基于尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶為負(fù)向篩選標(biāo)記的生酮古龍酸桿菌基因組無(wú)痕修飾系統(tǒng)的構(gòu)建

陸 浩，李天明，劉金雷，杜紅燕，王北辰，馮惠勇,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.威斯康星大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命學(xué)院，威斯康星 麥迪遜 53706）

基于尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶為負(fù)向篩選標(biāo)記的生酮古龍酸桿菌基因組無(wú)痕修飾系統(tǒng)的構(gòu)建

陸 浩1，李天明1，劉金雷1，杜紅燕1，王北辰2，馮惠勇1,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.威斯康星大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命學(xué)院，威斯康星 麥迪遜 53706）

通過(guò)構(gòu)建尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（upp）敲除打靶質(zhì)粒，采用同源重組的方法獲得了生酮古龍酸桿菌（Ketogulonigenium vulgare）的upp基因缺失突變株K. vulgare Δupp，可作為基因組無(wú)痕修飾系統(tǒng)底盤(pán)細(xì)胞的upp基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化突變株K. vulgare Δupp，獲得upp基因回補(bǔ)菌株P(guān)BB-upp，并驗(yàn)證了upp作為負(fù)向篩選標(biāo)記的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：突變株Δupp在1 mg/mL的5-氟尿嘧啶培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，野生型和回補(bǔ)菌株P(guān)BB-upp不能生長(zhǎng)，3株菌對(duì)5-氟尿嘧啶的抗性存在顯著差異，說(shuō)明可以將upp基因作為負(fù)向篩選標(biāo)記，與正向篩選標(biāo)記相結(jié)合，在upp基因缺失的底盤(pán)細(xì)胞基礎(chǔ)上通過(guò)兩次同源重組，實(shí)現(xiàn)基因組的無(wú)痕修飾與改造。

生酮古龍酸桿菌；負(fù)向篩選標(biāo)記；無(wú)痕改造；5-氟尿嘧啶

VC又名L-抗壞血酸，是人體必需的水溶性維生素之一。“兩步發(fā)酵法”是目前VC的主要工業(yè)化生產(chǎn)方式[1-3]。生酮古龍酸桿菌（Ketogulonigenium vulgare）是目前VC兩步發(fā)酵工藝的重要生產(chǎn)菌，主要與芽孢桿菌等伴生菌完成糖酸轉(zhuǎn)化[4]。優(yōu)良的菌種對(duì)于提高VC產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及K. vulgare全基因組的測(cè)序完成[5-6]，利用代謝工程技術(shù)進(jìn)行菌種改造正成為VC生產(chǎn)菌育種的主要手段。目前采用的基因敲除、基因敲入及點(diǎn)突變修飾等基因組改造技術(shù)中，多采用的是抗性篩選標(biāo)記，存在一些弊端：被改造菌株可被使用的抗生素?cái)?shù)量有限；多基因改造會(huì)因抗性標(biāo)記的疊加使用影響目的菌的正常生長(zhǎng)；抗性基因本身是外源基因，并不是宿主菌生長(zhǎng)所必需，在食品行業(yè)產(chǎn)品使用中受到限制等[7-9]。所以，迫切需要研發(fā)K. vulgare基因組的無(wú)痕改造技術(shù)，以克服傳統(tǒng)的基因組改造技術(shù)中“疤痕”的存在和篩選標(biāo)記不能反復(fù)使用的不足，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的連續(xù)敲除，最終獲得VC高產(chǎn)優(yōu)良菌種。

K. vulgare中存在upp基因，可編碼尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（uracil phosphoribosyl transferase，UPRT），使細(xì)胞不能合成尿嘧啶，只能利用胞外尿嘧啶。5-氟尿嘧啶是胸腺嘧啶類似物，也能作為UPRT的底物被轉(zhuǎn)化成胸苷酸合成酶的強(qiáng)烈抑制劑，即5-氟單磷酸脫氧尿嘧啶（5-f l uoro-2’-deoxyuridine-5’-monophosphate，5-F-dUMP），5-F-d U M P的存在會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡[10-11]。而upp基因缺失后菌體不能利用5-氟尿嘧啶產(chǎn)生毒性，可在含5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而使第2次重組后失去抗性基因和upp基因的突變株得以篩選。因此，借助5-氟尿嘧啶的毒性，UPRT可作為負(fù)向篩選標(biāo)記使用。本實(shí)驗(yàn)利用同源重組，敲除了染色體上UPRT的全長(zhǎng)基因upp，構(gòu)建得到底盤(pán)細(xì)胞K. vulgare Δupp突變株，經(jīng)過(guò)upp基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了UPRT作為負(fù)向篩選標(biāo)記使用的可行性。在此底盤(pán)細(xì)胞的基礎(chǔ)上可以將upp基因作為負(fù)向篩選標(biāo)記，進(jìn)行基因的無(wú)痕敲入、敲除及修飾，克服了使用抗生素篩選標(biāo)記的缺陷，為實(shí)現(xiàn)K. vulgare基因組無(wú)痕修飾，獲得具有高產(chǎn)優(yōu)良性狀的優(yōu)勢(shì)遺傳資源提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和載體

表1 本研究中使用的菌株與質(zhì)粒Table1 Strains and plasmids used in this research

1.1.2 培養(yǎng)基

K. vulgare培養(yǎng)基（含卡那霉素）：葡萄糖20.0 g/L、玉米漿10.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、硫酸銨4.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、卡那霉素50 μg/mL、瓊脂20.0 g/L，pH 6.4～6.7。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0。

K. vulgare固體培養(yǎng)基：山梨醇20.0 g/L、玉米漿5.0 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸二氫銨0.5 g/L、硫酸銨2.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH 6.4～6.7。

K. vulgare篩選培養(yǎng)基：蔗糖100.0 g/L、山梨醇20.0 g/L、玉米漿5.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、磷酸二氫銨0.5 g/L、硫酸銨2.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH 6.4～6.7。

1.1.3 試劑

ExTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ寶生物工程（大連）有限公司；HiFi DNA聚合酶北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶 NEB（北京）有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素 上海生工生物工程有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-gal） 美國(guó)Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 鼎國(guó)生物工程公司；5-氟尿嘧啶 上海譜振生物科技有限公司；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 K. vulgare對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性測(cè)定

5-氟尿嘧啶對(duì)K. vulgare野生型有一定毒性，會(huì)抑制其生長(zhǎng)，當(dāng)5-氟尿嘧啶質(zhì)量濃度達(dá)到一定值時(shí)會(huì)使細(xì)胞死亡；為了確定其對(duì)K. vulgare生長(zhǎng)抑制的最低質(zhì)量濃度，在含不同質(zhì)量濃度的5-氟尿嘧啶液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中對(duì)野生型K. vulgare進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)[12]設(shè)定測(cè)試的5-氟尿嘧啶最高質(zhì)量濃度為2 mg/mL，隨后通過(guò)二倍稀釋法逐步降低5-氟尿嘧啶的質(zhì)量濃度，選用4 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別為0、0.5、1.0、2.0 mg/mL。為保證接種量一致，接種前用無(wú)菌0.9% NaCl溶液稀釋調(diào)整菌懸液的OD600nm為0.7，4 個(gè)5-氟尿嘧啶質(zhì)量濃度各接種菌液10 μL。液體培養(yǎng)基放置在30 ℃條件下，180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔6 h觀察記錄菌株生長(zhǎng)情況。固體平板用相同的接種環(huán)接種后放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)，24 h后觀察記錄菌株生長(zhǎng)情況。

1.3.2 敲除upp基因打靶載體的構(gòu)建

以K. vulgare基因組DNA、pEASY質(zhì)粒為模板，利用PCR擴(kuò)增出upp基因的上下游同源臂和卡那抗性基因片段，將3 個(gè)片段等物質(zhì)的量比例混合后作為模板，通過(guò)重疊PCR獲得目的條帶，PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，獲得打靶載體pMD18-T-xqupp，送由上海生工股份有限公司測(cè)序。

1.3.3 K. vulgare Δupp菌株的構(gòu)建

圖1 利用同源雙交換進(jìn)行基因敲除原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of gene deletion based on homologous double switch

K. vulgare中upp基因的敲除是通過(guò)2 次同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)的（圖1）。將重組質(zhì)粒pMD18-T-xqupp電擊轉(zhuǎn)化至野生型K. vulgare感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)第1次同源重組卡那霉素抗性基因被整合到染色體上，利用卡那霉素固體平板篩選出發(fā)生重組的菌株，將發(fā)生第1次重組的菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后會(huì)自發(fā)產(chǎn)生第2次同源重組，此時(shí)可能出現(xiàn)upp基因缺失菌株和缺失基因恢復(fù)菌株，將菌液稀釋涂布于含5-氟尿嘧啶的固體平板上，長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后分別挑取后轉(zhuǎn)接至含5-氟尿嘧啶和卡那霉素的平板上，5-氟尿嘧啶培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而卡那霉素培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的菌株則為目的菌株。

將得到的pMD18-T-xqupp打靶載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化（電擊條件為：2.5 kV/cm電壓、250 Ω電阻、25 μF電容、2 mm電擊杯）于K. vulgare野生型感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，挑取轉(zhuǎn)化子，利用菌落PCR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，從而獲得upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp。

1.3.4 upp基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

以K. vulgare基因組為模板，利用PCR擴(kuò)增出upp基因，將PCR片段回收后與空質(zhì)粒pBBRIMCS-5分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收目的片段后通過(guò)T4連接酶16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，利用菌落PCR驗(yàn)證出構(gòu)建成功的upp基因回補(bǔ)質(zhì)粒pBBR1MCS-5-upp。將構(gòu)建成功的回補(bǔ)質(zhì)粒pBBR1MCS-5-upp電轉(zhuǎn)化到已獲得的upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp的感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)PCR驗(yàn)證獲得upp基因回補(bǔ)菌株K. vulgare Δupp/upp。

1.3.5 工程菌生理活性驗(yàn)證

利用1.3.1節(jié)方法，分別在含有不同質(zhì)量濃度5-氟尿嘧啶的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp和upp基因回補(bǔ)菌株K. vulgare Δupp/upp，定時(shí)觀測(cè)記錄菌株生長(zhǎng)情況，研究工程菌株對(duì)5-氟尿嘧啶的耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 K. vulgare對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性分析

圖2 K. vulgare對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性結(jié)果Fig.2 5-Fluorouracil sensitivity of K. vulgare cultivated in solid (a) and liquid (b) media

如圖2所示，當(dāng)5-氟尿嘧啶質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的野生型K. vulgare不能正常生長(zhǎng)，因此確定5-氟尿嘧啶對(duì)K. vulgare生長(zhǎng)起到抑制作用的最低質(zhì)量濃度為1 mg/mL。

2.2 upp基因缺失菌株的獲得

2.2.1 打靶載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

通過(guò)融合PCR技術(shù)，構(gòu)建帶有upp基因的上下游同源臂和卡那抗性基因片段的重組質(zhì)粒pMD18-T-xqupp。經(jīng)PCR驗(yàn)證，條帶與設(shè)計(jì)條帶大小一致，結(jié)果如圖3。

圖3 pMD18-T-xqupp質(zhì)粒PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR identifi cation of plasmid pMD18-T-xqupp

2.2.2 upp基因缺失菌株的篩選

圖4 K. vulgareΔupp突變株菌落PCR驗(yàn)證Fig.4 Validation of K. vulgare Δ upp deletion mutant

將打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化K. vulgare野生型感受態(tài)細(xì)胞，得到具有卡那抗性的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，利用菌落PCR擴(kuò)增upp基因，結(jié)果如圖4所示，野生型K. vulgare在目的位置能夠擴(kuò)增出條帶，而工程菌株在目的位置沒(méi)有條帶，從而獲得了upp基因缺失的工程菌K. vulgare Δupp。

2.3 upp基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

構(gòu)建upp基因回補(bǔ)質(zhì)粒pBBR1MCS-5-upp，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α，經(jīng)酶切驗(yàn)證，如圖5B所示，質(zhì)粒大小4 800 bp，片段大小630 bp，與理論值一致，說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功。將質(zhì)粒pBBR1MCS-5-upp經(jīng)電轉(zhuǎn)化至K. vulgare Δupp菌株中，得到轉(zhuǎn)化子K. vulgare Δupp/upp，分別對(duì)upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp和轉(zhuǎn)化子K. vulgare Δupp/upp進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如圖5C所示，菌株K. vulgare Δupp不能擴(kuò)增出upp基因，而K. vulgare Δupp/upp能夠擴(kuò)增upp基因，說(shuō)明K. vulgare Δupp/upp菌株中回補(bǔ)了upp基因。

圖5 upp 基因的PCR擴(kuò)增（A）、pBBR1MCS-5-upp 質(zhì)粒酶切（B）及的鑒定（C）Fig.5 PCR Amplif i cation of upp gene (A), enzyme digestion identif i cation of pBBR1MCS-5-upp plasmid (B) and identif i cation of K. vulgare Δupp/upp (C) K. vulgareΔupp/upp

2.4 工程菌株生理活性驗(yàn)證

根據(jù)UPRT的催化功能和5-氟尿嘧啶的毒性原理，upp基因缺失菌株能在含5-氟尿嘧啶的篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而野生型菌株和回補(bǔ)upp基因的工程菌株不能夠生長(zhǎng)。故將K. vulgare、K. vulgare Δupp和K. vulgare Δupp/upp分別接種在含0、1 mg/mL的5-氟尿嘧啶固體和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察菌體的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖6。驗(yàn)證結(jié)果表明upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp在含5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)，而upp基因回補(bǔ)菌株K. vulgare Δupp/upp與野生型菌株K. vulgare一樣，均在不能在含1 mg/mL 5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這3 株菌對(duì)5-氟尿嘧啶的抗性存在顯著差異，說(shuō)明可以將upp基因作為負(fù)向篩選標(biāo)記，與正向篩選標(biāo)記相結(jié)合，在upp基因缺失底盤(pán)細(xì)胞基礎(chǔ)上通過(guò)兩次同源重組，實(shí)現(xiàn)基因組的無(wú)痕修飾與改造。

圖6 5-氟尿嘧啶對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)狀況的影響Fig.6 Effects of 5-f l uorouracil of the growth of mutant strains

3 討 論

利用負(fù)向篩選標(biāo)記實(shí)現(xiàn)基因組無(wú)痕修飾改造方面的研究已取得一定成果。例如Karlinsey[13]于2007年利用Bochner-Maloy培養(yǎng)基與抗性篩選標(biāo)記tetAR相結(jié)合，完成對(duì)沙門(mén)氏菌（Salmonella）的基因無(wú)痕敲除。后Cox[14]、Gerlach[15]等也均采用無(wú)痕敲除方法完成對(duì)沙門(mén)菌基因組的無(wú)痕修飾改造。Mizoguchi[16]、Yang Junjie[17]等選用sacB基因作為負(fù)向篩選標(biāo)記，成功構(gòu)建大腸桿菌（Escherichia coli）的基因無(wú)痕敲除、插入系統(tǒng)。2011年劉霞等[18]基于同源重組技術(shù)用sacB重組載體成功敲除副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的opaR基因。同年Kato等[19]實(shí)現(xiàn)了sarS基因在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的無(wú)痕敲除。但對(duì)于K. vulgare的此類研究還處于空白。

UPRT廣泛存在于原核生物、某些低等真核生物細(xì)胞中，其作為負(fù)向篩選標(biāo)記還鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。K. vulgare中的upp基因全長(zhǎng)630 bp，編碼尿嘧啶生成UPRT，使細(xì)胞合成尿嘧啶。5-氟尿嘧啶是胸腺嘧啶類似物也能作為UPRT的底物被轉(zhuǎn)化成胸苷酸合成酶的強(qiáng)烈抑制劑，即5-F-dUMP，5-F-dUMP的存在會(huì)抑制胸腺嘧啶合成酶活性，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。利用這一特性，尿嘧啶生成UPRT的表達(dá)與否，直接影響菌株對(duì)5-氟尿嘧啶的抗性，影響菌株的存活與否。利用這種生長(zhǎng)差異，借助5-氟尿嘧啶的篩選培養(yǎng)基，就可以對(duì)重組菌進(jìn)行篩選。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)重疊PCR[20-21]、TA克隆[22]、轉(zhuǎn)化[23-25]等方法獲得打靶質(zhì)粒。制備宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，將打靶載體電轉(zhuǎn)至宿主菌感受態(tài)中，經(jīng)2 次同源重組篩選出了K. vulgare Δupp突變株，生理驗(yàn)證該菌株能在含1 mg/mL 5-氟尿嘧啶培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)獲得的upp基因缺失突變株及其對(duì)5-氟尿嘧啶的抗性性狀研究，對(duì)于無(wú)痕遺傳修飾技術(shù)發(fā)展具有重要的參考價(jià)值。

圖7 利用K. vulgareΔupp進(jìn)行基因無(wú)痕敲除原理圖Fig.7 Schematic of scarless gene knockout based on K. vulgare Δupp

為了驗(yàn)證upp基因作為負(fù)向篩選標(biāo)記的可行性，本實(shí)驗(yàn)在upp缺失菌株基礎(chǔ)上，回補(bǔ)了upp基因，該菌株在1 mg/mL 5-氟尿嘧啶培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，說(shuō)明可實(shí)現(xiàn)在upp缺失的底盤(pán)細(xì)胞中利用一次交換2 次重組進(jìn)行基因無(wú)痕敲除（圖7）。打靶質(zhì)粒的構(gòu)建包括被敲除基因的上游同源臂、抗性篩選標(biāo)記基因、可表達(dá)的upp基因和被敲除基因的下游同源臂，第1次重組通過(guò)抗性篩選后，將得到的轉(zhuǎn)化子在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基上孵育后，再涂到含有5-氟尿嘧啶的篩選平板上，只有實(shí)現(xiàn)二次重組的轉(zhuǎn)化子，由于去除了抗性基因和upp基因得以存活，得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子既敲除了目標(biāo)基因又沒(méi)有抗性基因殘留，以此建立了K. vulgare基因組無(wú)痕修飾改造系統(tǒng)，這在國(guó)內(nèi)外屬先進(jìn)技術(shù)。本研究結(jié)果不僅為代謝工程改造K. vulgare獲得優(yōu)良VC高產(chǎn)菌株提供了理論和技術(shù)支持，也為其他工業(yè)菌株的代謝工程改造提供了技術(shù)方法的借鑒。

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Construction of a Marker-Free Deletion System Based on the Uracil Phosphoribosyl Transferase Gene as a Negative Selection Marker in Ketogulonigenium vulgare

LU Hao1, LI Tianming1, LIU Jinlei1, DU Hongyan1, WANG Beichen2, FENG Huiyong1,*
(1. College of Bioscience & Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. College of Agriculture and Life Science, University of Wisconsin, Madison 53706, USA)

By constructing the targeting vector of the uracil phosphoribosyl transferase gene (upp), the upp gene deletion mutant K. vulgare Δupp was obtained using homologous recombination. The mutant was selected as the chassis cell in seamlesss genome modification system. An upp gene expression vector was constructed and transformed into mutant K. vulgare Δupp. After the transformation, an upp gene reverse mutation strain named PBB-upp was obtained, and the feasibility of upp as a negative selectable marker was verified. The results showed that Δupp mutants rather than the wildtype and reverse PBB-upp strains could grow in a medium with 1 mg/mL 5-fluorouracil. Moreover, there were signif i cant differences among the three strains in terms of 5-f l uorouracil resistance, indicating that by combining the upp gene as a negative marker with a positive marker, double homologous recombinations could occur on the chassis cell without the upp gene. In this way, the modif i cation can be achieved without antibiotic marker in Ketogulonigenium vulgare.

Ketogulonigenium vulgare; negative selection marker; scarless gene alteration; 5-f l uorouracil

10.7506/spkx1002-6630-201704007

Q789

A

1002-6630（2017）04-0039-06

陸浩, 李天明, 劉金雷, 等. 基于尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶為負(fù)向篩選標(biāo)記的生酮古龍酸桿菌基因組無(wú)痕修飾系統(tǒng)的構(gòu)建[J].食品科學(xué), 2017, 38(4): 39-44. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704007. http://www.spkx.net.cn

LU Hao, LI Tianming, LIU Jinlei, et al. Construction of a marker-free deletion system based on the uracil phosphoribosyl transferase gene as a negative selection marker in Ketogulonigenium vulgare[J]. Food Science, 2017, 38(4): 39-44. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704007. http://www.spkx.net.cn

2016-04-07

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2014AA022102）

陸浩（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楹铣缮飳W(xué)與代謝工程。E-mail：840835694@qq.com

*通信作者：馮惠勇（1967—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)楹铣缮飳W(xué)與代謝工程。E-mail：fenghuiyong@hotmail.com