安神臍貼對PCPA致失眠大鼠自主活動及GABA、5-HT含量的影響＊

焦富英，李國信，馬 進，牟朝清，甘 雨，喬 敏，喬 鐵

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 沈陽 110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 沈陽 110032）

失眠（insomnia）又稱睡眠障礙（sleep disorders，SD），是指患者睡眠質(zhì)量差，不能滿足個體生理需要，因而影響白天正常工作學(xué)習的睡眠障礙綜合征[1]。失眠屬于中醫(yī)的不寐范疇，是由心神失養(yǎng)或心神不安所致。不寐在《內(nèi)經(jīng)》中稱“不得臥”、“目不暝”，認為是邪氣客于臟腑，衛(wèi)氣行于陽而不得入陰而成。中醫(yī)認為不寐的病因病機是陽勝陰衰，陰陽失交，其治療原則當以補虛瀉實，調(diào)整臟腑陰陽為主。中醫(yī)治療失眠療效顯著，安全可靠，副作用較小，無依賴性，是多數(shù)失眠患者的首選治療方法。中醫(yī)對失眠的常規(guī)療法為口服湯劑和針灸治療，然而口服湯劑有傷脾胃之弊端，針灸有患者暈針之顧慮，為此我們采用安神臍貼外治療法治療失眠。為了驗證安神臍貼對失眠有確切療效，我們設(shè)計了本實驗，通過觀察失眠大鼠用藥前后自主活動的變化情況及血清中神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）的含量變化來觀察安神臍貼對失眠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要儀器

SD大鼠，雄性，SPF級，體重180-220 g；購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。EthoVision大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)，荷蘭NOLUDS公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴箱，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院檢驗科提供，規(guī)格型號：HH-W21-600；全自動快速立式洗板機，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院檢驗科提供，規(guī)格型號：JB-1。受試動物購入后在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院實驗動物研究中心適應(yīng)性觀察飼養(yǎng)后使用。許可證號：SYXK（遼）2012-0003。觀察室溫度20-23℃，相對濕度50%-60%。

1.2 實驗藥物與試劑

安神臍貼由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑中心提供；同仁安神丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號：15015079；對氯苯丙氨酸（4-Chloro-DL-phenylalanine,PCPA）由SIGMA公司生產(chǎn)，批號：SHBD9164V；生理鹽水，華仁藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：Q1611028。Rat 5-HT Elisa kit試劑盒和Rat GABA Elisa kit試劑盒，均購自沈陽天瑞生物科技有限公司，批號：201703。

1.3 模型制備與分組

取健康SD大鼠50只，體重180-220 g，雄性。大鼠腹部剃毛，24 h后按隨機數(shù)字表法分為5組，分別為空白對照組、模型對照組、安神臍貼高劑量組（5.40 g/kg/日）、安神臍貼低劑量組（1.35 g/kg/日）、同仁安神組（2.16 g/kg/日），每組10只。除空白對照組外各組大鼠腹腔注射PCPA（350 mg·kg-1），每日1次，連續(xù)2日，建立失眠大鼠模型。從第3日開始空白組和模型組在神闕穴部位敷空白貼，安神臍貼組每天在神闕穴部位分別給予相應(yīng)劑量的安神臍貼，同仁安神丸組灌胃給藥，連續(xù)給藥5天。安神臍貼組每日更換相應(yīng)劑量的臍貼，同仁安神丸組每日按規(guī)定劑量灌胃給藥。高、低劑量的安神臍貼形狀相同，含藥量不同。實驗動物于末次給藥60 min后，采用EthoVision大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)記錄大鼠自主活動情況，自主活動測試箱為1.0 m×1.0 m正方形不銹鋼箱，箱內(nèi)中央0.5 m×0.5 m正方形區(qū)域劃分中央?yún)^(qū)，其余為周邊區(qū)，記錄10 min內(nèi)大鼠移動距離、速度、出現(xiàn)在中央?yún)^(qū)的頻率及在中央?yún)^(qū)累計停留時間。取各組大鼠血清，測五羥色胺（5-HT），γ-氨基丁酸（GABA）含量。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 安神臍貼對大鼠自主活動的影響

正常SD大鼠連續(xù)2天以350 mg·kg-1的PCPA腹腔注射后，晝夜睡眠-覺醒平衡規(guī)律被破壞，提示造模成功。行為學(xué)表現(xiàn)為不分晝夜的自主活動度增高，并出現(xiàn)焦躁，食欲減退，精神萎靡等現(xiàn)象。給予安神臍貼、同仁安神丸治療5天后，大鼠的睡眠-覺醒規(guī)律慢慢恢復(fù)，表現(xiàn)為白天活動度減少，安靜，倦怠，蜷臥，不易被外界打擾，精神好轉(zhuǎn)，食欲漸增。與模型組相比，安神臍貼低劑量組和同仁安神丸組大鼠自主活動的速度、移動距離差異顯著(P＜0.05），安神臍貼高劑量組大鼠自主活動的速度、移動距離差異非常顯著(P＜0.01）。提示安神臍貼和同仁安神丸對PCPA致失眠大鼠均有鎮(zhèn)靜作用，但安神臍貼組效果更明顯。詳見表1。

表1 安神臍貼對PCPA致失眠大鼠自主活動的影響(±s,n=10)

表1 安神臍貼對PCPA致失眠大鼠自主活動的影響(±s,n=10)

注：與空白對照組比較：＊P＜0.05；與模型對照組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

圖1為各組PCPA致失眠大鼠運動軌跡。由圖1可見，PCPA造模后，大鼠運動明顯增多，經(jīng)安神臍貼治療后，運動減少，高劑量組減少明顯，同仁安神丸也可減少大鼠的自主的活動。但是安神臍貼高劑量組自主活動減少最明顯。

2.2 安神臍貼對各組大鼠血清中GABA、5-HT含量的影響。

實驗7天后，各組大鼠處死，取血清，采用ELISA法測5-HT，GABA含量。結(jié)果顯示，模型組血清中GA?BA含量低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，安神臍貼低劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），安神臍貼高劑量組和同仁安神丸組與模型組比較，差異有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。模型組血清中5-HT含量明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；安神臍貼低劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），安神臍貼高劑量組和同仁安神丸組與模型組比較，差異有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），安神臍貼高劑量組療效好于同仁安神丸組。說明安神臍貼對PC?PA致失眠大鼠神經(jīng)因子GABA、5-HT有調(diào)節(jié)作用。提示安神臍貼調(diào)節(jié)睡眠的機制與調(diào)節(jié)具有促眠作用的因子GABA、5-HT有關(guān)。詳見表2。

圖1 各組PCPA致失眠大鼠運動軌跡圖

表2 各組大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量變化(±s,n=10)

表2 各組大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量變化(±s,n=10)

注：與空白對照組比較：*P＜0.05與模型對照組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

5-HT（ng·L-1）122.57±4.37##102.14±7.21**120.35±4.94#128.85±6.10*##124.14±5.40##空白對照組模型對照組安神臍貼低劑量組安神臍貼高劑量組同仁安神組GABA（μmol·L-1）5.30±0.22##4.36±0.37**4.88±0.21*#5.36±0.60##5.42±0.38##

3 討論

睡眠是保證人體健康、使疲勞的身體快速復(fù)原、保持精力的有效途徑。正常人大概有三分之一的時間都處于睡眠狀態(tài)，只有保證充足的睡眠生命體才能正常有序的進行各種生命活動。然而，隨著社會的不斷發(fā)展，工作壓力的不斷增大，失眠所帶來的問題也越來越嚴重[2-4]。中醫(yī)認為失眠的主要病位在心，然心為火臟，火靜則神安而寐，火盛，則魂不守舍而失眠。心火亢盛，心經(jīng)火勝是失眠在臨床中常見的分型，其治療多從清心火、安心神入手。安神臍貼由酸棗仁、黃連、五味子，琥珀粉按照16∶14∶14∶1的比例配伍而成，主要針對心火偏盛型失眠。酸棗仁味甘酸，性平，主歸心、肝、膽經(jīng)，為養(yǎng)心安神之要藥。黃連味苦性寒，主歸心經(jīng)，尤善清瀉心經(jīng)實火。五味子，味甘酸性溫，主歸心、腎經(jīng)，具有補益心腎，寧心安神之功效。琥珀味甘性平，主歸心，肝二經(jīng)，其質(zhì)重而鎮(zhèn)，具有鎮(zhèn)靜安神之功效。四味藥物相輔相成，共同發(fā)揮清心瀉火，寧心安神之功效。藥物貼臍療法至今已有2000多年的歷史，是以中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說為理論基礎(chǔ)，針對不同疾病的不同需要，選擇相應(yīng)藥物，貼敷于肚臍即神闕穴的部位，使藥物通過臍部皮膚滲透和經(jīng)絡(luò)傳導(dǎo)作用到達患病部位從而發(fā)揮藥效的一種傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)外治療法。在《五十二病方》現(xiàn)存283個配方中，有70多個配方涉及到臍療法，開創(chuàng)了臍療法的先河[5]。臍是神闕穴所在的位置，為生命的元神所居。神闕為任脈的重要穴位[6]，又是沖脈循行之處，任脈為陰脈之海，與陽脈之海督脈互為表里，沖脈為血海，督、任、沖三脈“一源三岐”，內(nèi)聯(lián)五臟六腑，外達四肢百骸，皮膚筋膜，無處不走。此為臍療法治療多種疾病提供了理論依據(jù)。現(xiàn)代研究認為[7-8]，臍在胚胎發(fā)育過程中為腹壁最后閉合處，其下分布著豐富的靜脈網(wǎng)和皮下動脈分支，與人體其他部位皮膚結(jié)構(gòu)相比，其表皮角質(zhì)層最簿，屏障功能最弱，有利于藥物滲透吸收。由于藥物透皮吸收和皮膚厚度成反比，與皮膚的擴散性成正比，所以臍部的特殊構(gòu)造具有透皮療法的得天獨厚的優(yōu)勢。除此以外，藥物分子可通過臍部進入細胞間質(zhì)，直接進入血液，避免口服經(jīng)過胃腸被消化液破壞而影響藥效發(fā)揮，同時又能減少藥物給肝腎帶來的不良反應(yīng)，以及對胃腸道的刺激和對消化功能的不良影響。

失眠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的平衡失調(diào)密切相關(guān)[9]。現(xiàn)有實驗研究表明，睡眠障礙患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生改變，致使興奮和抑制的平衡被破壞[10]。GABA是一種非蛋白質(zhì)性氨基酸，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠?qū)Υ蟛糠稚窠?jīng)元發(fā)揮抑制作用，其表達量的多少在睡眠的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[11]。另有實驗研究表明[12]，當大腦處于睡眠狀態(tài)時大腦皮層所釋放的GABA含量是清醒狀態(tài)時的3倍。因此失眠與血清中GABA表達量的多少有密切關(guān)系。本實驗研究結(jié)果顯示，安神臍貼能夠升高抑制性氨基酸GABA的表達量，對失眠有良好的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT參與調(diào)解多種生理功能，其主要集中在腦干中縫核(DRN)，在中樞系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量較少，但其軸突分布廣泛，可支配腦的所有區(qū)域，調(diào)控腦的總體功能，下丘腦內(nèi)存在“睡眠中樞”和“覺醒中樞”，下丘腦與腦干處的相關(guān)區(qū)域相互作用，共同完成對睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)[13，14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用5-HT也能起到增加睡眠的作用，證實了5-HT是能夠促進睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)[15-17]，5-HT濃度升高時，肌體就會感到疲乏并產(chǎn)生睡意。PCPA是一種色氨酸類抑制劑，通過減少色氨酸攝入和增加轉(zhuǎn)運載體數(shù)量來減少大腦內(nèi)5-HT合成和釋放[18]。PCPA致失眠大鼠模型是目前公認的并廣泛應(yīng)用于各類神經(jīng)遞質(zhì)關(guān)系研究的經(jīng)典模型。

本實驗結(jié)果顯示：安眠臍貼能減少大鼠的自主活動次數(shù)，提示安眠臍貼有明顯的鎮(zhèn)靜作用。腹腔注射PCPA可導(dǎo)致大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)GABA、5-HT表達量發(fā)生顯著變化，采用安神臍貼低劑量、高劑量干預(yù)后，與模型組相比，GABA、5-HT的表達量升高?？梢?，安神臍貼有明顯的鎮(zhèn)靜作用，安眠臍貼調(diào)節(jié)睡眠的機制與調(diào)節(jié)具有促眠作用的因子GABA、5-HT有關(guān)，抑制興奮促進睡眠，調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期平衡。

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