• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    木犀草苷對HUVECs抗氧化損傷保護作用研究

    2017-03-28 07:26:22孫超董坤馬英麗
    中醫(yī)藥信息 2017年2期
    關鍵詞:草苷木犀過氧化氫

    孫超,董坤,馬英麗

    (黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

    木犀草苷對HUVECs抗氧化損傷保護作用研究

    孫超,董坤,馬英麗*

    (黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

    目的:采用過氧化氫(H2O2)體外誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)損傷,構建HUVECs氧化損傷模型,觀察蓬子菜中木犀草苷對損傷HUVECs的保護及損傷修復作用,并初步探討其作用機制。方法:采用體外培養(yǎng)HUVECs,取對數期的細胞調整細胞密度為5×103/mL,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞增殖到80%左右時,將細胞隨機分為5組:空白組、模型組(僅加入濃度為200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)2 h),給藥保護組(質量濃度分別為6.25、12.5、25 mg/L的木犀草苷培養(yǎng)24 h,之后加入濃度為200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)2 h),每組設6個復孔。采用CCK8法檢測細胞增殖抑制率,熒光分光光度法測定超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)的含量;采用紫外分光光度法測定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放。Hoechst33328熒光染色觀察木犀草苷對過氧化氫誘導的臍靜脈內皮細胞損傷的影響。結果:與正常組比較,模型組培養(yǎng)液中LDH含量明顯增加;SOD,GSH-Px活性降低,MDA含量明顯升高(P均<0.01)。與模型組比較,給藥各劑量組(6.25、12.5、25 mg/L)都能顯著提高H2O2損傷的細胞的存活率,明顯抑制HUVECs的LDH的釋放,顯著減少HUVECs的MDA的含量,提高SOD的活性。結論:蓬子菜木犀草苷對氧化損傷的HUVECs具有保護及修復作用。

    蓬子菜;木犀草苷;氧化損傷

    血管疾病的臨床學研究發(fā)現(xiàn),血管內皮細胞作為細胞與血液的屏障不僅具分泌的功能,還參與血管生理學功能的調節(jié)。血管內皮細胞的損傷是引起多種血管疾病(如心腦血管疾病,靜脈血栓等)的重要原因之一[1]。氧化應激產生的活性氧被認為是導致血管內皮細胞損傷的主要因素,因此抗氧化損傷方面的研究對治療心,腦血管疾病具有重要的意義[2-3]。在木犀草苷的研究過程中發(fā)現(xiàn),木犀草苷有直接清除活性氧自由基的作用,能提高體內抗氧化酶的活性,降低過氧化物質生成[4],臨床上應用木犀草苷治療下肢靜脈血栓取得了良好的療效[5]。本實驗通過體外建立過氧化氫損傷模型,探討木犀草苷對HUVECs的保護、損傷及修復的作用機理。

    1 材料與儀器

    1.1 材料

    木犀草苷(本實驗室自提分離得到);人臍靜脈內皮細胞(哈爾濱醫(yī)科大學實驗室提供);RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies Corporation);胰酶細胞消化液(碧云天生物技術研究所);CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所);PBS(北京中杉金橋生物技術有限公司);丙二醛MDA試劑盒、超氧化物歧化酶SOD試劑盒、乳酸脫氫酶LDH試劑盒、谷胱甘肽-過氧化物酶GSH-Px(南京建成生物工程研究所)。

    1.2 儀器

    超凈工作臺BSC-1300IIB2(蘇州安泰空氣技術有限公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force,HF90);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司,CKX41);電熱恒溫水浴鍋(HHS,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司,Synergy 2);套筒式微量冷凍離心機(天美科學儀器有限公司,MX-307);微孔濾膜(0.22 μm,AMRESCO公司)。

    2 實驗方法

    2.1 CCK8酶標法檢測不同濃度木犀草苷對HUVECs生長的影響

    實驗分為正常對照組,不同濃度木犀草苷處理組(3.25、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)。取對數期HUVECs,用胰酶消化后并吹打均勻以3×104每孔接種于96孔板中,于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;用含10%牛血的1640培養(yǎng)液稀釋木犀草苷原液配成濃度3.25、6.25、12.5、25、50、100 mg/L工作液;將不同濃度的木犀草苷工作液加入96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄掉上清液,每孔加入20 μl CCK-8放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min,酶標儀450 nm處檢測。

    2.2 HUVECs氧化損傷模型的建立

    人臍靜脈內皮細胞以3×103/ml接種于96孔板,實驗分為空白對照組、過氧化氫損傷組(100、200、400、800 μmol/L)。每組設6個副孔。空白對照組每孔加入200μl無血清的1640培養(yǎng)液;過氧化氫各損傷組加入200μl無血清培養(yǎng)液配制的終濃度為100、200、400、800 μmol/L的H202;分別培養(yǎng)1 h、2 h、6 h、12 h、24 h后,吸棄舊培養(yǎng)基,每孔加入20 μl CCK-8(mg/mL),置于孵箱中孵育30 min,于酶標儀450 nm處讀取吸光度值,計算過氧化氫對細胞的抑制率。通過對細胞抑制率的計算從而確定過氧化氫損傷模型的最適條件。

    抑制率(%)=1-[各組吸光度值(A)/空白組吸光度值(A)]×100%

    2.3 木犀草苷預處理對過氧化氫誘導臍靜脈內皮細胞活力值的影響

    取對數生長期的細胞,調整細胞密度為每孔3× 103個接種于96孔板,放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。實驗分組為空白組,模型組和給藥組(6.25、12.5、25 mg/L)在給藥24 h之后,加入濃度為200 μmol/L的 H2O2培養(yǎng)1 h。去除培養(yǎng)板中上清液,每孔分別加入20 μl CCK-8試劑,放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min,使用酶標儀在450 nm處檢測其OD值。

    2.4 測定HUVECs中的SOD活性GSH-Px的活性

    取對數生長期的細胞,調整密度為每孔3×103個接入96孔板中,貼壁培養(yǎng)24 h。實驗設空白組,模型組,給藥組(6.25、12.5、25 mg/L)每組設6個副孔,給藥24 h后,按H2O2損傷濃度為200 μmol/L損傷2 h,按照SOD和MDA試劑盒說明書,利用酶標儀分別檢測SOD的活力和MDA的分泌水平。

    2.5 測定臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中MDA和上清液中LDH的釋放量

    同“2.4”項處理相同后,按試劑盒說明書的要求操作,最后利用酶標儀分別對細胞內的GSH-Px和上清液中的LDH進行測定。

    2.6 Hoechst33328染色觀察細胞形態(tài)學變化

    實驗開始之前,提前將蓋玻片放在70%乙醇中提前浸泡一段時間,無菌超凈臺上吹干后用PBS反復清洗3次。將處理過的蓋玻片放入6孔板內,每孔可平行放入3個蓋玻片,接入密度為5×105個/mL的內皮細胞,酒精消毒后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸出培養(yǎng)液加入含有木犀草苷(6.25、12.5、25 mg/L)的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞增殖至80%左右時,采用含有過氧化氫的1640培養(yǎng)基刺激細胞發(fā)生凋亡。用移液槍吸盡培養(yǎng)液,每塊蓋玻片上滴入一滴固定液固定15 min。吸除固定液,用 PBS反復清洗3遍,每次2 min(洗滌時用手動搖晃數次)。加入0.5 mL Hoeehst33258染色液染色,避光染色10 min(染色時也應手動搖晃數次)染色后吸除染色液,用PBS清洗3次,每次2 min。在載玻片上滴一滴封片液熒光淬滅,將含有染好顏色細胞的蓋玻片蓋在載玻片上。(盡量避免氣泡生成)調整熒光顯微鏡,采用CCD數碼相機照相,采用圖像分析處理軟件NIS-Element:BR3.0處理。

    3 結果

    3.1 不同濃度木犀草苷對HUVECs生長的影響

    結果見表1,與正常組比較,3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L作用細胞24 h,其中6.25、12.5、25 mg/L作用后的細胞活力值明顯上升,3.25 mg/mL作用細胞后未見明顯提高,50、100、200 mg/L作用細胞后呈現(xiàn)抑制細胞增殖的趨勢,當給藥濃度為400 mg/L時,與空白組比,細胞活力值明顯降低,表明高濃度木犀草苷抑制細胞的生長。結合實驗操作及臨床應用藥物適用范圍,后續(xù)試驗選用藥物濃度為6.25、12.5、25 mg/L。

    表1 不同濃度Luteoloside對HUVECs活力值的影響(±s)

    表1 不同濃度Luteoloside對HUVECs活力值的影響(±s)

    C(μg/mL) Time(h) OD Proliferation(%) 0 24 1.126±0.003 100 3.125 24 1.114±0.015 101.33 6.25 24 1.159±0.001 102.93 12.5 24 1.163±0.055 103.29 25 24 1.180±0.052 104.80 50 24 1.118±0.052 99.29 100 24 1.061±0.058 94.23 200 24 1.052±0.036 93.43 400 24 0.858±0.036 76.20

    3.2 HUVECs氧化損傷模型的建立

    CK-8檢測結果顯示,隨著過氧化氫濃度的升高,臍靜脈內皮細胞(HUVECs)抑制率逐漸升高(表2)。當過氧化氫濃度為200 μmol/L,作用時間2 h時,細胞抑制率為51.29%,過氧化氫濃度為400 μmol/L時,細胞抑制率為 72.13%。當過氧化氫濃度達到 800μmol/L時,細胞抑制率可達到92.77%。隨著作用時間的延長,細胞抑制率明顯增高,當作用時間為12 h時,過氧化氫損傷濃度為200 μmol/L時,細胞抑制率為 94.58%、濃度為 400 μmol/L時,抑制率為96.59%、濃度為800 μmol/L時,抑制率為98.17%,即細胞趨于全部死亡。因此過氧化氫濃度為200 μmol/L,作用2 h時,抑制率為50%作用為理想造模條件。

    表2 Influence of H2O2on HUVECs(n=6,±s)

    表2 Influence of H2O2on HUVECs(n=6,±s)

    濃度(μmol/L)1 h 2 h 6 h 12 h 24 h 100 25.15 37.73 45.54 52.83 66.02 200 40.15 51.29 78.99 94.58 95.52 400 60.15 72.13 95.65 96.59 98.29 800 85.70 92.77 95.71 98.17 99.52

    3.3 木犀草苷預處理對過氧化氫誘導臍靜脈內皮細胞活力值的影響

    結果見表3,CCK-8檢測結果顯示:Luteoloside預處理組細胞活力值均高于過氧化氫模型組(P<0.05),其中Luteoloside(6.25、12.5、25 μg/mL)三個濃度組對過氧化氫誘導的HUVECs增殖作用顯著(P<0.01),并隨著給藥濃度的增大,對過氧化氫誘導的細胞活力值下降具有明顯的上調作用。木犀草苷高劑量組(50、100 μg/mL)細胞活力值也高于模型組,但其差異微弱,不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在預處理12~72 h不同條件下,給藥組對過氧化氫誘導的細胞活力值下降都具有上調趨勢,其作用顯著(P<0.01),但不同時間的條件沒有顯著性差異(P>0.05),因此在后續(xù)的實驗研究中選擇藥物作用時間為24 h。

    表3 不同濃度的Luteoloside對氧化損傷的HUVECs增值的作用(±s)

    表3 不同濃度的Luteoloside對氧化損傷的HUVECs增值的作用(±s)

    注:與H2O2組比較,*P<0.05,**P<0.01;與Control比較,△P<0.05,△△P<0.01。

    組別 OD Inhibitory rate(%) Control 2.188±0.063 0 H2O2組 1.370±0.024△△46.21 Luteoloside(3.125 ug/mL)+H2O 1.499±0.008**39.20 Luteoloside(6.25 ug/mL)+H2O21.581±0.009**34.33 Luteoloside(12.5 ug/mL)+H2O21.599±0.038**33.31 Luteoloside(25 ug/mL)+H2O21.679±0.039**28.79 Luteoloside(50 ug/mL)+H2O21.496±0.012**39.14 Luteoloside(100 ug/mL)+H2O21.452±0.021*41.63

    3.4 木犀草苷對HUVECs中的SOD活性及GSH-Px活性的影響

    結果見圖1~2。木犀草苷各藥物濃度組和空白組的SOD、GSH-Px活性明顯高于過氧化氫損傷組(P<0.01);隨著藥物濃度的增加,SOD活性有逐漸升高的趨勢,藥物組之間兩兩比較,木犀草苷低濃度組與中濃度組比較,中濃度組與高濃度組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),低濃度組與高濃度組比較差異顯著(P<0.01)。

    圖1 Luteoloside對氧化損傷HUVEC細胞培養(yǎng)液中SOD活性的影響(±s)

    圖2 Luteoloside對氧化損傷HUVEC細胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性的影響(±s)

    3.5 木犀草苷對受損HUVECs中MDA和LDH含量的影響

    結果見圖3~4。與空白組比較,模型組細胞上清液中MDA含量明顯高于空白對照組(P<0.01)。與模型組比較,藥物組中MDA的含量明顯低于模型組(P<0.01),Luteoloside能明顯降低細胞培養(yǎng)液中MDA的含量(P<0.01),并隨著給藥濃度的增高,抑制脂質過氧化產物(MDA)合成的能力逐漸增強。給藥物組各個濃度組間比較,其差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖3 Luteoloside對氧化損傷HUVEC細胞培養(yǎng)液中MDA含量的影響(±s)

    圖4 Luteoloside對氧化損傷HUVEC細胞上清液中LDH含量的影響(±s)

    3.6 各組熒光顯微鏡結果

    結果如圖5所示:在熒光顯微鏡下觀察,空白組細胞形態(tài)正常,結構完整,細胞與細胞之間排列緊湊,分布均勻,染色均勻且程度較淺,在視野中呈現(xiàn)淺藍色染核形態(tài)。與空白組比較,模型組細胞體積明顯縮小,細胞核會呈碎塊狀致密濃染,顏色有些發(fā)白部分細胞呈亮藍色濃染并有熒光小體產生。與模型組相比,木犀草苷保護組熒光小體較少,細胞結構比較正常,排列比較緊湊,細胞核染色呈淺藍色染核形態(tài),凋亡細胞伴隨的細胞質染色即熒光小體隨著給藥濃度的增高,熒光小體逐漸減少,濃染細胞數量呈遞減趨勢,表明木犀草苷具有抑制過氧化氫誘導的臍靜脈內皮細胞凋亡的作用。

    圖5 各組熒光顯微鏡結果

    4 討論

    蓬子菜資源豐富,民間藥用廣泛且藥用史長,其主要的化學成分為黃酮類、蒽醌類、環(huán)烯醚萜類、具有保護心腦血管、抗炎、抗血栓、止血、消腫、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[6-10]。木犀草苷(luteoloside)即木犀草素-7-O-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside),為黃酮類化合物,是一種廣譜、有效的抗氧化劑,其結構中含有多個酚羥基,可與氧自由基反應生成共振穩(wěn)定的半醌式自由基結構,阻斷自由基鏈式反應,并通過單電子轉移方式清除體內的自由基,提高抗氧化酶的活性,還原氧化物質,發(fā)揮其抗氧化的作用。本次試驗對超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)及乳酸脫氫酶(LDH)的含量進行測定。實驗結果表明,與空白組比較,過氧化氫損傷模型組中SOD及GSH-Px活性顯著降低(P<0.01),而 MDA及上清液中的 LDH顯著增加(P<0.01);與模型組比較,木犀草苷預處理各組SOD及GSH-Px活性明顯增高,而MDA和LDH含量顯著降低(P<0.01)。表明木犀草苷具有提高HUVEC細胞抗氧化能力,減輕由自由基攻擊細胞膜引起的脂質過氧化損傷,減輕過氧化氫損傷HUVEC細胞程度。綜上所述木犀草苷可能具有升高氧化損傷的HUVECs中SOD、GSH-Px活性及降低MDA和LDH含量,對由過氧化氫造成的HUVECs氧化損傷具有保護作用。

    [1]Wang YK.Cureuligoside attenuates human umbilical vein endothelial cell injury by H2O2[J].J Ethnopharmacol,2010,132:233-239.

    [2]Griendling KK,F(xiàn)itzGerald GA.Oxidative stress and cardiovascular injury.PartⅡ[J].Animal and human studies Circ,2003,108:2034-2040.

    [3]Griendling KK,F(xiàn)itzGerald GA.Oxidative stress and cardiovascular injury.Part I.Basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS[J].Circulation,2003,108,1912-1916.

    [4]周玲,解硯英,李杰,等.木犀草素-7-O-葡萄糖苷對缺血缺氧培養(yǎng)乳鼠心肌細胞的保護作用[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(4):259-261.

    [5]趙剛,吳明遠,田旭升,等.蓬子菜沖劑對降鈣素基因相關肽和腎上腺髓質水平的影響[J].中國中西醫(yī)結合外科雜志,2007,13 (1):66-68.

    [6]董坤,寇韓旭,寧馨,等.蓬子菜中香葉木苷對急性血瘀及血管內皮功能影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(6):20-22.

    [7]苑海剛,薛鳳,趙鋼.蓬子菜水溶液對糖尿病患者皮膚潰瘍的臨床療效觀察[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(2):87-89.

    [8]朱華,梁東艷,廖月葵,等.總黃酮化合物藥理作用研究進展[J].廣西中醫(yī)藥,2003,7(20):3-5.

    [9]寇韓旭,董坤,寧馨,等.蓬子菜總黃酮對急性血瘀大鼠血液流變學影響及作用機制的研究[J].中醫(yī)藥學報,2015,43(1):11-15.

    [10]苑海剛,薛鳳,趙鋼.蓬子菜水溶液對大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面修復影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥學報,2016,44(2):40-42.

    R28

    A

    1002-2406(2017)02-0005-04

    國家自然科學基金項目(No.201281274034);教學部博士點博導類基金資助項目(No.20112327110006)

    孫超(1989-),男,碩士研究生,主要研究方向:中藥及復方藥效物質基礎。

    馬英麗*(1954-),女,教授,博士研究生導師,主要研究方向:中藥及復方藥效物質基礎和質量標準化研究。

    2016-05-20

    修回日期:2016-06-01

    猜你喜歡
    草苷木犀過氧化氫
    RP-HPLC法測定大鼠血漿中木犀草苷的濃度*
    木犀草素通過上調microRNA-34a-5p誘導肺癌細胞株H460凋亡的研究
    英雄降獸木犀舞
    西江月(2017年4期)2017-11-22 07:24:09
    高效液相色譜法測定銀花泌炎靈片中木犀草苷含量
    YT星球的少年
    螞蟻會用過氧化氫治療感染
    木犀草苷的藥理作用研究
    Box-Benhnken響應面分析法優(yōu)化金銀花藥材中綠原酸與木犀草苷的提取工藝
    中成藥(2014年10期)2014-02-28 22:29:40
    HHX-VHP型隧道式過氧化氫滅菌箱
    機電信息(2014年5期)2014-02-27 15:51:48
    HHX-VHP 型隧道式過氧化氫滅菌箱
    機電信息(2014年2期)2014-02-27 15:51:39
    亚洲专区中文字幕在线| 两个人视频免费观看高清| 少妇的逼水好多| 看黄色毛片网站| 成人av一区二区三区在线看| 宅男免费午夜| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美国产日韩亚洲一区| 白带黄色成豆腐渣| 精品久久久久久久久亚洲 | 免费观看人在逋| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美乱色亚洲激情| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 脱女人内裤的视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 高潮久久久久久久久久久不卡| 18+在线观看网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品影院6| 中亚洲国语对白在线视频| 可以在线观看的亚洲视频| 51国产日韩欧美| 国产成人av教育| 亚洲精品456在线播放app | 日韩有码中文字幕| 一区二区三区免费毛片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲自偷自拍三级| 男女床上黄色一级片免费看| 一个人免费在线观看电影| 欧美成人性av电影在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 午夜久久久久精精品| 亚洲经典国产精华液单 | 久久国产精品人妻蜜桃| 91九色精品人成在线观看| av天堂中文字幕网| 亚洲电影在线观看av| 国产高潮美女av| 国产三级在线视频| av欧美777| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人福利小说| 黄色视频,在线免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产中年淑女户外野战色| 啦啦啦韩国在线观看视频| 看十八女毛片水多多多| 欧美又色又爽又黄视频| 国产野战对白在线观看| 国产视频一区二区在线看| 黄色配什么色好看| 国产午夜精品论理片| 看十八女毛片水多多多| 日韩欧美 国产精品| 91久久精品电影网| 大型黄色视频在线免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩精品青青久久久久久| 日韩欧美精品v在线| 日韩欧美精品v在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 久久久久久久久久成人| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产高潮美女av| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 成人三级黄色视频| or卡值多少钱| 校园春色视频在线观看| 久久精品91蜜桃| 日本精品一区二区三区蜜桃| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色综合婷婷激情| 欧美+亚洲+日韩+国产| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产精品精品国产色婷婷| 简卡轻食公司| 婷婷丁香在线五月| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产一区二区激情短视频| bbb黄色大片| 真人做人爱边吃奶动态| eeuss影院久久| 天天躁日日操中文字幕| 国产探花在线观看一区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美一区二区国产精品久久精品| 如何舔出高潮| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人鲁丝片一二三区免费| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲片人在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜福利欧美成人| 精品久久久久久久末码| 成人欧美大片| 久久精品影院6| 毛片一级片免费看久久久久 | 18+在线观看网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 嫩草影院入口| 午夜视频国产福利| 最好的美女福利视频网| 99riav亚洲国产免费| 亚洲在线自拍视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美成人性av电影在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 18禁在线播放成人免费| 日韩欧美国产在线观看| 97碰自拍视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美高清性xxxxhd video| 熟女电影av网| 嫩草影院精品99| 99热这里只有是精品在线观看 | 久久性视频一级片| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲国产精品999在线| 男女视频在线观看网站免费| 真人做人爱边吃奶动态| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲人与动物交配视频| 特级一级黄色大片| www.色视频.com| 国产欧美日韩一区二区精品| 黄色一级大片看看| 国产精品三级大全| 亚洲美女搞黄在线观看 | 小说图片视频综合网站| 舔av片在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 三级国产精品欧美在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美区成人在线视频| 少妇的逼好多水| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日韩高清综合在线| 成人精品一区二区免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清专用| 黄色一级大片看看| a级毛片免费高清观看在线播放| 美女高潮的动态| 精品福利观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费看日本二区| 国产视频一区二区在线看| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av二区三区四区| 久久人人爽人人爽人人片va | 一进一出抽搐gif免费好疼| 日韩欧美免费精品| 看免费av毛片| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲精华国产精华精| 欧美潮喷喷水| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产淫片久久久久久久久 | 淫秽高清视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 禁无遮挡网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 色综合站精品国产| 欧美高清性xxxxhd video| 国产高潮美女av| 欧美成人性av电影在线观看| 成人精品一区二区免费| 亚洲av美国av| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲成人久久性| 我要搜黄色片| 国产av麻豆久久久久久久| 深夜a级毛片| 午夜精品在线福利| 亚洲av二区三区四区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲人成网站在线播| 12—13女人毛片做爰片一| 一个人免费在线观看电影| 99热这里只有是精品50| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 中文字幕av在线有码专区| 最新中文字幕久久久久| 午夜激情福利司机影院| 国产极品精品免费视频能看的| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 亚洲性夜色夜夜综合| 在线播放国产精品三级| 精品久久久久久,| 亚洲av免费高清在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 美女黄网站色视频| 最新在线观看一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 一夜夜www| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 很黄的视频免费| 欧美最新免费一区二区三区 | 国产精品电影一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩精品青青久久久久久| 97热精品久久久久久| 韩国av一区二区三区四区| 丰满的人妻完整版| 极品教师在线视频| av中文乱码字幕在线| 桃红色精品国产亚洲av| 少妇高潮的动态图| 一个人免费在线观看电影| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美3d第一页| 国内精品美女久久久久久| 免费看美女性在线毛片视频| 麻豆一二三区av精品| 久久这里只有精品中国| 首页视频小说图片口味搜索| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| 深夜a级毛片| av女优亚洲男人天堂| h日本视频在线播放| 九九热线精品视视频播放| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲国产欧美人成| 一本精品99久久精品77| 亚洲美女黄片视频| 免费在线观看亚洲国产| 大型黄色视频在线免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 一个人看的www免费观看视频| a级毛片a级免费在线| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲欧美精品综合久久99| 1000部很黄的大片| 欧美成狂野欧美在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 成人特级av手机在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美日韩综合久久久久久 | 美女cb高潮喷水在线观看| 日韩国内少妇激情av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲综合色惰| 亚洲不卡免费看| 精品久久久久久,| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 麻豆久久精品国产亚洲av| 老鸭窝网址在线观看| 一本综合久久免费| 有码 亚洲区| 久久人妻av系列| 午夜福利欧美成人| 欧美成人免费av一区二区三区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲电影在线观看av| 老鸭窝网址在线观看| 国产免费男女视频| a级毛片a级免费在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产伦精品一区二区三区视频9| 又爽又黄无遮挡网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 美女免费视频网站| x7x7x7水蜜桃| 嫩草影视91久久| 一本一本综合久久| 亚洲一区二区三区色噜噜| 中亚洲国语对白在线视频| 免费看光身美女| 极品教师在线免费播放| 国产熟女xx| 有码 亚洲区| 99热这里只有是精品50| 日本精品一区二区三区蜜桃| 淫妇啪啪啪对白视频| 一进一出好大好爽视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩欧美精品v在线| 免费在线观看成人毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久99久视频精品免费| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 青草久久国产| 午夜两性在线视频| 日本一二三区视频观看| 国产精品久久久久久久电影| 男人的好看免费观看在线视频| 婷婷精品国产亚洲av| а√天堂www在线а√下载| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 欧美色欧美亚洲另类二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 毛片女人毛片| 欧美日韩黄片免| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品不卡国产一区二区三区| 97热精品久久久久久| 国产黄片美女视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品福利观看| 久久久久国内视频| 熟女电影av网| 在现免费观看毛片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲成人免费电影在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 日本成人三级电影网站| 桃红色精品国产亚洲av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 午夜老司机福利剧场| .国产精品久久| 欧美zozozo另类| 一本综合久久免费| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美高清成人免费视频www| 十八禁网站免费在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产精品综合久久久久久久免费| 老鸭窝网址在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 宅男免费午夜| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 一区二区三区高清视频在线| 久久亚洲真实| 亚洲,欧美,日韩| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品人妻少妇| 亚洲五月婷婷丁香| 麻豆久久精品国产亚洲av| 麻豆国产av国片精品| 一区二区三区激情视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 91字幕亚洲| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲专区中文字幕在线| 国产视频内射| 色在线成人网| 免费看日本二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 性欧美人与动物交配| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 99久久精品国产亚洲精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 极品教师在线视频| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久中文看片网| 观看免费一级毛片| 亚洲内射少妇av| 麻豆一二三区av精品| 淫秽高清视频在线观看| 内射极品少妇av片p| 国产三级黄色录像| 男女那种视频在线观看| 久久人人精品亚洲av| 男女视频在线观看网站免费| 91在线观看av| 一a级毛片在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 免费大片18禁| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲av.av天堂| 99热这里只有精品一区| 久久久久久九九精品二区国产| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 少妇的逼水好多| 欧美黄色片欧美黄色片| 中出人妻视频一区二区| 波多野结衣高清无吗| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲av二区三区四区| 偷拍熟女少妇极品色| 脱女人内裤的视频| www.色视频.com| 精品日产1卡2卡| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲国产精品合色在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人美女网站在线观看视频| 热99在线观看视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩免费av在线播放| 亚洲欧美激情综合另类| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲天堂国产精品一区在线| 麻豆国产97在线/欧美| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 观看美女的网站| 99久久九九国产精品国产免费| 国模一区二区三区四区视频| 精品一区二区三区人妻视频| aaaaa片日本免费| 久久国产乱子免费精品| av黄色大香蕉| 长腿黑丝高跟| 亚洲成av人片在线播放无| 超碰av人人做人人爽久久| 黄色配什么色好看| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久国产成人精品二区| 一区福利在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色av中文字幕| 久久中文看片网| av专区在线播放| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 高清毛片免费观看视频网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品久久久久久久久免 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 日本 av在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产午夜精品论理片| 久久亚洲真实| 一区二区三区高清视频在线| 国产成人欧美在线观看| 草草在线视频免费看| 日本在线视频免费播放| 亚洲精品粉嫩美女一区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲激情在线av| 欧美潮喷喷水| 亚洲av第一区精品v没综合| 黄色配什么色好看| 在现免费观看毛片| 亚洲自拍偷在线| www.熟女人妻精品国产| 九色成人免费人妻av| 国产午夜精品论理片| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费人成在线观看视频色| 免费观看人在逋| 女同久久另类99精品国产91| 欧美xxxx性猛交bbbb| 五月伊人婷婷丁香| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲av一区综合| 亚洲专区国产一区二区| 国产成人av教育| 少妇丰满av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 露出奶头的视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 极品教师在线免费播放| 久久久久久久久久成人| 日韩欧美精品免费久久 | bbb黄色大片| 精品人妻偷拍中文字幕| 又爽又黄无遮挡网站| 久久精品国产清高在天天线| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久久久久久精品吃奶| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 91麻豆av在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 色综合婷婷激情| 欧美成人a在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲欧美精品综合久久99| 深夜精品福利| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久九九热精品免费| 亚洲美女黄片视频| av在线老鸭窝| 极品教师在线免费播放| 中文亚洲av片在线观看爽| 一级黄片播放器| 精品国产三级普通话版| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 69av精品久久久久久| 999久久久精品免费观看国产| 欧美黄色淫秽网站| 男女床上黄色一级片免费看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 国产真实伦视频高清在线观看 | 不卡一级毛片| 91麻豆av在线| 变态另类丝袜制服| 婷婷亚洲欧美| 国产成人av教育| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品不卡国产一区二区三区| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久久国产成人免费| 少妇丰满av| 看片在线看免费视频| 亚洲精华国产精华精| 久久欧美精品欧美久久欧美| 一本精品99久久精品77| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 一区二区三区免费毛片| av中文乱码字幕在线| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲中文字幕日韩| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费高清视频大片| 黄色一级大片看看| 51国产日韩欧美| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 9191精品国产免费久久| 桃红色精品国产亚洲av| 搡老岳熟女国产| 国产欧美日韩精品一区二区| 最近最新免费中文字幕在线| 免费看a级黄色片| 国产成人a区在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲精品色激情综合| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产成人aa在线观看| 99久久精品热视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 一本一本综合久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 色综合婷婷激情| 午夜福利视频1000在线观看| www日本黄色视频网| 日日夜夜操网爽| 欧美成人a在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国内精品久久久久精免费| 岛国在线免费视频观看| 嫩草影视91久久| av在线老鸭窝| 99国产精品一区二区蜜桃av| 大型黄色视频在线免费观看| 老女人水多毛片| av视频在线观看入口| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 真实男女啪啪啪动态图| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品永久免费网站| 乱人视频在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲性夜色夜夜综合| av在线蜜桃| www.熟女人妻精品国产| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲专区中文字幕在线| 观看免费一级毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产精品一区二区性色av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 成人毛片a级毛片在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩欧美免费精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美激情在线99| 2021天堂中文幕一二区在线观| 99精品在免费线老司机午夜|