聚乙烯醇和海藻酸鈉聯(lián)合固定化漢遜德巴利酵母產(chǎn)3—羥基丙酸的研究

董玉瑋　刁咸斌　王陶　張傳麗　高明俠

摘要：采用微膠囊固定化技術(shù)，利用聚乙烯醇、海藻酸鈉和氯化鈣制備漢遜德巴利酵母微膠囊，探討了聚乙烯醇、海藻酸鈉、氯化鈣的濃度對漢遜德巴利酵母微膠囊的制備工藝及其產(chǎn)3-羥基丙酸量的影響。結(jié)果表明，隨著聚乙烯醇、海藻酸鈉和氯化鈣濃度的分別增加，3-羥基丙酸含量先增加后減少。聚乙烯醇最佳濃度為10.0%，此時3-羥基丙酸含量為（20.01±0.66） g/L；海藻酸鈉為最佳濃度為1.0%，此時3-羥基丙酸含量為（18.71±0.54） g/L；氯化鈣最佳濃度為2.1%，此時3-羥基丙酸含量為（18.37±0.45） g/L。聚乙烯醇和海藻酸鈉聯(lián)合固定漢遜德巴利酵母制備微膠囊最佳工藝為10.0%聚乙烯醇，1.0%海藻酸鈉和2.1%氯化鈣，在此條件下3-羥基丙酸含量為（21.53±1.12） g/L。

關(guān)鍵詞：固定化；漢遜德巴利酵母；3-羥基丙酸

中圖分類號：TQ926 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0722-05

3-羥基丙酸（3-hp）是一種三碳無手性化合物，是大部分光學(xué)物質(zhì)的前體[1]，能夠發(fā)生氧化還原反應(yīng)得到1，3-丙二醇、丙二酸、丙烯酸等化合物[2]，這些化合物對于制備粘膠劑、纖維、塑料、樹脂、個人護(hù)理用品、水處理藥劑等必不可少；3-hp也可以聚合生成聚3-hp，具有強(qiáng)度高、易拉伸、生物降解性好等優(yōu)點，在環(huán)境保護(hù)、化學(xué)防護(hù)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，被譽(yù)為21世紀(jì)新興平臺化合物[3]。然而3-hp每年產(chǎn)量都不足，存在巨大的市場缺口，加之其重大的應(yīng)用價值和潛在的開發(fā)價值，吸引國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)爭先展開深入的研究。

微生物生產(chǎn)3-hp可以避免化學(xué)合成法帶來的諸多不良因素，具有生產(chǎn)時間短、材料容易得到、對環(huán)境無害、成本低等優(yōu)勢。1982年長谷川等發(fā)現(xiàn)皺褶假絲酵母可用于發(fā)酵生產(chǎn)3-hp。但是微生物自身存在不穩(wěn)定、對環(huán)境敏感、易死亡、不可再生等缺點。如果引入固定化細(xì)胞技術(shù)則可以克服這些缺點。固定化細(xì)胞技術(shù)是指將細(xì)胞用物理或化學(xué)方法限制或定位在某一特定空間，保留其原有的活性，能被重復(fù)和連續(xù)使用的技術(shù)手段[4]，具有高穩(wěn)定性、簡便、連續(xù)化使用、易控制等優(yōu)點，可提高產(chǎn)物的純度和過程效率[5，6]。其中包埋法是最常用的微生物固定化方法[7]，而聚乙烯醇、海藻酸鈉等有機(jī)高分子則可以作為良好的包埋載體材料[8]。

本研究采用經(jīng)實驗室保存并培養(yǎng)的漢遜德巴利酵母，利用聚乙烯醇和海藻酸鈉聯(lián)合進(jìn)行固定化培養(yǎng)，確定聚乙烯醇、海藻酸鈉、氯化鈣濃度等研究固定化條件，為后續(xù)的研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

1）菌種。漢遜德巴利酵母，實驗室保存。

2）試劑。海藻酸鈉、乙醇、硫酸、苯酚等均為分析純。

3）培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂粉20 g/L，丙酸10 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡糖糖30 g/L，酵母膏10 g/L，（NH4）2SO4 10 g/L，KH2PO4 5 g/L，K2HPO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，丙酸10 mL，調(diào)節(jié)pH至6.0。

4）主要儀器設(shè)備。FA21040電子天平，北京精密儀器公司；IXQ-SG46-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊有限公司；HZ150L恒溫培養(yǎng)搖床，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；250D恒溫光照培養(yǎng)箱，常州國華電器有限公司；DL-5低速大容量離心機(jī)，上海安亭儀器廠；高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 漢遜德巴利酵母的培養(yǎng) 漢遜德巴利酵母的固體培養(yǎng)；采用本實驗室斜面保存的漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心鑒定，保藏號為CGMCC No.11893。種子培養(yǎng)基，31 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。漢遜德巴利酵母的液體培養(yǎng)：采用長勢較好的漢遜德巴利酵母菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，31 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3 d，發(fā)酵液沉淀過濾后用于3-羥基丙酸測定。

1.2.2 固定化小球的制備 將漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵液靜置0.5 h，過濾后菌體沉淀加入到一定濃度海藻酸鈉與聚乙烯醇混合膠體中混勻，菌膠比2∶1。用5號針筒吸取混合液滴入一定濃度的CaCl2溶液中制成固定化小球，粒徑約0.3～0.5 cm，常溫下固定2 h，4 ℃冰箱固定2 h。小球用無菌水沖洗2～3遍后放入液體培養(yǎng)基，31 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3 d。

1）聚乙烯醇濃度的確定。分別以8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%的聚乙烯醇在1.0%海藻酸鈉和2.1%氯化鈣的條件下，固定漢遜德巴利酵母，按固定化小球2個/mL培養(yǎng)基接種，100 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，測定3-羥基丙酸含量。

2）海藻酸鈉濃度的確定。分別以0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%的海藻酸鈉在10.0%的聚乙烯醇和2.1%的氯化鈣的條件下，固定漢遜德巴利酵母，按固定化小球2個/mL培養(yǎng)基接種，100 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，測定3-羥基丙酸含量。

3）氯化鈣濃度的確定。分別以1.7%、1.9%、2.1%、2.3%、2.5%的氯化鈣在1.0%的海藻酸鈉和10.0%的聚乙烯醇的條件下，固定漢遜德巴利酵母，按固定化小球2個/mL培養(yǎng)基接種，100 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，測定3-羥基丙酸含量。

1.2.3 3-羥基丙酸的測定 3-羥基丙酸的方法：采用高效液相色譜法，3-羥基丙酸在210 nm有吸收峰，紫外檢測器210 nm；色譜柱規(guī)格：迪馬C18 250×4.6 mm，5 μm；pH范圍為1.5～9.0；流動相：3%甲醇-97%水；柱溫：35 ℃；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL，檢測3-羥基丙酸含量

1）3-羥基丙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。配置濃度梯度為2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g/L的3-羥基丙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，靜置過夜后檢測。

2）樣品中3-羥基丙酸的測定。取固定化漢遜德巴利酵母的培養(yǎng)液經(jīng)4 000 r/min離心5 min，用0.22 μm濾膜過濾后檢測3-羥基丙酸的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 8.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確定

由于底物丙酸、發(fā)酵產(chǎn)物3-羥基丙酸以及可能產(chǎn)生的同分異構(gòu)體乳酸都為有機(jī)弱酸，易電離，pH大都在2～3。試驗表明，隨著流動相pH逐漸增高樣品的分離度越低，然而低pH對色譜柱有較大損傷，結(jié)合色譜柱自身pH范圍，確定流動相pH為2.0。甲醇所占比例越高分離度越低，由此選擇pH 2.0含有3%甲醇的流動相。

2.2 3-羥基丙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)峰面積與濃度之間的關(guān)系求得直線方程。由圖1可知，3-羥基丙酸的出峰時間為5.6 min左右。圖2為根據(jù)峰面積繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得一元線性方程y=75.324x-18.625，經(jīng)顯著性檢驗，R2=0.999 0，說明3-羥基丙酸含量與峰面積之間具有極顯著的線性關(guān)系。

2.3 固定化小球的制備

2.3.1 高效液相色譜條件的確定 通過試驗可知，隨著流動相的pH逐漸增高樣品的分離度越低，流動相中甲醇所占比列越高分離度越低，由此選擇pH 2.0含有3%甲醇的流動相。

2.3.2 聚乙烯醇濃度對固定化小球形態(tài)的影響 分別采用8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%聚乙烯醇和1.0%海藻酸鈉制備固定化小球。從圖3、表1中可以看出，當(dāng)聚乙烯醇濃度低于9.0%時，固定化小球硬度很軟；當(dāng)聚乙烯醇濃度高于11.0%時，固定化小球硬度很硬；當(dāng)聚乙烯醇濃度在9.0%～10%時，固定化小球透明度適中，硬度適中，呈球形，尾巴不明顯。因此初步選擇聚乙烯醇濃度為9.0%～11.0%。

2.3.3 海藻酸鈉濃度對固定化小球形態(tài)的影響 分別采用0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%海藻酸鈉和10.0%聚乙烯醇制備固定化小球。從圖4、表2中可以看出，當(dāng)海藻酸鈉濃度低于0.9%時，固定化小球硬度很軟；當(dāng)海藻酸鈉濃度高于1.1%時，固定化小球硬度很硬；當(dāng)海藻酸鈉濃度在0.9%～1.1%時，固定化小球透明度適中，硬度適中，呈球形，尾巴不明顯。因此初步選擇海藻酸鈉濃度范圍為0.9%～1.1%。

2.3.4 氯化鈣濃度對固定化小球形態(tài)的影響 采用1.0%海藻酸鈉和10.0%聚乙烯醇混合在1.7%、1.9%、2.1%、2.3%、2.5%氯化鈣的條件下制備固定化小球。從圖5、表3中可以看出，當(dāng)氯化鈣濃度低于1.9%時，固定化小球硬度很軟；當(dāng)氯化鈣濃度高于2.3%時，固定化小球硬度很硬；當(dāng)氯化鈣濃度在1.9%～2.3%時，固定化小球透明度適中，硬度適中，呈球形，尾巴不明顯。因此初步選擇氯化鈣濃度范圍為1.9%～2.3%。

2.4 固定化細(xì)胞發(fā)酵液3-羥基丙酸的測定

由圖1可知，3-羥基丙酸的出峰時間為5.6 min，圖6中5.6 min也有峰出現(xiàn)，3-羥基丙酸含量為4.55 g/L。

2.5 不同聚乙烯醇濃度下3-羥基丙酸含量

根據(jù)初步試驗可知，在其他相同條件下，聚乙烯醇濃度為9.0%、10.0%、11.0%時制備固定化小球， 31 ℃培養(yǎng)3 d，測定3-羥基丙酸的含量（圖7）。從圖7可以看出，3-羥基丙酸隨著聚乙烯醇濃度的增加，先增加后減少，10.0%的聚乙烯醇為最佳濃度，此時3-羥基丙酸的含量為（20.01±0.66） g/L。

2.6 不同海藻酸鈉濃度下3-羥基丙酸含量

根據(jù)初步試驗可知，在其他相同條件下，海藻酸鈉濃度為0.9%、1.0%、1.1%時制備固定化小球，31 ℃培養(yǎng)3 d，測定3-羥基丙酸的含量。從圖8可以看出，3-羥基丙酸的含量隨著海藻酸鈉濃度的增加先增加后減少，1.0%海藻酸鈉為最佳濃度，此時3-羥基丙酸的含量為（18.71±0.54） g/L。

2.7 不同氯化鈣濃度下3-羥基丙酸含量

根據(jù)初步試驗可知，在其他相同條件下，氯化鈣濃度為1.9%、2.1%、2.3%時制備固定化小球，31 ℃培養(yǎng)3 d，測定3-羥基丙酸的含量。從圖9可以看出，3-羥基丙酸的含量隨著氯化鈣濃度的增加先增加后減少，2.1%的氯化鈣為最佳濃度，此時3-羥基丙酸的含量為（18.37±0.45） g/L。

2.8 最佳固定化條件

固定化漢遜德巴利酵母的最佳工藝為聚乙烯醇的濃度10.0%；海藻酸鈉的濃度1.0%；氯化鈣濃度2.1%。在此條件下3-羥基丙酸含量為（21.53±1.12） g/L，未固定化漢遜德巴利酵母3-羥基丙酸含量為（18.34±0.89） g/L，固定化后3-羥基丙酸含量提高了17.39%。

3 小結(jié)與討論

1）聚乙烯醇和海藻酸鈉聯(lián)合固定化漢遜德巴利酵母的特點。聚乙烯醇需要先冷水溶脹，再熱水溶解用于制備，充分的溶脹可以使形成的固定化小球更牢固，同時聚乙烯醇自身進(jìn)行交聯(lián)后，可以減少在水中的溶解；由于產(chǎn)物3-羥基丙酸是有機(jī)酸，加入聚乙烯醇能提高載體的成球性，保護(hù)載體，且聚乙烯醇較海藻酸鈉強(qiáng)度更高，因此聚乙烯醇含量（10%）遠(yuǎn)高于海藻酸鈉含量（1.0%），可以保證固定化小球的穩(wěn)定性；經(jīng)過多次重復(fù)試驗，證實聯(lián)合固定化漢遜德巴利酵母在培養(yǎng)階段未發(fā)生破裂與溶解現(xiàn)象，固定化小球形態(tài)沒有明顯變化。

2）固定化漢遜德巴利酵母較未固定化細(xì)胞的優(yōu)勢。目前國內(nèi)外主要通過菌種誘變、基因重組方式獲得高產(chǎn)3-羥基丙酸的菌株，本研究采用固定化工藝固定漢遜德巴利酵母，較未固定化細(xì)胞產(chǎn)3-羥基丙酸能力也有一定的提升。與未固定細(xì)胞相比，固定化工藝主要的優(yōu)勢包括：①按菌膠比為2∶1和2個固定化小球/mL培養(yǎng)基接種，菌種密度和固定化小球數(shù)量都較高，成功獲得了較高的3-羥基丙酸含量；②固定化工藝采用制備微膠囊小球，由于體積小，比表面積大，用于發(fā)酵培養(yǎng)時，增加了培養(yǎng)基與小球的接觸面積，更有利于菌種繁殖和生產(chǎn)3-羥基丙酸；③固定化小球可以重復(fù)利用，無需反復(fù)接種，尤其是固定化細(xì)胞在反復(fù)使用過程中，菌種保持較高繁殖能力，生長延遲期很短，節(jié)省了生產(chǎn)3-羥基丙酸的時間。

3）從固定化小球形態(tài)學(xué)判斷，較適聚乙烯醇濃度范圍是9.0%～11.0%，較適海藻酸鈉濃度范圍是0.9%～1.1%，較適氯化鈣濃度范圍是1.9%～2.3%，固定化小球透明度適中，硬度適中，成球形無拖尾。采用高效液相色譜測定3-羥基丙酸含量，確定聚乙烯醇和海藻酸鈉聯(lián)合固定漢遜德巴利酵母最佳工藝為10.0%聚乙烯醇，1.0%海藻酸鈉，2.1%氯化鈣。在此條件下3-羥基丙酸含量為（21.53±1.12） g/L，較未固定化漢遜德巴利酵母3-羥基丙酸含量提高了17.39%。

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