當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘Balb/c小鼠Th1/Th2及Th17/Treg的影響及機(jī)制研究

馬婷婷+馮興中+王學(xué)艷

[摘要] 當(dāng)歸是臨床常用中藥，具有補(bǔ)陰養(yǎng)血、活血潤(rùn)燥的功能。為研究當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘Balb/c小鼠Th1/Th2及Th17/Treg的影響及機(jī)制，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)卵清白蛋白加甲狀腺素復(fù)制陰虛哮喘Balb/c小鼠模型，造模同時(shí)分別給予地塞米松（DXM）、當(dāng)歸提取液、當(dāng)歸提取液+DXM灌胃處理，HE染色進(jìn)行肺組織病理學(xué)檢查，ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4，IL-17，IFN-γ，TGF-β水平及維甲酸受體相關(guān)孤兒受體（RORγt）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，當(dāng)歸可顯著減輕肺組織炎癥浸潤(rùn)程度，升高IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值，降低肺組織中RORγt的表達(dá)強(qiáng)度，當(dāng)歸與DXM配伍的治療效果最為顯著。提示，當(dāng)歸可通過(guò)抑制肺組織RORγt表達(dá)、調(diào)節(jié)Th1/Th2及Th17/Treg的功能平衡，改善氣道的炎癥狀態(tài)，發(fā)揮對(duì)陰虛型哮喘的治療作用。

[關(guān)鍵詞] 當(dāng)歸；陰虛哮喘；Balb/c小鼠；Th1/Th2；Th17/Treg

[Abstract] Angelicae Sinensis Radix， with nourishing Yin， promoting blood circulation， and moisturizing dryness functions， is commonly used in clinical medicine. In order to investigate the effects and mechanism of Angelica sinensis（AS） on Th1/Th2 and Th17/Treg in mice with asthma and Yin deficiency syndrome， asthmatic and Yin deficiency syndrome Balb/c mice models were established by injecting and inhaling ovalbumin（OVA） and thyroxin. The models were treated with dexamethasone（DXM）， AS extract and AS extract+DXM， respectively. Pathological examination of lung tissues was conducted by HE staining， and ELISA was used to detect the levels of IL-4， IL-17， IFN-γ， TGF-β as well as retinoic acid receptor-related orphan receptor （RORγt）. Results showed that AS could significantly improve the situation of inflammation infiltration， increase ratios of IFN-γ/IL-4 and TGF-β/IL-17， decrease the levels of RORγt in lung tissues. The AS+DXM group showed a best treatment effect. The results indicated that AS played a therapeutic role for asthma with Yin deficiency syndrome and improved airway inflammation by inhibiting the expression of RORγt in lung tissues and regulating the balance of Th1/Th2 and Th17/Treg.

[Key words] Angelicae Sinensis Radix； asthma with Yin deficiency syndrome； Balb/c mouse； Th1/Th2； Th17/Treg

哮喘（asthma）是我國(guó)臨床中常見的一種呼吸系統(tǒng)疾病，其臨床發(fā)作具有周期性、反復(fù)性、遷延不愈的特點(diǎn)[1-2]。2013年哮喘流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)大陸地區(qū)哮喘總患病率高達(dá)1.24%，嚴(yán)重威脅公眾健康[3]。研究表明，哮喘發(fā)病的主要病理學(xué)機(jī)制是輔助性T細(xì)胞（Th）亞群的免疫功能失調(diào)，其中，Th1/Th2與Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的功能平衡是影響呼吸道炎性因子分泌及促炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素[4-5]。近年來(lái)，中藥以其多途徑、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的特點(diǎn)在臨床哮喘的治療中取得優(yōu)勢(shì)。當(dāng)歸（Angelica sinensis，AS）為補(bǔ)血養(yǎng)陰活血的常用中藥之一，《本草經(jīng)疏》記載當(dāng)歸有“主咳逆上氣”之功效[6]，以往實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)支氣管平滑肌有明顯的解痙作用[7]。然而，當(dāng)歸對(duì)機(jī)體T細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚未完全明確。本研究通過(guò)復(fù)制陰虛哮喘Balb/c小鼠模型，研究當(dāng)歸對(duì)Th1/Th2及Th17/Treg細(xì)胞因子的影響，探討當(dāng)歸治療哮喘的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，為當(dāng)歸用于臨床哮喘的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物與試劑 50只雌性Balb/c小鼠，周齡（7.2±0.8）周，體重（20.15±1.62） g，供應(yīng)單位為北京中醫(yī)藥大學(xué)，合格證0014036，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0024。當(dāng)歸提取液由上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020419）。致敏試劑卵清白蛋白（OVA）購(gòu)自美國(guó)Grade V Sigma公司（批號(hào)101069301）。甲狀腺片購(gòu)自山東中泰藥業(yè)有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字H37021712，批號(hào)14080303），地塞米松磷酸鈉注射液（DXM）由河南科倫藥業(yè)有限公司提供（國(guó)藥準(zhǔn)字H41023598，批號(hào)13011911），ELISA細(xì)胞因子試劑盒購(gòu)自R&D systems（美國(guó)），免疫組化試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)AD082522）。

1.2 動(dòng)物模型制備 50只Balb/c小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法平均分為5組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、陰虛哮喘組、地塞米松組、當(dāng)歸組及當(dāng)歸+地塞米松組。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，使用溶質(zhì)為OVA 1 mg和氫氧化鋁凝膠100 mg的生理鹽水混懸液制備哮喘致敏液，除對(duì)照組外，所有小鼠均給予2次致敏液1 mL腹腔注射行全身致敏處理，注射時(shí)間間隔為1周（1 d，8 d）。全身致敏1周后（15 d）起，所有小鼠霧化吸入1%OVA行呼吸道致敏，隔日致敏1次，對(duì)照組不進(jìn)行致敏處理，采用生理鹽水代替致敏藥物行腹腔注射及霧化吸入。給予DXM組、當(dāng)歸組及當(dāng)歸+DXM組小鼠DXM（0.5 mg·kg-1）、當(dāng)歸提取液（4 g·kg-1）、當(dāng)歸提取液+DXM（4 g·kg-1+0.5 mg·kg-1）灌胃處理，對(duì)照組及陰虛哮喘組以20 mL·kg-1生理鹽水灌胃處理，霧化激發(fā)及藥液灌胃均連續(xù)28 d。實(shí)驗(yàn)第29天開始，各組小鼠藥液灌胃后8 h給予甲狀腺素120 mg·kg-1（采用0.5%黃原膠助懸）灌胃處理制備陰虛模型，1次/d，連續(xù)14 d，對(duì)照組給予0.5%黃原膠對(duì)照液灌胃處理[8-9]。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的收集 實(shí)驗(yàn)第43天，將小鼠麻醉處理后氣管插管，結(jié)扎左支氣管，使用生理鹽水反復(fù)灌洗右側(cè)支氣管肺泡并記錄每次灌洗液回收量，3次灌洗液回收率均大于80%，提取各組BALF約2.5 mL/鼠離心處理（2 000 r·min-1，10 min），將上清液儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?chǔ)存溫度為-80 ℃。

1.4 細(xì)胞因子檢測(cè) 所有BALF上清液收集完畢后，于4 ℃條件下解凍，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書的操作方法，分別檢測(cè)各組Balb/c小鼠致敏前后及藥劑處理前后細(xì)胞因子IL-4，IL-17，IFN-γ，TGF-β水平。取所有灌洗液沉淀涂片，瑞士染色后采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行炎性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.5 肺組織病理學(xué)改變及免疫組化檢測(cè) 將未經(jīng)灌洗的左肺組織制作石蠟切片，根據(jù)免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色后，在高倍鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變及維甲酸受體相關(guān)孤兒受體（RORγt）的表達(dá)情況，對(duì)肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行半定量檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將整理后的所有檢測(cè)數(shù)據(jù)錄入SPSS 19.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用±s表示，組間數(shù)據(jù)檢驗(yàn)采用單因素方差分析，等級(jí)資料比較采用Ridit分析，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠BALF沉淀中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較 采用甲狀腺素及OVA致敏后，陰虛哮喘組小鼠BALF沉淀中炎性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞較對(duì)照組均顯著升高（P<0.01），經(jīng)當(dāng)歸及DXM治療后，炎癥浸潤(rùn)情況明顯減弱（P<0.05，P<0.01），其中，當(dāng)歸+DXM組小鼠嗜酸粒細(xì)胞水平低于當(dāng)歸組及DXM組（P<0.05），見表1。

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變的比較 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠肺組織病理變化不明顯，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理變化：氣道上皮細(xì)胞腫脹、部分脫落，基底膜較厚，支氣管壁充血、結(jié)構(gòu)模糊。經(jīng)DXM和當(dāng)歸干預(yù)后，上述肺組織病理學(xué)變化得到不同程度的緩解。對(duì)肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行半定量分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸+DXM組與陰虛哮喘組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1，表2。

2.3 各組小鼠BALF中細(xì)胞因子水平的比較 對(duì)各組小鼠BALF中促炎因子IL-4，IL-17及炎癥抑制因子IFN-γ，TGF-β的水平進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)顯示，采用OVA及甲狀腺素致敏處理后，小鼠BALF中促炎因子水平均顯著高于對(duì)照組且炎癥抑制因子水平明顯下降（P<0.01，P<0.05）。經(jīng)當(dāng)歸及DXM處理后，3組藥劑組小鼠BALF中促炎因子水平降低且炎癥抑制因子明顯回升（P<0.05，P<0.01）。其中，當(dāng)歸+DXM組細(xì)胞因子水平明顯優(yōu)于DXM組（P<0.05），見表3。

2.4 各組小鼠BALF中IFN-γ/IL-4，TGF-β/IL-17的比較 經(jīng)OVA及甲狀腺素致敏處理后，陰虛哮喘組小鼠IFN-γ/IL-4與TGF-β/IL-17的比值較對(duì)照組

出現(xiàn)顯著降低（P<0.01），表明此時(shí)小鼠存在明顯的Th1/Th2及Th17/Treg功能失衡。3組藥劑組小鼠BALF中兩者的比值較陰虛哮喘組均有回升（P<0.05，P<0.01），其中，當(dāng)歸+DXM組小鼠的比值為全組最高水平（P<0.05），見表4。

2.5 各組小鼠肺組織中RORγt表達(dá)的比較 檢測(cè)小鼠肺組織中RORγt的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)陰虛哮喘組小鼠肺組織中RORγt的表達(dá)強(qiáng)度最高（P<0.01），經(jīng)不同藥劑處理后，RORγt的表達(dá)較陰虛哮喘組均出現(xiàn)明顯減弱（P<0.01），其中，當(dāng)歸+DXM組RORγt的表達(dá)明顯低于DXM組（P<0.05），見表5。

3 討論

哮喘又稱為支氣管哮喘，是一種以氣道慢性炎癥、黏液高分泌及氣道重塑為主要病理生理特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[10-11]。近年來(lái)，我國(guó)哮喘的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)[12]，發(fā)病時(shí)，患者由于嗜酸性粒細(xì)胞及多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)氣道引起的過(guò)敏反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性而出現(xiàn)一系列喘息、胸悶等可逆性呼吸氣流限制癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性呼吸衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及身體健康[13]。

Th1/Th2功能失調(diào)是目前被普遍認(rèn)同的哮喘發(fā)病的核心免疫機(jī)制[14]，Th2型免疫反應(yīng)增強(qiáng)而Th1型免疫反應(yīng)減弱，IL-4的高表達(dá)降低了炎癥抑制因子IFN-γ的活性，使患者血IgE濃度增加及氣道嗜酸性粒細(xì)胞聚集，導(dǎo)致支氣管平滑肌痙攣及氣道通氣功能下降[15-16]。近期研究中發(fā)現(xiàn)[17]，除Th1與Th2之外，Th17與Treg在正常機(jī)體中相互制約而處于平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到致敏原刺激處于超敏反應(yīng)狀態(tài)時(shí)，Th17與Treg的功能平衡被打破，Th17的特征性細(xì)胞因子IL-17分泌增多，導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞趨化聚集于氣道，進(jìn)一步促進(jìn)并加重氣道的促炎癥反應(yīng) [18-19]。Treg細(xì)胞通過(guò)分泌TNF-β抑制嗜酸性粒細(xì)胞的活化，減少Th2細(xì)胞促炎癥因子的分泌從而緩解氣道炎癥，抑制哮喘反應(yīng)的發(fā)生[17，20]。

當(dāng)歸是臨床常用的中藥，具有補(bǔ)陰養(yǎng)血、活血潤(rùn)燥的功能，臨床廣泛應(yīng)用于包括呼吸系統(tǒng)在內(nèi)的各種疾病。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，當(dāng)歸味甘而重，故專能補(bǔ)血養(yǎng)陰，其氣輕而辛，故又能行血，補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)，為陰分血中之要藥?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，當(dāng)歸對(duì)痙攣的支氣管平滑肌具有明顯的解痙作用[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用OVA與甲狀腺素復(fù)制陰虛哮喘小鼠模型，致敏后，陰虛哮喘組小鼠BALF中IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值顯著降低，出現(xiàn)明顯的Th1/Th2及Th17/Treg功能失調(diào)。當(dāng)歸治療后，BALF中IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值較陰虛哮喘組明顯回升，其中，當(dāng)歸+DXM小鼠BALF中細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯優(yōu)于DXM組及當(dāng)歸組，提示當(dāng)歸與DXM配伍可表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用，通過(guò)改變Th1/Th2及Th17/Treg的功能平衡，提高激素對(duì)陰虛哮喘的療效，實(shí)現(xiàn)平喘作用。

哮喘的發(fā)病與演變是多種炎性細(xì)胞共同參與的結(jié)果，以往研究報(bào)道，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)引起的氣道過(guò)敏反應(yīng)造成氣道的高反應(yīng)狀態(tài)，而氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞集聚增多可作為哮喘急性加重的標(biāo)志[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸組小鼠BALF中炎性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞較陰虛哮喘組明顯降低，當(dāng)歸+DXM小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞明顯低于DXM組，表明當(dāng)歸有助于緩解氣道炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善氣道炎癥及超敏狀態(tài)。

轉(zhuǎn)錄因子RORγt在哮喘的免疫致敏過(guò)程中可促進(jìn)Th17的分化與激活并發(fā)揮與IL-17的協(xié)同作用[17，23]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠肺組織中RORγ進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陰虛哮喘小鼠肺組織中RORγt的表達(dá)明顯增強(qiáng)，當(dāng)歸處理后肺組織中RORγt的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，當(dāng)歸+DXM組小鼠RORγt的表達(dá)明顯低于DXM組，提示當(dāng)歸可通過(guò)抑制肺組織中RORγt的高表達(dá)，降低Th17細(xì)胞活性，平衡Th17/Treg功能，成為當(dāng)歸改善氣道炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。

綜上，當(dāng)歸可通過(guò)抑制肺組織RORγt的高表達(dá)、調(diào)節(jié)Th1/Th2及Th17/Treg的免疫功能平衡，緩解氣道的炎癥狀態(tài)，提高氣道通氣功能并最終改善哮喘，為臨床哮喘的輔助用藥方案提供了新思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Izuhara K， Ohta S， Shiraishi H， et al. The mechanism of mucus production in bronchial asthma [J]. Curr Med Chem， 2009， 16（22）： 2867.

[2] 陳偉斌， 黃勛， 姚敏.辛蒼湯鼻腔灌洗對(duì)哮喘兒童緩解期細(xì)胞因子的調(diào)控作用[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 37（3）：272.

[3] 王嵩， 郤慶.中藥對(duì)小鼠哮喘模型T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志， 2014， 24（11）：1578.

[4] 龔臣， 鄧靜敏.Th17/Treg在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用及研究進(jìn)展[J].中華哮喘雜志（電子版）， 2013， 7（3）：201.

[5] Pelaia G， Vatrella A， Maselli R. The potential of biologics for the treatment of asthma[J]. Nat Rev Drug Discov， 2012， 11（12）： 958.

[6] 王志旺， 藺興遙， 任遠(yuǎn)，等.當(dāng)歸精油對(duì)哮喘模型大鼠的平喘作用及其對(duì)IL-10、IL-17A的影響[J].中藥藥理與臨床， 2015， 31（3）：76.

[7] 吳國(guó)泰， 任遠(yuǎn)， 王鋒， 等.當(dāng)歸揮發(fā)油不同部位對(duì)豚鼠離體氣管平滑肌的作用及機(jī)制研究[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011， 28（4）：1.

[8] 王志旺， 妥海燕， 任遠(yuǎn)， 等.BALB/c小鼠陰虛型過(guò)敏性哮喘模型的建立與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志， 2016， 23（9）：61.

[9] 賀玉偉， 柴程芝， 寇俊萍， 等.甲狀腺素誘導(dǎo)小鼠模型表觀指征變化與陰虛火旺證的相關(guān)性研究[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)， 2013， 30（2）：1.

[10] 王志旺， 妥海燕， 任遠(yuǎn)，等.當(dāng)歸對(duì)陰虛哮喘小鼠模型Th17優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答的影響[J]. 免疫學(xué)雜志， 2016（1）：38.

[11] 陳旭央， 張冰， 胡莉蔓.IL-17、IL-33在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2015（16）：29.

[12] 張春霞， 陳柏諭.IL-33與兒童常見自身免疫性疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].臨床兒科雜志， 2014， 32（5）：491.

[13] 韓文寧， 李錦亮.咳嗽變異性哮喘患者白細(xì)胞介素-4， 5及IgE水平的變化[J].中國(guó)生育健康雜志， 2013， 24（2）： 615.

[14] Borish L， Steinke J W. Interleukin-33 in asthma： how big of a role does it play？ [J]. Curr All Asthma Rep， 2011， 11（1）： 7.

[15] Liew F Y， Pitman N I， McInnes I B. Disease-associated functions of IL-33： the new kid in the IL-1 family [J]. Nat Rev Immunol， 2010， 10（2）： 103.

[16] Lloyd C M. IL-33 family members and asthma-bridging innate and adaptive immune responses[J]. Curr Opin Immunol， 2010， 22（6）： 800.

[17] 李燕， 謝敏， 史小玲，等. HSP70/C D80 DNA疫苗通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2/Treg/Th17細(xì)胞對(duì)小鼠急性哮喘的抑制作用[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版， 2014， 52（10）：20.

[18] 趙燕， 程曉明， 王長(zhǎng)征，等.Th17應(yīng)答在哮喘發(fā)病機(jī)制中作用的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)， 2013， 42（2）：216.

[19] Smith D E. IL-33： a tissue derived cytokine pathway involved in allergic inflammation and asthma [J]. Clin Experiment All， 2010， 40（2）： 200.

[20] Ji N F， Xie Y C， Zhang M S， et al. Ligustrazine corrects Th1/Th2 and Treg/Th17 imbalance in a mouse asthma model [J]. Int Immunopharmacol， 2014， 21（1）： 76.

[21] 龔臣，鄧靜敏.Th17/Treg 在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用及研究進(jìn)展[J].國(guó)際呼吸雜志，2013，33（9）：684.

[22] Dahia P L， Aguiar R C， Alberta J， et al. PTEN is inversely correlated with the cell survival factor Akt/PKB and is inactivated via multiple mechanismsin haematological malignancies[J]. Hum Mol Genet， 1999， 8（2）： 185.

[23] 馬佳佳， Nick Lu， 陳必良. 轉(zhuǎn)錄因子RORγt對(duì)妊娠期哮喘模型小鼠 Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)作用[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 37（6）： 561.