage in HepG2 cells,which may inhibit the intracellular ROS production in the early stage.Activation of ROS may not be the main event in NCTD induced HepG2 cell apoptosis and G2/M phase arrest.
norcantharidin;apoptosis;cell cycle;Nrf2-ARE pathway;reactive oxygen species; heme oxygenase-1;NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1
SUN Zhen-xiao,E-mail:sunzxcn@hotmail.com,Tel:(010)84738646
R285.5,R979.1
A
1000-3002-(2017)01-0094-07
10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.012
2016-05-03接受日期:2016-09-18)
(本文編輯:喬 虹)
國家自然科學(xué)基金項目(81473418);國家林業(yè)局野生動植物保護項目(2012-2016)
陳 靜,女,碩士研究生,主要從事中藥分子細(xì)胞藥理學(xué)與毒理學(xué)研究,E-mail:476494894@qq.com,Tel:(010)84738646;崔寶弟,女,碩士研究生,主要從事中藥及其有效成分抗腫瘤分子細(xì)胞藥理學(xué)研究,Tel:(010)84738646,E-mail:1293772869@qq.com
孫震曉,E-mail:sunzxcn@hotmail.com,Tel:(010)84738646
*共同第一作者。
Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81473418);and Wildlife Protection Project of the State Forestry Administration(2012-2016)
*Co-first author.