地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性研究

段曉杰，羅世林，汪文琪，王雄飛，湯化琪，孫毅坤

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性研究

段曉杰，羅世林，汪文琪，王雄飛，湯化琪，孫毅坤*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

目的:對影響地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性的因素進行研究。方法:通過考馬斯亮藍(lán)法建立了地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)的含量測定方法，并考察了溫度、pH值、無機鹽及有機溶劑等因素對提取液中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果:在30℃、pH值為7的條件下，提取液中蛋白質(zhì)的含量最高，而加入無機鹽或有機溶劑后蛋白質(zhì)含量均有所降低。結(jié)論:提取液的最佳保存條件為30℃、pH值7，且提取過程中應(yīng)盡量減少無機鹽和有機溶劑的使用。

地龍?zhí)崛∫?蛋白質(zhì)穩(wěn)定性;考馬斯亮藍(lán)法

地龍又名“蚯蚓”，最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］。該藥物性味咸，寒，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有清熱止痙、平肝熄風(fēng)、平喘通絡(luò)、利尿的功效［2-6］。課題組前期對斷體地龍?zhí)崛∫哼M行了創(chuàng)傷愈合的研究，結(jié)果表明，地龍?zhí)崛∫壕哂辛己玫拇龠M創(chuàng)傷愈合的作用，其主要活性成分為小分子蛋白類成分。作為一種蛋白質(zhì)染料，考馬斯亮藍(lán)G-250可在酸性條件下與蛋白質(zhì)結(jié)合形成考馬斯亮藍(lán)G-250-蛋白質(zhì)復(fù)合物，其最大吸收峰為595 nm，且吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系［7］，因此可通過考馬斯亮藍(lán)法對地龍?zhí)崛∫褐械牡鞍踪|(zhì)進行含量測定，從而觀察溫度、pH值、無機鹽及有機溶劑等［8］對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。

1 儀器與試藥

萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)有限公司);冷凍離心機(TGL20M，湘智離心機廠);PHS-3C型酸度計(上海般特儀器制造有限公司);紫外分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);勻漿機(IKA T10 basic);牛血清白蛋白(AMERSCO); Tris(C4H11NO3，AMRESCO);氯化鈉(NaCl，分析純，北京化工廠);鹽酸(分析純，北京化工廠);考馬斯亮藍(lán)G-250(北京欣經(jīng)科生物);硫酸銨((NH4)2SO4，北京化工廠);其余試劑均為分析純。

2 地龍?zhí)崛∫旱闹苽?/h2>

取地龍適量，加入一定量的Tris-HCl緩沖液，冰浴勻漿，離心，取上清液封裝好置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

3 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性考察

3.1 蛋白質(zhì)的含量測定

精密稱取牛血清蛋白31 mg，于25 mL容量瓶中定容，搖勻，備用。分別精密吸取牛血清蛋白溶液0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 mL，加Tris-HCl緩沖溶液至0.20 mL后，再加入考馬斯亮藍(lán)試劑10 mL，混勻，室溫靜置5 min，于595 nm處測定吸光度。以牛血清蛋白濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得回歸方程A=34.741C-0.002 6(R2=0.996 5)。結(jié)果表明牛血清蛋白在0.002 5～0.025 mg/mL濃度范圍時濃度與吸光度線性關(guān)系良好(見圖1)。

圖1 牛血清蛋白濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 溫度、pH值、無機鹽和有機溶劑對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響

3.2.1 溫度對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響

取地龍?zhí)崛∫?份，每份2 mL，一份置于冰浴中0℃保持5 min，其余6份分別用水浴鍋加熱至10、20、30、40、50、60℃并保持5 min，測定不同溫度下地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度與蛋白質(zhì)含量變化曲線

由圖2可看出，30℃時地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)含量最高，可能是由于溫度過低或過高都會對蛋白的空間結(jié)構(gòu)有一定影響，使之化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化、穩(wěn)定性下降，進而含量降低［9］。其中高溫對地龍勻漿蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響更大，在30℃ ～60℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)含量顯著下降。

3.2.2 pH值對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響

取地龍?zhí)崛∫?份，每份2 mL，分別采用鹽酸或1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)提取液的pH值至5，6，7，8，9，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖3。

圖3 pH值與蛋白質(zhì)含量變化曲線

當(dāng)pH值為7時，蛋白質(zhì)含量最高，pH值為8時蛋白質(zhì)含量最低。在不同pH值范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量變化也不同?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)分子是兩性物質(zhì)，在等電點附近時，水化作用最弱，溶液不穩(wěn)定［10］造成的。

3.2.3 無機鹽對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響

取地龍?zhí)崛∫?份，每份2 mL。分別加入氯化鈉29.20，58.40，87.70，116.90 mg，最終得地龍?zhí)崛∫褐新然c濃度分別為0.5，1，1.5，2.0 mol/L，振蕩，搖勻，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖4。

取地龍?zhí)崛∫?份，每份2 mL。分別加入硫酸銨66.10，132.10，198.20，264.30 mg，最終得地龍?zhí)崛∫褐辛蛩徜@濃度分別為0.5，1，1.5，2.0 mol/L，振蕩，搖勻，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質(zhì)含量結(jié)果見圖5。

圖4 氯化鈉濃度與蛋白質(zhì)含量變化曲線

圖5 硫酸銨濃度與蛋白質(zhì)含量變化曲線

由圖4～5可知，無機鹽的濃度與地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，即地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)含量隨著氯化鈉和硫酸銨濃度的增加而減少。分析原因可能如下:蛋白質(zhì)是由親水性和疏水性氨基酸組成，蛋白質(zhì)疏水基大部分存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，暴露在外的疏水殘基和親水殘基決定了蛋白質(zhì)分子的溶解度［10］。當(dāng)往溶液中加入中性鹽離子時，蛋白質(zhì)疏水基相互作用減弱，易發(fā)生鹽析而使蛋白質(zhì)溶解度降低。同時離子的作用降低了蛋白質(zhì)大分子離子的活性又可使其溶解度提高［11］。

3.2.4 有機溶劑對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響

取地龍?zhí)崛∫?份，每份2 mL。分別加入甲醇0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，最終得地龍?zhí)崛∫褐屑状紳舛缺?體積比)分別為0%，10%，20%，30%，40%，50%，振蕩，搖勻，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見6。

取地龍?zhí)崛∫?份，每份2 mL。分別加入乙腈0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，最終得地龍?zhí)崛∫褐幸译鏉舛缺?體積比)分別為0%，10%，20%，30%，40%，50%，振蕩，搖勻，于4℃下放置24 h，分別測定其蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見7。

圖6 甲醇濃度與蛋白質(zhì)含量變化曲線

圖7 乙腈濃度與蛋白質(zhì)含量變化曲線

由圖6～7可以看出，地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)含量與有機溶劑體積分?jǐn)?shù)也呈負(fù)相關(guān)。地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)含量隨甲醇和乙腈體積分?jǐn)?shù)的增大而降低?？赡苁怯捎谟袡C溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子不同電荷間的引力，使之聚集析出;且有機溶劑可與水作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面水化層，使蛋白質(zhì)分子脫水聚集析出，從而使蛋白質(zhì)含量降低。

4 討論與總結(jié)

本實驗通過測定不同溫度、不同pH值、不同濃度無機鹽以及不同濃度有機溶劑下蛋白質(zhì)的含量來考察蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)佚執(zhí)崛∫涸?0℃左右保存時，測得蛋白質(zhì)的含量最高;當(dāng)溶液pH值為7時，活性較好，測得蛋白質(zhì)的含量也最高。而無機鹽和有機溶劑則會不同程度的降低地龍?zhí)崛∫褐械鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性。因此實驗中將地龍?zhí)崛∫罕４嬖?0℃下、提取液pH值控制在7左右為宜，且應(yīng)盡量避免或減少對無機鹽及有機溶劑的使用。

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Stability of Protein in Earthworm Extract

DUAN Xiao-jie，LUO Shi-lin，WANG Wen-qi，WANG Xiong-fei，TANG Hua-qi，SUN Yi-kun*
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

Objective:Factors influencing the stability of the protein in earthworm extract were researched in this article.Methods:Braford was adopted for determination of protein to observe the influences which temperature，pH，inorganic salt and organic solvents had on the stability of protein.Results:It showed that the protein was the stablest under 30℃ and pH=7 and became weaker when inorganic salt and organic solvents were added.Conclusion:The optimal preservation condition for earthworm extract is 30℃ and pH=7，and inorganic salt and organic solvents should be limited in the extraction process.

Earthworm extract;Stability of protein;Braford

R28

A

1002-2406(2017)02-0031-03

國家自然科學(xué)基金面上項目(No.81373942)

段曉杰(1991-)，女，北京中醫(yī)藥大學(xué)2015級中藥分析專業(yè)碩士研究生。

孫毅坤*(1965-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向:藥品質(zhì)量控制。

2016-08-16

修回日期:2016-09-10