棉花木葡聚糖轉移/水解酶基因克隆和分析

李先良　李居寧　李傲　夏濤

摘要：為研究XTH基因與棉花（Gossypium spp.）纖維伸長的關系，克隆了兩個XTH基因，分別命名為GhXTH1（GenBank：AY189971）和GhXTH2（GenBank：JN968478）。GhXTH1編碼區(qū)全長870 bp，編碼289個氨基酸，GhXTH1全長885 bp，編碼294個氨基酸。序列分析表明，GhXTH1和GhXTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息學分析表明，GhXTH1和GhXTH2均含有信號肽?？缒そY構預測表明，GhXTH1和GhXTH2均在N端存在跨膜螺旋。系統(tǒng)發(fā)生學分析表明，GhXTH1與擬南芥XTH6、XTH7親緣關系較近，GhXTH2與擬南芥XTH9親緣關系較近。半定量分析表明，GhXTH1和GhXTH2均隨著棉花纖維發(fā)育表達量降低，GhXTH2比GhXTH1表達量高。

關鍵詞：棉花（Gossypium spp.）纖維；木葡聚糖轉移/水解酶；克??；表達分析；伸長

中圖分類號：S562；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0756-06

棉花（Gossypium spp.）纖維是由胚珠表皮細胞發(fā)育而來，成熟纖維細胞長度可為其直徑的1 000～3 000倍，有的可達35～40 mm[1]。海島棉（Gossypium barbadense，Gb）成熟棉纖比陸地棉（Gossypium hirsutum，Gh）長，但在開花后24 d，陸地棉纖維長度比海島棉纖維長[2]。棉纖維細胞的伸長開始于開花當天[3-5]，纖維細胞伸長速率最大的階段發(fā)生在開花后6～12 d和15～20 d，兩個階段伸長量可達最終長度的80%[6]。

棉纖細胞伸長由細胞內膨壓驅動，并伴以細胞壁松弛過程。細胞內滲透溶質增加，促進細胞內滲透壓增加，使細胞吸收大量水分，從而使細胞膨壓增加，使細胞滲透壓增加的溶質主要是可溶性糖、蘋果酸鹽及鉀離子（K+）[7]。磷酸丙酮酸羧化酶（PEPC）[8]、胞間連絲[9，10]、蔗糖酶（Vacuelar invertase）[11]、水通道蛋白[12]與棉纖細胞膨壓產生或增加有關。

棉纖細胞壁是由纖維素、半纖維素和結構蛋白組成的動態(tài)網絡。半纖維素木葡聚糖是植物細胞初生壁的結構多糖，木葡聚糖鏈通過共價氫鍵綁附到纖維素鏈上，將臨近纖維素微纖絲交聯(lián)起來[13]。微纖絲之間木葡聚糖交聯(lián)結構是細胞伸長的主要限制因素之一。該交聯(lián)結構可以被木葡聚糖轉移/水解酶（Xyloglucan endotransglucosylase/Hydrolase，XTH）解開并重新連接，從而降低細胞伸長的阻力，因此XTH能通過松弛細胞壁進而促進細胞伸長。重組擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）XTH14和XTH26加到根系上，展現(xiàn)出對根系細胞伸長明顯的促進作用[14]。在擬南芥中，超表達AtXTH18、AtXTH19、AtXTH20能刺激下胚軸伸長[15]；在棉花中，超表達GhXTH1能增強XTH活性，使棉花纖維長度增加15%～20%[16]。XTH基因在棉花纖維中表達存在時間特異性和品種特異性[17]，在海島棉和陸地棉花棉花纖維中表達存在差異[18]。XTH基因表達模式與棉花纖維長度存在關聯(lián)。

本研究從陸地棉中克隆分離兩個XTH基因，對其進行序列分析、系統(tǒng)發(fā)生學分析和表達分析，以期為了解XTH基因及其家族與棉花纖維伸長之間的關系奠定基礎，從而為棉花纖維品質改良特別長度品質改良提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用的棉花材料為陸地棉珂字201、華棉99，海島棉為軍海1號。分別取開花后4、9、14、19、24 d棉瓣放入液氮，然后存入-80 ℃冰箱備用。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α為實驗室保存，中間載體pMD18-T購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

棉花纖維總RNA用熱硼酸法提取[19]，并按DNase I試劑盒所示方法處理總RNA，以去除其中DNA，然后用15 μL DEPC ddH2O溶解，分光光度計測定RNA濃度。最后按照Promega反轉錄酶體系進行操作，合成第1鏈cDNA，反轉錄后的cDNA保存于-20 ℃。

1.3 GhXTH1和GhXTH2克隆

在NCBI中有一個XTH全長編碼序列（AY189971），另外還存在一個EST序列（DV848907）。對于AY189971，根據(jù)其全長序列，從兩端設計引物（GhXET-OE-F：5′-AAAGTCGACATTCTCTTTCTGTTTCTCTGGTTTA-3′；GhXET-OE-R：5′-AAAGGTACCTCAGATGATGGACATGCACTC-3′），以14 d棉花纖維cDNA為模板，PCR擴增后測序。對于DV848907，將其與AtXTH序列比對，發(fā)現(xiàn)該段EST序列與AtXTH基因5′端同源程度較高，而且同源區(qū)包含起始密碼子。根據(jù)此段EST序列設計引物進行3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends），測序得到一段DNA序列，以該序列與EST序列拼接翻譯，發(fā)現(xiàn)以EST序列的第三個堿基開始翻譯能翻譯出一個完整蛋白序列。在該序列內存在兩個起始密碼子，以第一個起始密碼子翻譯到蛋白序列長度相對符合XTH蛋白序列長度。RACE方法見參考文獻[20]。

1.4 GhXTH生物信息學分析

利用ClustalW軟件進行多序列對齊和排序， 使用GenDOC和MEGA5.0軟件輸出同源比對和進化樹構建結果[21]；用SingaIP進行信號肽預測[22]；用ProtParam計算蛋白質的相對分子質量和理論等電點[23]；利用TMHMM預測蛋白質的跨膜結構域。

1.5 GhXTH1和GhXTH2表達分析

UBQ7為RT-PCR分析內參基因，設計引物序列為：GhUBI-RT-F：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC；GhUBI-RT-F：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG。GhXTH引物序列為：GhXTH1-RT-F：TCCGTGACAGC

AGATGAGATC；GhXTH1-RT-R：TGGTGCAAACTTA

ACTCCGAC。GhXTH2引物序列為：GhXTH2-RT-F：GGTTTCCGTGACAGCAGATG；GhXTH2-RT-F：GTGCAAACTTAACTCCGACATT。PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。

2 結果與分析

2.1 GhXTH1和GhXTH2全長序列克隆和分析

GhXTH1在NCBI中存在一個全長序列（AY189971），根據(jù)該序列設計引物進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1A），片段大小在750～1 000 bp間。測序結果表明，該序列與AY189971存在一個堿基差別，但蛋白序列完全相符。將該基因命名為GhXTH1。

在NCBI存在GhXTH的一個EST序列DV848907，將該序列與擬南芥中XTH序列比對，發(fā)現(xiàn)該序列覆蓋該基因的5′端，因此，僅需要進行3′-RACE可得到該基因全長序列，根據(jù)試劑盒（SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit）說明書，進行3′-RACE，擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1B）。將該片段測序，測序后所得序列與EST拼接，將所得序列在Premier軟件進行翻譯，發(fā)現(xiàn)從第3個堿基開始能翻譯出一個蛋白序列。以第一個起始密碼子為起始，能翻譯出289個氨基酸（aa）。以編碼該序列的DNA序列為模板設計引物，用該引物進行PCR擴增（圖1C），對該片段進行測序，所得序列與前面的拼接序列完全吻合。將該序列提交NCBI庫（JN968478）。

2.2 GhXTH1和GhXTH2蛋白特征分析

GhXTH1全長序列包含289個氨基酸，GhXTH2包含294個氨基酸。將擬南芥和其他幾種植物中XTH與克隆得到XTH多序列比對。結果表明，棉花XTH序列與其他XTH序列有比較高的保守性，所有序列都存在維持XTH活性的保守序列DEIDFEFLG[24，25]，但有些序列與之相差1～2個氨基酸（圖2）。GhXTH1保守序列與此相差1個氨基酸，第3個氨基酸由異亮氨酸（I）變成了亮氨酸（L）；GhXTH2保守序列與此相差2個氨基酸，第1個氨基酸從天冬氨酸（D）變成天冬酰胺（N），第3個氨基酸從異亮氨酸變成苯丙氨酸（F）。擬南芥XTH家族中多個XTH保守序列存在1～2個氨基酸變化。

XTH是一種細胞壁蛋白，因此，對所獲得的兩個棉花XTH進行信號肽預測、亞細胞定位預測及等電點等蛋白特征分析。有助于了解其生物學功能。經Protparam程序預測，GhXTH1理論分子質量33.07 ku，理論等電點（pI）為6.38，GhXTH2理論分子質量33.61 ku，理論pI為5.40。通過SignalP 4.1 Server預測，顯示GhXTH1和GhXTH2在N端均存在一段信號肽（圖3），位置位于第1～25 aa。該信號肽的作用是將該蛋白定位至細胞壁。TMHMM預測GhXTH1和GhXTH2均存在1個跨膜結構（圖4），該跨膜結構位于N端，在蛋白序列中信號肽的后面。N-糖基化對維持XTH活性具有重要作用[26]。用NetNGlyc 1.0 Server分析GhXTH1和GhXTH2中 N（天冬酰胺）-糖基化位點。結果表明，GhXTH1存在1個糖基化位點，GhXTH2有兩個糖基化位點，GhXTH1和GhXTH2保守序列DEIDFEFLG后面均存在1個糖基化位點。

2.3 GhXTH1和GhXTH2系統(tǒng)發(fā)育分析

為了解GhXTH1、GhXTH2與擬南芥XTH之間進化關系，進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖6）。AtXTHs可以分3類，大部分Ⅰ類XTH成員包含4個外顯子，Ⅱ類XTH成員具有2或3個外顯子，Ⅲ類XTH成員具有4或5個外顯子，且3類XTH C端存在特征序列[25]。但隨著AtXTHs與水稻XTHs（OsXTHs）疊加系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類和Ⅱ類XTH成員分歧已不明顯[27]；Ⅲ類顯示具有木葡聚糖水解酶活性而不是轉糖基酶活性[28]。但酶活性分析表明Ⅲ類酶并不都具有水解酶活性，番茄中的一個Ⅲ類XTH（SIXTH5）表現(xiàn)出轉糖基酶活性[29]。因此，XTH系統(tǒng)發(fā)生學分類與其活性之間并無關系。GhXTH1與AtXTH6、AtXTH親緣關系較近，GhXTH2與AtXTH9親緣關系較近，均屬于Ⅰ/Ⅱ類XTH。

2.4 GhXTH1和GhXTH2在棉花纖維發(fā)育中的表達分析

為獲得兩個XTH在不同棉花纖維中隨發(fā)育時期的表達模式，用克隆到兩個XTH序列設計引物，進行半定量分析，以了解兩個XTH在陸地棉和海島棉棉花纖維發(fā)育中的表達模式（圖7）。結果表明，GhXTH1和GhXTH2在陸地棉和海島棉表達量均隨著棉花纖維發(fā)育而下降。在棉花纖維發(fā)育的初生壁時期，細胞伸長較快，XTH大量表達能松弛初生細胞壁進而釋放因細胞伸長而產生的阻力。在陸地棉和海島棉中，GhXTH2表達量比對應發(fā)育時期GhXTH1表達量高。

3 討論

利用傳統(tǒng)PCR技術和RACE技術，從棉花纖維中分離到兩個XTH基因，分別命名為GhXTH1和GhXTH2。序列比對發(fā)現(xiàn)它們均存在XTH家族保守基序DEIDFEFLG，該基序不僅在XTH家族中保守，在XTH所隸屬的GH16家族中也相對保守[30，31]。從擬南芥和水稻XTH家族保守序列看，該基序在某些位點有些變化。因此，GhXTH1和GhXTH2在該基序上有1～2氨基酸殘基變化不影響其成為XTH家族成員。

擬南芥XTH家族包含33個成員，從系統(tǒng)發(fā)生學角度可分為3類[32]，GhXTH1和GhXTH2均屬于其中Ⅰ類（Group Ⅰ/Ⅱ）。Ⅰ類XTH具有一個共同特征，XTH基因由4個外顯子組成，其保守基序位于3個外顯子上。但系統(tǒng)發(fā)育分類與XTH活性無關[29]，在水稻中，Ⅲ類中兩個XTH（OsXTH19，OsXTH20）僅表現(xiàn)出水解酶活性，而Ⅰ類中的OsXTH1具有內轉移酶活性和水解酶活性[33]。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，GhXTH1與AtXTH6、AtXTH7親緣關系密切，而GhXTH2與AtXTH9親緣關系較近。將GhXTH1和具有水解酶活性XTH（TmNGX1）進行三維結構比較可知，其在負責水解活性的保守環(huán)狀結構上存在差異，因此，GhXTH1主要是轉糖基酶活性[17]。AtXTH9活性還無報道，但從系統(tǒng)發(fā)生分析看，AtXTH9、GhXTH2與GhXTH1關系較近，它們在酶活性上應該是類似的，AtXTH9表達受遠紅光的正調控[34]。因此，GhXTH2的表達有可能受到紅外光的正調控。

XTH具有多種生理功能，包括有細胞生長[15，16，35]、水果軟化[29，36]、器官脫落[37，38]、維管形成[39-42]等。水稻3個XTH酶活性類型不同，將它們在水稻中超表達或抑制表達，均不能明顯改變水稻表型，說明這3個XTH存在功能冗余[33]。GhXTH1和GhXTH2在棉纖中有較高的表達，說明其與棉花纖維發(fā)育有關。GhXTH1在具有更長棉花纖維的棉花品種或者海島棉中上調表達[17]，說明GhXTH1與棉纖伸長有關，GhXTH1在棉花中超表達后，棉纖轉糖基酶活性增加，成熟纖維長度也有增加。GhXTH2在棉花纖維中表達高于GhXTH1，因此，GhXTH2在棉花纖維伸長方面的作用可能比GhXTH1強，但也不能排除GhXTH1和GhXTH2在棉花纖維伸長方面存在功能冗余。

4 結論

獲得了兩個全長木葡聚糖轉移/水解酶基因GhXTH1和GhXTH2全長cDNA序列，GhXTH1和GhXTH2均含有信號肽和跨膜結構，這表明其是定位于質膜上的分泌性蛋白。GhXTH1和GhXTH2均含有XTH家族的保守基序DEIDFEFLG，且在基序后存在糖基化位點，該基序和糖基化是XTH產生活性必需的，這說明所獲得兩個序列具有該家族的一般特性。系統(tǒng)發(fā)生學分析表明，GhXTH1與擬南芥XTH6、XTH7親緣關系較近，GhXTH2與擬南芥XTH9親緣關系較近。GhXTH1和GhXTH2均隨著棉花纖維發(fā)育表達量降低，GhXTH2比GhXTH1表達量高。

參考文獻：

[1] MAUNEY J R. Cotton Physiology （The Cotton Foundation Reference Book Series No 1）[M].Memphis：Cotton Foundation，1987.

[2] 徐 雯.棉花紫色酸性磷酸酶基因的克隆及功能分析[D].武漢：華中農業(yè)大學，2012.

[3] BEASLEY C A.Developmental morphology of cotton flower sand seed as seen with the scanning electron microscope[J].Amer J Bot，1975，62（6）：584-592.

[4] STEWART J M.Fiber Initiation on the Cotton Ovule（Gossypium hirsutum）[J].Amer J Bot，1975，62（7）：723-730.

[5] JOSHI P A.，STEWART J M，GRAHAM E T.Localization of β-glycerophosphatase activity in cotton fiber during differentiation[J].Proto Plasma，1985，125（1）：75-85.

[6] MEINERT M C，DELMER D P.Changes in bioehemical composition of the cell wall in cotton fiber during development[J].Plant Physiol，1977，59（6）：1088-1097.

[7] RUAN Y L，CHOUREY P S，DELMER P D，et al. The differential expression of sucrose synthase in relation to diverse patterns of carbon partitioning in developing cotton seed[J].Plant Physiol，1997，115（2）：375-385.

[8] LI X R，WANG L，RUAN Y L.Developmental and molecular physiological evidence for the role of phosphoenolpyruvate carboxylase in rapid cotton fibre elongation[J].J Exp Bot，2010， 61（1）：287-295.

[9] RUAN Y L，LLEWELLYN D J，F(xiàn)URBANK R T. The Control of single-celled cotton fiber elongation by developmentally reversible gating of plasmodesmata and coordinated expression of sucrose and K+ transporters and expansin[J].Plant Cell，2001， 13（1）：47-60.

[10] RUAN Y L，XU S M，WHITE R，et al. Genotypic and developmental evidence for the role of plasmodesmatal regulation in cotton fiber elongation mediated by callose turnover[J].Plant Physiol，2004，136（4）：4104-4113.

[11] WANG L，LI X R，LIAN H，et al. Evidence that high activity of vacuolar invertase is required for cotton fiber and Arabidopsis root elongation through osmotic dependent and independent pathways， respectively[J].Plant Physiol，2010，154（2）：744-756.

[12] MAUREL C，SANTONI V，LUU D T，et al. The cellular dynamics of plant aquaporin expression and functions[J].Curr Opin Plant Biol，2009，12（6）：690-698.

[13] VISSENBERG K，F(xiàn)RY S C，PAULY M，et al. XTH acts at the microfibril-matrix interface during cell elongation[J].J Exp Bot，2005，56：673-683.

[14] MARIS A，SUSLOV D，F(xiàn)RY S C，et al. Enzymic characterization of two recombinant xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase（XTH） proteins of Arabidopsis and their effect on root growth and cell wall extension[J].J Exp Bot，2009，60（13）：3959-3972.

[15] MIEDES E，SUSLOV D，VANDENBUSSCHE F，et al.Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase（XTH）overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls[J].J Exp Bot，2013，64（8）：2481-2497.

[16] LEE J，BURNS T H，LIGHT G，et al. Xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase genes in cotton and their role in fiber elongation[J].Planta，2010，232：1191-1205.

[17] MICHAILIDIS G，ARGIRIOUS A，DARZENTAS N，et al.Analysis of xyloglucan endotransglycosl-ase/hydrolase（XTH） genes from allotetraploid（Gossypium hirsutum） cotton and its diploid progenitors expressed during fiber elongation[J].J Plant Physiol，2009，166：403-416.

[18] GHAZI Y，BOUROT S，ARIOLI T，et al. Transcript profiling during fiber development identifies pathways in secondary metabolism and cell wall structure that may contribute to cotton fiber quality[J].Plant Cell Physiol，2009，50（7）：1364-1381.

[19] 武耀廷，劉進元.一種高效提取棉花不同組織總RNA的熱硼酸改良法[J].棉花學報，2004，16（2）：67-71.

[20] LI X L，XIA T，HUANG J，et al. Distinct biochemical activities and heat shock responses of twoUDP-glucose sterol glucosyltransferases in cotton[J].Plant Sci，2014，219-220（1）：1-8.

[21] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol，2011，28（10）：2731-2739.

[22] BENDTSEN J D，NIELSEN H，VON HEIJNE G，et al. Improved prediction of signal peptides：SignalP 3.0[J].J Mol Biol，2004， 340（4）：783-795.

[23] GASTEIGER E，GATTIKER A，HOOGLAND C，et al.Ex-PASy：The proteomics server for in depth protein knowledge and analysis[J].Nucl Acid Res，2003，31：3784-3788.

[24] YOKAYAMA R，NISHITANI K. A comprehensive expression analysis of all members of a gene family encoding cell-wall enzymes allowed us to predict cis-regulatory regions involved in cell-wall construction in specific organs of Arabidopsis[J].Plant Cell Physiol，2001，42：1025-1033.

[25] ROSE J K C，BRAAM J，F(xiàn)RY S C，et al. The XTH family of enzymes involved in xylo-glucan endotransglucosylation and endohydrolysis：Current perspectives and a new unifying nomenclature[J].Plant Cell Physiol，2002，43：1421-1435.

[26] HENRIKSSON H，DENMAN S E，CAMPUZANA I D G，et al.N-linked glycosylation of native and recombinant cauliflower xyloglucan endotransglycosylase 16A[J].Biochem J，2003，375： 61-73.

[27] YOKOYAMA R，ROSE J K C，NISHITANI K. A surprising diversity and abundence of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases in rice. Cassification and expression analysis[J].Plant physiol，2004，134（3）：1088-1099.

[28] TABUCHI A，MORI H，KAMISAKA S，et al. A new type of endoxyloglucan transferase devoted to xyloglucan hydrolysis in the cell wall of azuki bean epicotyls[J].Plant Cell Physiol，2001， 42：154-161.

[29] SALADI？魪 M，ROSE J K C，COSGROVE D J，et al. Characterization of a new xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase（XTH） from ripening tomato fruit and implications for the diverse models of enzymic action[J].Plant J，2006，47：282-295.

[30] HENRISSAT B，COUTINHO P M，DAVIES G J. A census for carbohydrate-active enzymes in the genome of Arabidopsis thaliana[J].Plant Mol Biol，2001，47：55-72.

[31] CANTAREL B L，COUTINHO P M，RANCUREL C，et al. The carbohydrate-active enzymes database（CAZy）：An expert resource for glycogenomics[J].Nucleic Acids Res，2009，37：233-238.

[32] BAUMANN M J，EKLOF J M，MICHEL G，et al.Structural evidence for the evolution of xyloglucanase activity from xyloglucan endo-transglycosylases：Biological implications for cell wall metabolism[J].Plant Cell，2007，19（6）：1947-1963.

[33] HARA Y，YOKOYAMA R，OSAKABE K，et al. Function of xyloglucan endotrans-glucosylase/hydrolases in rice[J].Ann Bot，2014，114：1309-1318.

[34] SASIDHARAN R，CHINNAPPA C C，STAAL M，et al. Light quality-mediated petoile elongation in Arabidopsis during shade avoidance involves cell wall modification by xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases[J].Plant Physiol，2010，154：978-990.

[35] HARADA T，TORII Y，MORITA S，et al. Cloning， characterization，and expression of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase and expansin genes associated with petal growth and development during carnation flower opening[J].J Exp Bot，2011，62（2）：815-823.

[36] HAN Y，ZHU Q G，ZHANG Z K，et al. Analysis of xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase（XTH） genes and diverse roles of isoenzymes during persimmon fruit development and postharvest softening[J].PLoS One，2014，10（4）：e0123668.

[37] SINGH A P，TRIPATHI S K，NATH P，et al. Petal abscission in rose is associated with the differential expression of two ethylene responsive xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase genes RbXTH1，and RbXTH2[J].J Exp Bot，2011，62：5091-5103.

[38] TSUCHIYA M，SATOH S，IWAI H. Distribution of XTH，expansin，and secondary-wall-related CesA in floral and fruit abscission zones during fruit development in tomato （Solanum lycopersicum）[J].Front Plant Sci，2015，6：1-9.

[39] MATSUI A，YOKOYAMA R，SEKI M，et al.AtXTH27 plays an essential role in cell wall modification during the development of tracheary elements[J].Plant J，2005，42：525-534.

[40] BOURQUIN V，NISHIKUBO N，ABE H，et al. Xyloglucan endotransglycosylases have a function during the formation of secondary cell walls of vascular tissues[J].Plant Cell，2002， 14：3073-3088.

[41] NISHIKUBO N，TAKAHASHI J，ROOS A A，et al. Xyloglucan endotransglycosylase-mediated xyloglucan rearrangements in developing wood of hybrid aspen[J].Plant Physiol，2011，155： 399-413.

[42] WANG B，ZHANG D. Association of allelic variation in PtoXET16A with growth and wood properties in Populus tomentosa[J].Int J Mol Sci，2014，15（9）：16949-16974.