粉托鬼筆固體培養(yǎng)特性的研究*

陳蒙蒙，程顯好，封永繼

（1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025）

粉托鬼筆固體培養(yǎng)特性的研究*

陳蒙蒙1，程顯好2**，封永繼2

（1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025）

為探討粉托鬼筆（Phallus hadriani）在不同固體培養(yǎng)上的生長特性，采用固體培養(yǎng)基皿培法培養(yǎng)粉托鬼筆，研究不同固體培養(yǎng)基、不同碳源、不同氮源對粉托鬼筆的生長、菌絲形態(tài)、菌絲生長的影響。結(jié)果表明，粉托鬼筆菌絲體在不同固體培養(yǎng)基上均能生長，尤其是在麥麩固體培養(yǎng)基上生長最好。粉托鬼筆菌絲體對所試的不同碳源均能利用，而在以甘露糖、山梨醇、蔗糖、麥芽糖、木聚糖為碳源的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時生長速度較快。在所試的不同氮源中，對有機氮源均能利用，而無機氮源中只對硫酸銨利用較好，在以亞硝酸鈉和尿素為氮源的固體培養(yǎng)基上未見肉眼可辨的生長。

托粉鬼筆；固體培養(yǎng)；碳源；氮源；分子鑒定

粉托鬼筆 （Phallus hadriani） 隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）鬼筆目（Phallales）。鬼筆目作為一類食（藥）用菌，紅鬼筆和白鬼筆的子實體均已進行藥理實驗研究。紅鬼筆具有散毒和生肌的作用[1]。白鬼筆被制成興奮類藥物，對癌癥以及活血祛痛的治療有一定作用[2-3]。粉托鬼筆作為1種具有潛在藥用價值的食（藥）用菌，開發(fā)前景廣闊。

粉托鬼筆主要分布于我國山東、遼寧、吉林，在日本和歐洲也有分布[4]。粉托鬼筆由于分布稀少，野生采摘量較少，制約著對粉托鬼筆的藥理研究，因此，急迫需要開展粉托鬼筆菌絲體及子實體的栽培研究。主要對不同固體培養(yǎng)基、不同碳源和不同氮源對菌絲體形態(tài)及生長特性的影響進行了研究，為粉托鬼筆的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗材料和方法

1.1 菌種采集

本實驗所用粉托鬼筆標(biāo)本于2015年9月26日，采集于山東省蓬萊市大辛店鎮(zhèn)沙溝村的花生田間，包括菌蕾和子實體。

1.2 試劑

淀粉、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、木糖、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇、木聚糖、半乳糖、魚蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、亞硝酸鈉、尿素、瓊脂。其中試劑類為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁固體培養(yǎng)基：麥芽汁50 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然；胡蘿卜固體培養(yǎng)基：胡蘿卜（煮汁）200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然；PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯（煮汁）200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然；麥麩固體培養(yǎng)基：麥麩（煮汁） 30 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、KH2PO43 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然；GPY固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母浸粉10 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然；GPC固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨 6 g·L-1、玉米漿10 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然。

1.4 菌種分子鑒定與序列比對

參照Makimura等[5]的方法提取粉托鬼筆子實體樣品（切除子實體表面，取內(nèi)部組織）DNA和菌絲體DNA。按照劉等[6]的方法擴增ITS序列，采用真菌ITS通用引物 ITS1和ITS4，擴增ITS全長序列，得到的擴增產(chǎn)物送北京華大基因股份有限公司測序。

1.5 菌種分離

采用組織分離法分離菌種，將新鮮的子實體外面包被的膠質(zhì)膜用大量的無菌水沖洗至表面無泥沙和其他雜物，然后用75%的酒精擦拭表面，在無菌條件下，將膠質(zhì)膜切開，并將菌蓋一剖為二，用已滅菌的尖頭鑷子從剖面上取0.5 cm×0.5 cm的菌肉組織，置于PDA培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)；選取培養(yǎng)良好的菌絲，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基，反復(fù)純化，選取生長健壯的菌絲轉(zhuǎn)接到試管斜面PDA固體培養(yǎng)基，4℃低溫保存。

1.6 培養(yǎng)方法

采用試管斜面培養(yǎng)和培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)方式研究粉托鬼筆的固體培養(yǎng)特性。

將固體培養(yǎng)基分別倒入平板，凝固后鋪上已滅菌的單層玻璃紙，接種直徑6 mm的接種塊，25℃、避光培養(yǎng)，定期觀察菌落生長情況和菌落特征。

1.7 菌絲體生物量測定

將培養(yǎng)13 d的粉托鬼筆菌絲體從培養(yǎng)基表面的玻璃上刮下，每種培養(yǎng)基3個重復(fù)，稱濕重，置60℃烘干箱烘干至恒重，再稱干重即為生物量。

1.8 粉托鬼筆對碳源的利用試驗

在GPY固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別用2%的以下碳源代替2%的葡萄糖：果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、木糖、甘露糖、甘油、淀粉、甘露醇、木糖醇、山梨醇、木聚糖、半乳糖，制成的固體培養(yǎng)基平板接種粉托鬼筆菌絲之后，25℃條件下暗培養(yǎng)，定期觀察粉托鬼筆在以上碳源條件下的生長情況。

1.9 粉托鬼筆對氮源的利用試驗

在GPY固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別用以下0.6%的有機氮源代替0.6%蛋白胨：動物性氮源（魚蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨）、植物性氮源（大豆蛋白胨）。用以下0.2%的無機氮源代替0.6%的蛋白胨：亞硝酸鈉、硫酸銨、尿素。在各種不同氮源的培養(yǎng)基平板上接種粉托鬼筆之后，定期觀察粉托鬼筆在以上氮源條件下的生長情況。

1.10 粉托鬼筆在不同培養(yǎng)基上生長速度的測定

從第4天開始每隔3 d記錄菌落直徑及其生長情況，到13 d時結(jié)束，每種處理3個重復(fù)。比較在不同培養(yǎng)基上的菌落擴散速度。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定

子實體未成熟前為菌蕾（1.0 cm～6.5 cm），菌蕾成熟后變?yōu)榉奂t色，外層有1層膠質(zhì)膜包裹，中間含有膠質(zhì)液，最內(nèi)層包裹著未成熟的子實體。子實體成熟之后，菌蓋為圓錐形，網(wǎng)格狀。菌柄為柱形，中空（4.0 cm～6.0 cm）×（0.6 cm～2.5 cm），質(zhì)地像海綿，呈蜂窩狀。采集標(biāo)本經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為粉托鬼筆，見圖1。

采用rDNA ITS序列方法進行分子鑒定。將擴增的DNA片段送至北京華大基因股份有限公司進行測序，并將測得序列在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行Blastn同源性對比，根據(jù)Ident鑒定出該菌的種屬，鑒定結(jié)果見表1。

經(jīng)過測序，ITS序列的Ident為99%，確定該標(biāo)本子實體和菌絲體均為粉托鬼筆。

圖1 采集粉托鬼筆菌蕾及子實體標(biāo)本Fig.1 Promordium and fruiting body of Phallus hadriani

表1 子實體與菌絲體在BLASTN序列對比結(jié)果Tab.1 Fruiting body and morphology in BLASTN sequencealignment results

2.2 粉托鬼筆在不同培養(yǎng)基上的生長情況

在不同的培養(yǎng)基中，粉托鬼筆的生長速度與生長形態(tài)不同。菌絲在固體培養(yǎng)基上的生長速度和生物量順序均為麥麩培養(yǎng)基>胡蘿卜培養(yǎng)基>PDA培養(yǎng)基>麥芽汁培養(yǎng)基>GPY培養(yǎng)基>GPC培養(yǎng)基，見表2。菌絲在不同固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)出的形態(tài)特征見圖2。

表2 粉托鬼筆在13 d時6種培養(yǎng)基上的生長特性Tab.2 Growth characteristics of Phallus hadriani on six medium in thirth day

從表2可以看出，在麥麩固體培養(yǎng)基中菌種擴散徑向距離為7.75 cm，生物量達75.8 mg，為最適合培養(yǎng)粉托鬼筆的固體培養(yǎng)基。在麥芽汁培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上，氣生菌絲體不發(fā)達，呈匍匐狀緊貼在培養(yǎng)基表面；在麥麩培養(yǎng)基上，氣生菌絲體發(fā)達，均勻向周圍生長；在GPY培養(yǎng)基和GPC培養(yǎng)基上，氣生菌絲體較發(fā)達，呈絨毛狀。在培養(yǎng)的13 d內(nèi)，粉托鬼筆氣生菌絲的顏色均為雪白色。

2.3 碳源對粉托鬼筆生長的影響

不同碳源對粉托鬼筆菌絲體生長情況影響見表3。

粉托鬼筆在多種碳源中均能生長，說明其對碳源的的適應(yīng)性較強。在不同碳源條件下，其生長速度和氣生菌絲形態(tài)也有所差異。

粉托鬼筆在不同碳源的固體培養(yǎng)基上的生長速度依次為甘露糖>山梨醇>蔗糖>麥芽糖>木聚糖>果糖>半乳糖>乳糖>木糖>木糖醇>甘露醇>甘油>淀粉。在以果糖、半乳糖、乳糖、木糖醇、甘露醇、甘油為碳源的固體培養(yǎng)基中，雖然其菌絲體生長速度較慢，但是其氣生菌絲生長致密、較發(fā)達。在以木聚糖為碳源的固體培養(yǎng)基中，其菌絲體生長速度較快，且其氣生菌絲體也比較致密、發(fā)達。

2.4 氮源對粉托鬼筆生長的影響

不同氮源對粉托鬼筆的菌絲體的固體培養(yǎng)的生長特性見表4。

粉托鬼筆在多種有機氮源的固體培養(yǎng)基中均能生長。在動物性氮源（魚蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨）培養(yǎng)基上菌絲體沒有明顯的差別，其生長速度較慢，氣生菌絲致密、較發(fā)達。在植物性氮源（大豆蛋白）中，不僅其生長速度慢，而且氣生菌絲比較稀疏、不發(fā)達。在無機氮源中，以亞硝酸鈉、硫酸銨、尿素相比較，粉托鬼筆菌絲體在硫酸銨上生長速度較快，所以硫酸銨較適合粉托鬼筆菌絲體的固體培養(yǎng)；而在以亞硝酸鈉和尿素為氮源的固體培養(yǎng)基上未見肉眼可辨的菌絲體生長。

2.5 粉托鬼筆菌絲體在固體培養(yǎng)基上菌落的生長特性粉托鬼筆菌絲體在不同培養(yǎng)上生長初期均能生長且菌絲顏色呈雪白色，但是隨著培養(yǎng)時間的延長，其菌絲體逐漸老化，逐漸呈現(xiàn)淡粉色，菌絲體也逐漸失去水分。見圖3。

3 討論

粉托鬼筆菌絲體在不同的固體培養(yǎng)基上均能生長，對營養(yǎng)的要求并不苛刻，對碳源、氮源的適應(yīng)性也較強，這也是其能在自然界長期生存繁衍的重要原因。

圖3 粉托鬼筆菌絲體Fig.3 Mycelium of Phallus hadriani

在所有供試培養(yǎng)基中，粉托鬼筆菌絲體在麥麩固體培養(yǎng)基中生長速度最快，氣生菌絲生長較致密、發(fā)達，為最適固體培養(yǎng)基。在所試碳源中，粉托鬼筆菌絲體均能生長，說明其對碳源適應(yīng)較強，在以甘露糖為碳源的固體培養(yǎng)基上生長最好。在所試氮源中，粉托鬼筆菌絲體在有機氮源的固體培養(yǎng)基上均能生長，在無機氮源中只有在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中生長，在以亞硝酸鈉和尿素為氮源的的固體培養(yǎng)基上未見肉眼可辨的菌絲生長。

粉托鬼筆作為一種潛在藥用價值的藥用菌，具有很大的開發(fā)前景。目前，由于粉托鬼筆的分布較少，野生采摘量比較少，對粉托鬼筆的藥理研究比較困難，因此，對粉托鬼筆的子實體的栽培有待進一步的研究。

[1]宋吉玲，陸娜，閆靜，等.紅鬼筆、蛇頭菌和五棱散尾鬼筆的區(qū)別與用途[J].杭州農(nóng)業(yè)與科技，2015（5）：48.

[2]Niksic M,Hadzic I,Glisic M.Is Phallus impudicus a mycological giant[J].Mycologist,2004,18(1):21-22.

[3]李泰輝，宋斌，吳興亮,等.滇黔桂鬼筆科研究[J].貴州科學(xué),2004,22(1):80-89.

[4]王建瑞，圖力古爾.吉林省擔(dān)子菌補記（六）[J].菌物研究，2004（4）：40-43.

[5]Makimura K,Murayama YS,Yamaguchi H.Detection of a wide range of medically im portant fungal species by polymerase chain reaction(PCR)[J].Journal of Medical Microbiology,1994(40):358-364.

[6]劉貴巧，何華奇，王建明.一株野生食用菌株的種類鑒定研究[J].北方園藝，2014(12)：118-121.

Cultural Characteristics of Phallus hadriani Grown on Different Solid Media

CHEN Meng-meng1,CHENG Xian-hao2,FENG Yong-ji2
(1.College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China; 2.College of Agriculture,Ludong University,Yantai 264025,China)

To explore the cultural characteristics of Phallus hadriani on solid media,we used soild agar medium to culture P. hadriani.Effects of different soild media,carbon sources,and nitrogen sources on growth and morphology of P.hadriani were explored.Mycelial growth rate was most rapid on a medium containing an aqueous extract of malt(malt liquor).P.hadriani were grew better when mannose,sorbitol,sucrose,maltose and xylan was carbon sources in soild media.Organic nitrogen sources can be used by P.hadriani.P.hadriani were grew better when ammonium sulfate was nitrogen sources,but there were no growth when sodium nitrite and carbamide was nitrogen sources.

Phallus hadriani;solid culture;carbon source;nitrogen source;molecular identification

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0020-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.006

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊（魯農(nóng)科技字 [2016]18號）。

陳蒙蒙（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向為生物資源保護與利用。E-mail:cmmmlyn@163.com

**通信作者：程顯好（1966-），男，博士，教授，主要從事食（藥）用真菌產(chǎn)品研發(fā)。E-mail:chengxianhao@sohu.com

2017-01-22