梔子藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)研究

肖日傳+苗琦+羅光明+袁源見+張風(fēng)波+謝晶+李波

[摘要] 采集來自全國各地不同商品等級野生和栽培的梔子樣品，以D65光源、圖像信息收集軟件提取果皮顏色的色澤數(shù)據(jù)，利用數(shù)顯游標(biāo)卡尺對梔子飽滿度信息進(jìn)行量化，用高效液相色譜法測定梔子6種成分的含量，利用兩步聚類分析和對應(yīng)分析等統(tǒng)計方法對10個指標(biāo)進(jìn)行了分類比較，確定各傳統(tǒng)鑒別主征的顯著性和重要程度，建立梔子藥材傳統(tǒng)商品規(guī)格分類與果皮顏色的多重對應(yīng)關(guān)系，探索果皮顏色與活性成分指標(biāo)的相關(guān)性，為梔子藥材商品規(guī)格等級的合理劃分提供依據(jù)。經(jīng)過分析，藥材可分為2類且有顯著的區(qū)分意義，果皮顏色傳統(tǒng)判別主征的重要性大于飽滿度，對梔子的一、二等品能進(jìn)行較為準(zhǔn)確的區(qū)分。該研究補充并重建了梔子商品規(guī)格等級的劃分標(biāo)準(zhǔn)，同時制定了梔子等級快速評判的方案，為梔子藥材品質(zhì)的綜合評價提供了新途徑和新思路。

[關(guān)鍵詞] 梔子； 商品規(guī)格等級； 傳統(tǒng)鑒別主征； 兩步聚類分析； 品質(zhì)

[Abstract] Collecting different commodity grade Gardenia jasminoides of wild and cultivated varieties all over the country， obtaining color information from each batch of G. jasminoides by the standard D65 light source and image acquisition system， quantifing the gardenia plumpness information by the digital display vernier caliper， determinating 6 kinds of effective components of G. jasminoides by HPLC， classifing from ten indicators by two step clustering analysis and correspondence analysis method of statistics， clearing the importance of the traditional identification indexes， establishing multiple corresponding relation between the skin color and commercial specification of G. jasminoides，exploring the correlation of the skin color and chemical composition， to provide the reference for the reasonable division of commercial specifications and grades of G. jasminoides. Medicine is divided into two classes and has obvious distinguish meaning， The importance of the skin color is greater than the plumpness in traditional identification characteristics， it can accurately distinguish the specifications of G. jasminoides. We improve and rebuild the standard of commodity specifications and grades of Gardenia jasminoides Ellis and establish the rapid evaluation method by the study， it provide a new way and idea for the comprehensive evaluation of G. jasminoides quality.

[Key words] Gardenia jasminoides； commercial grade； traditional identification of the main character； two step clustering analysis； quilaty

中藥材商品規(guī)格的出現(xiàn)有效的改善了市場流通中藥材定價原則混亂的情況，為按質(zhì)論價奠定了基礎(chǔ)，也一定程度上保證了臨床用藥的安全有效，但是中藥材規(guī)格等級劃分以感官判斷為依據(jù)，沒有一個準(zhǔn)確的尺度，劃分等級因人而異，且藥材經(jīng)營人員因為一己私欲，刻意改變藥材的外觀性狀，常常在藥材處理過程中作有害處理，達(dá)到以次充好甚至以假換真的非法目的，如用工業(yè)染料人為改變藥材外觀顏色、用硫磺熏蒸藥材提高藥材外觀色澤、用氯化鈣改變藥材重量等，上述種種現(xiàn)象嚴(yán)重制約藥材市場的健康發(fā)展，并且不利于患者的生命健康。

梔子是茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實，有瀉火除濕，清熱利濕，涼血解毒的功效[1]。目前梔子藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)主要以梔子果的成熟程度、是否飽滿和色澤深淺劃分為兩個等級[2]，關(guān)于現(xiàn)有梔子藥材商品規(guī)格劃分標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)尚未見文獻(xiàn)報道。1958年前，中藥材等級劃分太過詳細(xì)，不利于中藥材在市場的流通，1958年后，為了節(jié)省人力物力，簡化中藥材等級規(guī)格，藥材公司做了一系列努力，先后有了《38種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》、《54種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》，到最后1984年頒布的《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[3]，然而隨著時間推移，藥材經(jīng)營逐漸進(jìn)入市場機制，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)已然無法滿足市場需求，停滯的標(biāo)準(zhǔn)研究不利于藥材市場的健康發(fā)展，也不利于臨床安全用藥，因此亟需改善。本研究以全國各主產(chǎn)區(qū)、次要產(chǎn)區(qū)栽培和野生的梔子藥材為研究對象，基于傳統(tǒng)鑒別外觀量化數(shù)據(jù)和藥效成分內(nèi)在品質(zhì)多個指標(biāo)，利用現(xiàn)代統(tǒng)計學(xué)方法對現(xiàn)有商品規(guī)格等級劃分的合理性和科學(xué)性進(jìn)行了驗證，改進(jìn)了現(xiàn)有梔子商品等級標(biāo)準(zhǔn)，初步制定梔子等級快速評判的方法，對完善其商品規(guī)格評價體系有重大意義，為其他藥材等級標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 梔子藥材來自江西、浙江、湖南等13個省區(qū)，已覆蓋梔子道地產(chǎn)區(qū)、藥材主產(chǎn)地、GAP基地、主要藥材市場、藥店，共收集77份。經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院葛菲教授鑒定為中藥材梔子G. jasminoides。

1.2 梔子傳統(tǒng)鑒別指標(biāo)的測量

1.2.1 果皮顏色指標(biāo)的提取 藥材的買賣過程中，藥材的外觀是最為直觀的感官評價，所以果皮顏色是區(qū)分梔子優(yōu)劣的關(guān)鍵主征[4]。以D65標(biāo)準(zhǔn)光源避光環(huán)境下隨機選取20顆梔子拍攝藥材，用Adobe Photoshop15.0分別讀入各批藥材照片文件，讀取梔子的色澤指標(biāo)數(shù)據(jù)L，a，b。

1.2.2 果實飽滿度的測量 隨機抓取各批梔子中的20顆，使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺對梔子果實及去皮后梔子種子團(tuán)的最大直徑進(jìn)行測量，以這20顆梔子種子團(tuán)橫截面積與果實橫截面積之比的平均值代表這批梔子樣品飽滿度情況。

1.3 化學(xué)品質(zhì)指標(biāo)的測定

梔子的化學(xué)和藥理研究表明，梔子中主要含有環(huán)烯醚萜類、二萜類、有機酸酯類等化合物[5]，梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、西紅花苷-Ⅱ京尼平苷酸和綠原酸為其主要有效成分。以這6種成分為內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)，用HPLC測定了77批梔子中6種藥效成分的含量。

分別制備供試品和對照品溶液，色譜條件為：Durashell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；梯度洗脫：0～18 min（8%～15% A）；18～25 min（15%～23% A）；25～40 min（23%～35% A）；40～50 min（35%～50% A）；流速 0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長 238，330，440 nm；進(jìn)樣量10 μL。按以上條件用對照品溶液分別進(jìn)行線性關(guān)系、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗、加樣回收率試驗5種方法學(xué)考察，最后通過對相關(guān)系數(shù)r，RSD和平均加樣回收率的計算結(jié)果表明此方法的線性關(guān)系、儀器精密度、24 h的穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率均較好。故可制備不同產(chǎn)地77批梔子樣品，經(jīng)0.45 μm有機濾頭過濾后進(jìn)樣10 μL，以上述條件測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算梔子6種有效成分含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對77批梔子藥材中包括傳統(tǒng)商品規(guī)格鑒別和化學(xué)成分在內(nèi)的10個指標(biāo)進(jìn)行描述統(tǒng)計分析、兩步聚類分析，通過各變量的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、均值的聯(lián)合置信空間判斷該分類是否顯著合理，同時對傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別主征的重要性進(jìn)行判別，分析內(nèi)在品質(zhì)與外在指標(biāo)的相關(guān)性；以商品規(guī)格等級為分類變量，從道地產(chǎn)區(qū)與次要產(chǎn)區(qū)、栽培品種與野生品種兩個方面對梔子藥材的傳統(tǒng)鑒別指標(biāo)進(jìn)行了多重對應(yīng)分析。結(jié)合市場實際情況，完善梔子商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩步聚類分析結(jié)果

2.1.1 兩步聚類分析分類依據(jù) 自動聚類表由兩步聚類分析工具生成，表明了最佳聚類數(shù)的選擇過程。一般來說，每種可能的聚類數(shù)都用聚類標(biāo)準(zhǔn)（BIC）運算[6]。聚類模型和相應(yīng)聚類數(shù)的優(yōu)劣與BIC的大小成反比。

考慮到聚類數(shù)的增加可能會使BIC減小，此時便不能以單純的BIC來衡量聚類模型的好壞。所以，BIC的變化（ratio of BIC changes）和距離測量的變化（ratio of distance measures）[7]才是判斷一個模型優(yōu)劣的重要指標(biāo)。若距離測量比的值和BIC變化率都較大，而BIC值較小，表明聚類有意義且最優(yōu)。分成2類時，BIC最小，其變化率和距離測量比為最大，故分成2類是最優(yōu)的方案，見表1。

2.1.2 聚類結(jié)果 根據(jù)兩步聚類分布結(jié)果，在77批梔子樣品中，分在聚類1中有57批，分在聚類2中有20批，見表2，3。

從上面2個數(shù)據(jù)透視表中可以查看每個聚類中各項變量的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，化學(xué)成分和外觀指標(biāo)（飽滿度和果皮顏色L，a，b）在2個聚類中都較好的區(qū)分了出來，雖然在2個聚類中各變量存在或大或小的標(biāo)準(zhǔn)差，聚類結(jié)果給出的臨界值并不能認(rèn)為是嚴(yán)格意義上的區(qū)分界限，同時查看各聚類均值的聯(lián)合置信區(qū)間，發(fā)現(xiàn)分組之間存在一定的交叉情況，但是其分組的指導(dǎo)意義仍然顯著。內(nèi)在品質(zhì)方面，聚類1中的梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、西紅花苷-Ⅱ含量大，綠原酸、京尼平苷酸含量小，聚類2中6中成分含量正好相反；傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別主征方面，聚類1中的梔子果皮顏色指標(biāo)值均比聚類2中要大，而果實飽滿度均值結(jié)果十分相似。從梔子的實際情況來看，梔子中京尼平1-β-D龍膽二糖苷、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ含量普遍較綠原酸、京尼平苷酸含量大很多，且果皮顏色紅黃色、橙紅色和果實飽滿度大者為佳，綜合分析可知，聚類1應(yīng)屬于一級品，聚類2屬于二級品。

2.2 各傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別主征重要性

對于聚類1、聚類2，為了反映各變量與單個聚類重要性的對應(yīng)情況，可以繪制變量沿Y軸向下重要性遞減排列的圖示。虛線表示各變量對本聚類具有顯著性作用的臨界值。當(dāng)變量的Test Statistic越過相應(yīng)正負(fù)虛線臨界值時，則認(rèn)為該變量具有顯著性影響，見圖1。

從2個主征在聚類1中重要性來看，標(biāo)示果皮顏色的3個指標(biāo)L，a，b的T統(tǒng)計量均超出了虛線標(biāo)出的臨界值，而飽滿度的T統(tǒng)計量未超出臨界值，單就從梔子2個傳統(tǒng)鑒別指標(biāo)出發(fā)，果皮顏色對聚類1的形成具有顯著作用，所以聚類1的組別特點應(yīng)重點突出果皮顏色這一指標(biāo)，見圖2。

同理從2個主征在聚類2中重要性來看，果皮顏色和飽滿度的T統(tǒng)計量均超出了虛線標(biāo)出的臨界值，從梔子2個傳統(tǒng)鑒別指標(biāo)出發(fā)，果皮顏色和飽滿度對聚類2的形成均具有顯著作用，所以聚類2的組別特點應(yīng)包括這2項指標(biāo)，但果皮顏色的重要性大于飽滿度。

綜合2個主征在兩類別中的表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，可以確定果皮顏色是梔子傳統(tǒng)經(jīng)驗的首要鑒別主征，而飽滿度在一、二等的區(qū)分中表現(xiàn)無法統(tǒng)一，一等品中飽滿度不呈顯著作用，二等品中飽滿度呈顯著作用，且一等中飽滿度較二等中飽滿度小。

2.3 梔子藥材內(nèi)在品質(zhì)與果皮顏色的相關(guān)性分析

為了研究梔子內(nèi)在活性成分與外在果皮顏色間的關(guān)系，利用SPSS 19.0對梔子化學(xué)成分和果皮顏色L，a，b做Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明，梔子活性成分與果皮顏色指標(biāo)值存在一定的相關(guān)性，其中L，a與梔子苷呈顯著關(guān)系，對其含量的增加起正相關(guān)作用，而綠原酸含量則與L呈顯著的負(fù)相關(guān)作用；a，b與西紅花苷-Ⅱ呈極顯著關(guān)系，西紅花苷-Ⅰ只與a呈極顯著關(guān)系，兩者均為促進(jìn)作用；京尼平苷酸含量與L，a，b呈極顯著關(guān)系，隨著L，a，b的升高，京尼平苷酸含量反而減??；京尼平1-β-D龍膽二糖苷含量與顏色指標(biāo)值無顯著關(guān)系，見表4。

2.4 梔子商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)研究

2.4.1 不同等級梔子樣品色澤信息散點圖 利用SPSS軟件對來自道地產(chǎn)區(qū)、次要產(chǎn)區(qū)的各批次梔子栽培和野生品種藥材進(jìn)行樣品和等級規(guī)格的多重對應(yīng)分析，見圖3，4。

從圖3分布情況來看，無論野生還是栽培品梔子的二等品均有較為明顯的集中趨勢（L，a，b均?。?，且兩步聚類給出的L，a，b 3個臨界值能較為準(zhǔn)確的對梔子等級進(jìn)行區(qū)分，表明果皮顏色這一判別主征可以對梔子的一，二等品進(jìn)行較為準(zhǔn)確的區(qū)分。同時也發(fā)現(xiàn)單就果皮顏色3個指標(biāo)值（L，a，b）不能區(qū)分同一等級中的栽培和野生品，表明梔子野生和栽培的果皮顏色無顯著差異，無法以果皮顏色對二者進(jìn)行區(qū)分。

從圖4可知，無法從果皮顏色L，a，b指標(biāo)對梔子的主產(chǎn)區(qū)和次要產(chǎn)區(qū)進(jìn)行區(qū)分，道地產(chǎn)區(qū)梔子也存在梔子品質(zhì)參差不齊的情況，藥材的高產(chǎn)中心與高質(zhì)中心分離或偏離的現(xiàn)象也不在少數(shù)，個別次要產(chǎn)區(qū)（例如四川，廣西）梔子品質(zhì)亦有反超之勢，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是道地產(chǎn)區(qū)萎縮和轉(zhuǎn)移，優(yōu)質(zhì)品種在次要產(chǎn)區(qū)引種栽培的結(jié)果。

2.4.2 梔子商品規(guī)格等級劃分標(biāo)準(zhǔn)描述 通過上述分析，聚類1中果實飽滿度小的情況與梔子飽滿度大者屬于優(yōu)品的實際情況相悖，在與相關(guān)專家進(jìn)行商討后，考慮到飽滿度在一、二等中的顯著性表現(xiàn)不一，且飽滿度判別與實際不符，但飽滿度確實關(guān)乎梔子單位體積的質(zhì)量，故一致同意保留原《76種中藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》梔子項下對飽滿度的描述，即一等品較二等品梔子果實飽滿，但應(yīng)對詞條做適當(dāng)補充。經(jīng)過梔子藥材商品規(guī)格感官判別主征與內(nèi)在品質(zhì)的相關(guān)研究，可以將梔子商品劃分為2類，對2類別梔子商品規(guī)格等級劃分標(biāo)準(zhǔn)做如下描述，見表5。

2.5 梔子等級快速評判解決方案

根據(jù)上述研究結(jié)果，梔子藥材果皮顏色與化學(xué)信息及傳統(tǒng)質(zhì)量等級評價結(jié)果相關(guān)性最好，是梔子傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別的首要主征。但是目前在果皮顏色實際判別過程中，仍然存在很大的差異性和模糊性，個人主觀感受強，不同的藥農(nóng)和藥商對同種果皮顏色的描述各有不同，缺乏形象、可靠、明確、具體的評判體系，導(dǎo)致梔子等級評價產(chǎn)生一定偏差。故本研究重點選擇梔子果皮顏色顯色后的顏色，參照兩步聚類給出的臨界值L=35.948，a=29.546，b=30.324，以采集的梔子為顏色庫，利用Photoshop中的拾色器面板進(jìn)行參數(shù)比對，將梔子藥材果皮顏色進(jìn)行等級劃分，可制備用于對梔子藥材果皮顏色等級快速評判的比色卡，開創(chuàng)了梔子品質(zhì)快速評價的新途徑，見圖5。

3 討論

梔子作為市場上常用的大宗中藥材之一，對其商品規(guī)格等級的劃分研究還處于30年前的等級標(biāo)準(zhǔn)，尚且缺乏現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵的闡釋，市場上商家定價隨意混亂，采購者的感官評價模糊主觀性強，難以體現(xiàn)藥材的綜合品質(zhì)。目前已有一些常用中藥材以傳統(tǒng)定性指標(biāo)、化學(xué)成分定量指標(biāo)等多成分綜合定量顏色等級描述（依據(jù)色板對照）：一等品.表面紅褐色、紅色、棕紅色、橙紅色、橙色、橙黃色；二等品.表面深褐色、褐色、棕黃色、棕色、淡棕色、枯黃色。

評價其商品規(guī)格等級的相關(guān)研究，如三七[8]、羌活[9]、秦艽[10]、金銀花[11]、太子參[12]等，本文以梔子為研究對象，通過對傳統(tǒng)外觀鑒別指標(biāo)梔子果皮顏色和飽滿度的定量化數(shù)據(jù)采集，同時基于6種有效成分為內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)，對各級各類指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化和量化后，綜合分類分析77批梔子藥材，確定了傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別主征果皮顏色的重要性和梔子商品規(guī)格劃分與藥材內(nèi)在品質(zhì)的相關(guān)性，在傳統(tǒng)“辯狀論質(zhì)”[13]的基礎(chǔ)上對梔子藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)評價體系進(jìn)行了重建和提高，結(jié)果更為明確、具體、可靠，同時開創(chuàng)了一種梔子等級快速評判的方案，確保梔子品質(zhì)提高臨床藥效，為市場梔子的優(yōu)質(zhì)優(yōu)價提供了有力依據(jù)和參考價值。

梔子作為江西的傳統(tǒng)道地藥材，在實際市場流通中，梔子產(chǎn)地的多樣，品種的混雜，品質(zhì)的混亂，極大地模糊了梔子的道地性，對梔子實施分類分級管理，能更有效地保證梔子品質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，梔子具有抗炎、保肝、利膽等多種藥理活性，而環(huán)烯醚萜苷類成分是其主要的活性成分，在把傳統(tǒng)外觀指標(biāo)量化直觀化的基礎(chǔ)上，引入與梔子品質(zhì)密切相關(guān)的有效成分如梔子苷、西紅花苷等的含量作為內(nèi)在指標(biāo)，以此制定的標(biāo)準(zhǔn)從外在到內(nèi)在、從定性到定量、從主觀到較為客觀，都更準(zhǔn)確合理地闡述了梔子的等級分類，既是對原有商品規(guī)格的傳承，也是一種現(xiàn)代補充，從而滿足市場的變化和需求，有效控制梔子飲片的質(zhì)量。

中藥材商品規(guī)格劃分依據(jù)關(guān)系到中藥材商品規(guī)格能否與中藥材質(zhì)量保持一致，所以從多個角度、多個指標(biāo)、多種方法闡述其現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵，發(fā)掘因藥材而異的劃分依據(jù)，針對不同的藥材形成各自獨特的商品規(guī)格將是未來中藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)制定的方向。

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