滋腎陰、溫腎陽顆粒及關(guān)鍵藥對(duì)防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥“病證結(jié)合”新藥創(chuàng)制研究＊

趙東峰，舒 冰，唐德志，張 巖，趙永見，李晨光，王 強(qiáng)，梁倩倩，崔學(xué)軍，楊燕萍，徐 浩，施 杞，王擁軍,4＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所 上海 200032；3.教育部筋骨理論與治法重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 上海 200032）

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥（Primary osteoporosis，POP）臨床表現(xiàn)為骨痛、腰背痛和駝背等癥狀[1]。由于患者骨骼系統(tǒng)的脆性增加，輕微外力作用下輕易造成骨折，對(duì)健康造成威脅。全球目前約有2億患者，美國(guó)、歐洲和日本大約有7 500萬人罹患此病[2]。隨著老年社會(huì)的到來，中國(guó)POP的發(fā)病率也逐漸升高。在60-64歲婦女人群，POP發(fā)生率為53.8%，而在65-69歲人群發(fā)生率達(dá)到70%，患者并發(fā)癥骨折的發(fā)生率分別為27.5%和32.6%[3]，對(duì)患者和家人造成巨大的危害。因此，針對(duì)POP治療開發(fā)更加安全有效、價(jià)格低廉的藥物成為未來應(yīng)對(duì)POP的重要策略。

補(bǔ)腎益精法是中醫(yī)藥治療POP的重要法則，前期臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究[4,5]發(fā)現(xiàn)，腎主導(dǎo)人體骨的生長(zhǎng)、發(fā)育、強(qiáng)勁、衰弱，尤其是骨與人體腎精盛衰的關(guān)系密切?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》：“腎主骨，生髓”、“腎，其充在骨”?！夺t(yī)精經(jīng)義·中卷》曰“骨內(nèi)有髓、骨者髓所生……腎藏精、精生髓，故骨者，腎之所合也”，強(qiáng)調(diào)腎精決定人體骨骼的狀態(tài)。根據(jù)中醫(yī)治療POP病癥結(jié)合的原則，辨證論治也存在溫腎陽、滋腎陰治法的區(qū)別[6,7]，臨床根據(jù)腎陰虛、腎陽虛癥狀的區(qū)別和側(cè)重，治療時(shí)分別應(yīng)用滋腎陰和溫腎陽法給予施治。

本項(xiàng)目組通過大樣本臨床流行病學(xué)調(diào)查，驗(yàn)證了病證結(jié)合防治POP分子流行病學(xué)規(guī)律。在國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目、國(guó)家教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”計(jì)劃項(xiàng)目、國(guó)家科技部重點(diǎn)領(lǐng)域“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”計(jì)劃項(xiàng)目等大力支持下，完成了中國(guó)華東、華北、東南、東北、西北城市人口地區(qū)完成6 447例POP“證病結(jié)合”臨床流行病學(xué)調(diào)查，證明POP患者多出現(xiàn)倦怠乏力、骨骼疼痛、腰膝酸軟、畏寒肢冷、下肢抽筋、齒搖發(fā)脫等“腎精虧虛”表現(xiàn)，且頻次較高，約占83%，其中“腎陽虛證”34%，“腎陰虛證”49%，上述研究明確了“腎精虧虛”是POP主要證候[8]。

“病癥結(jié)合”是治療POP重要策略，滋腎陰和溫腎陽法則是體現(xiàn)“腎精虧虛”和“病癥結(jié)合”的法則的重要體現(xiàn)[5]。在此研究基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目組通過分析施杞教授治療POP的2 646張?zhí)幏?，?chuàng)制出新型制劑滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒，臨床取得較好的效果。下文將從病證結(jié)合防治POP臨床試驗(yàn)研究驗(yàn)證、病證結(jié)合防治POP基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究、病證結(jié)合防治POP的中醫(yī)理論綜合分析等方面進(jìn)行描述。

1 溫腎陽、滋腎陰顆粒防治POP的分子流行病學(xué)研究

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院骨傷科團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了滋腎陰、溫腎陽顆粒治療POP的多中心、雙盲、安慰劑對(duì)照結(jié)合中醫(yī)證型設(shè)計(jì)的隨機(jī)對(duì)照研究[9]。研究中POP患者來源于四個(gè)中心（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院、上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院、西安市紅十字會(huì)醫(yī)院4個(gè)中心，時(shí)間：2011.02-2012.04）的POP患者。中醫(yī)辨證屬腎虛的患者200例，患者隨機(jī)化分組法先進(jìn)行中心分層，然后進(jìn)行中醫(yī)證型分層，滋腎陰顆粒試驗(yàn)組和安慰劑對(duì)照組各50例，溫腎陽顆粒試驗(yàn)組與安慰劑對(duì)照組分別為50例，共計(jì)200例，比例分配1∶1，試驗(yàn)組和對(duì)照組各100例。觀察指標(biāo)包括骨密度、疼痛（Visual Analogue Scale）VAS評(píng)分、中醫(yī)證候積分、ECOS-16生活質(zhì)量問卷及安全性指標(biāo)。時(shí)間點(diǎn)為治療前、治療3月、治療6月、停藥3個(gè)月和停藥6個(gè)月。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與安慰劑比較，滋腎陰顆粒治療6月可顯著增加腰椎骨密度（P＜0.05），增加幅度為4.1%。停藥后隨訪6月還可增加腰椎骨密度，增加幅度為4.7%；與安慰劑比較，溫腎陽顆粒治療后可顯著降低疼痛程度VAS評(píng)分而改善疼痛（P＜0.05），明顯改善中醫(yī)證候，并能顯著降低ECOS-16評(píng)分而改善生活質(zhì)量（P＜0.05）。且整個(gè)研究過程中沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。該研究證明滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒是一種有效、安全的POP治療方法，可以顯著提高POP腰椎骨密度，減輕疼痛，改善中醫(yī)證候，提高患者生活質(zhì)量。同時(shí)，證明滋腎陰顆粒能明顯提高患者腰椎骨密度，改善腎陰虛證候；溫腎陽方能明顯改善腎陽虛證候和生活質(zhì)量。

2 溫腎陽、滋腎陰顆粒防治POP的藥對(duì)研究

蛇床子、女貞子分別是滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒的主要藥物（君藥），分別具有滋補(bǔ)肝腎陰和溫腎壯陽的作用，其中兩者的中藥配伍目的是達(dá)到“陰中求陽”、“陽中求陰”的效果[10]。藥對(duì)是中醫(yī)臨床遣藥組方最基本的配伍形式，藥對(duì)的合理組方能起到增效減毒的作用。滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒配伍和組方中蘊(yùn)含藥對(duì)的內(nèi)涵。因此，藥物研制過程中分別用女貞子（滋腎陰顆粒）、蛇床子（溫腎陽顆粒）藥對(duì)進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

按照藥劑量的差異，設(shè)置3組，分別體現(xiàn)陽中求陰、陰陽并調(diào)和陰中求陽等3個(gè)差異，分別設(shè)置為A組：蛇床子12 g、女貞子6 g（陽中求陰），B組：蛇床子9 g、女貞子9 g（陰陽平衡），C組：蛇床子6 g、女貞子12 g（陰中求陽）。上述藥對(duì)灌胃干預(yù)去卵巢誘導(dǎo)的POP小鼠模型。結(jié)果顯示蛇床子-女貞子藥對(duì)能夠緩解去卵巢小鼠腰椎骨量丟失，同時(shí)改善改善骨小梁結(jié)構(gòu)。隨后應(yīng)用有效組分進(jìn)行細(xì)胞水平的機(jī)制研究。分別應(yīng)用小鼠的原代間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞，證明溫腎陽、滋腎陰顆粒中藥物有效組分蛇床子素（蛇床子）、女貞苷（女貞子）分別調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)OPG表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞形成。同時(shí)，蛇床子素能夠刺激成骨細(xì)胞的分化[11,12]。

3 病證結(jié)合防治POP基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究

滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒有效組分研究對(duì)闡述藥物在分子水平的作用具有重要意義。團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒有效組分建立了“中藥防治骨質(zhì)疏松癥體外篩選系統(tǒng)”以及“補(bǔ)腎益精中藥有效組分庫”。篩選出補(bǔ)腎益精中藥及有效組分骨碎補(bǔ)總黃酮、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、蛇床子素能夠顯著增加成骨細(xì)胞中骨發(fā)生形態(tài)蛋白的表達(dá)[13-18]。利用Wnt/β-Catenin、BMP2/4/7、OPG基因敲除小鼠和去卵巢大鼠模型，建立了“補(bǔ)腎益精中藥防治骨質(zhì)疏松癥體內(nèi)篩選系統(tǒng)”。證明了溫腎陽、滋腎陰顆粒及其有效組分[13-18]，如骨碎補(bǔ)總黃酮、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、蛇床子素、齊墩果酸能夠促進(jìn)骨生成，增加骨量。另一個(gè)方面，通過抑制骨吸收而抑制骨丟失。

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究上，通過選擇典型的信號(hào)途徑為研究切入點(diǎn)，闡明補(bǔ)滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒調(diào)控骨代謝的分子機(jī)制。滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒中藥及有效組分通過系統(tǒng)調(diào)控Wnt/β-Catenin和RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路的表達(dá)，分別調(diào)控骨生成和骨吸收的平衡，發(fā)揮“系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨代謝平衡”的作用。具體而言，明確了溫腎陽顆粒和滋腎陰顆粒通過上調(diào)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，促進(jìn)骨髓間充干細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)骨生成；同時(shí)，可以間接調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG信號(hào)軸活性從而調(diào)控造血干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，抑制骨吸收[13-17]，其中淫羊藿苷、骨碎補(bǔ)總黃酮上調(diào)β-Catenin信號(hào)通路，補(bǔ)骨脂素上調(diào)BMP信號(hào)通路。蛇床子素上調(diào)成骨細(xì)胞中β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制RANK相關(guān)信號(hào)通路的活性[18]。

圖1 “病證結(jié)合、調(diào)和腎陰腎陽”理論指導(dǎo)下滋腎顆粒和溫腎陽顆粒防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的新藥創(chuàng)制流程

4 溫腎陽、滋腎陰顆粒防治POP的系統(tǒng)調(diào)控作用

滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒分別體現(xiàn)補(bǔ)腎益精法中“陽中求陰”和“陰中求陽”的法則，其作用體現(xiàn)出陰陽并調(diào)的生理作用。具體而言，在骨骼系統(tǒng)，分別刺激骨生成和抑制骨吸收；在細(xì)胞水平[19]，分別發(fā)揮刺激成骨細(xì)胞的分化和功能，另外系統(tǒng)調(diào)控作用是抑制破骨細(xì)胞的功能；整體而言，其機(jī)制類似于恢復(fù)人體的陰陽動(dòng)態(tài)的平衡；對(duì)于POP患者而言，就是在骨重建內(nèi)恢復(fù)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡[10]。

在刺激成骨細(xì)胞分化的骨生成方面，滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒能夠刺激對(duì)間充干細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的分化，其分子機(jī)制與其能夠調(diào)控Notch信號(hào)途徑的表達(dá)有關(guān)[20]。分別調(diào)控間骨髓充質(zhì)干細(xì)向成骨細(xì)胞的分化，同時(shí)促進(jìn)去分泌骨生成相關(guān)因子的表達(dá)。滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：其一，補(bǔ)腎中藥調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和生成；其二，補(bǔ)腎中藥能夠抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能；其三，補(bǔ)腎中藥能夠維持骨吸收和骨生成之間的平衡，維持骨穩(wěn)態(tài)。綜合目前研究發(fā)現(xiàn)，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒能夠調(diào)控骨生成和骨吸收之間的平衡，臨床治療能夠增加POP患者的骨密度和改善患者癥狀。

5 討論

滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒的藥物研制是中醫(yī)基礎(chǔ)理論、辨證論治、臨床流行病學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科綜合努力的成果，體現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)思想。兩者的開發(fā)分別從中辨證論治和病癥結(jié)合指導(dǎo)，從臨床流行病學(xué)調(diào)查、辨證論治、臨床RCT驗(yàn)證、疾病動(dòng)物模型、藥對(duì)研究驗(yàn)證和有效組分分子機(jī)制研究。研究模型涉及臨床患者（中醫(yī)理論指導(dǎo)）、動(dòng)物模型、骨骼系統(tǒng)、多能干細(xì)胞、骨細(xì)胞等水平，全面驗(yàn)證藥物的作用機(jī)制，是臨床與基礎(chǔ)研究比較成功的研究案例（見圖1）。綜合前期研究，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒的開發(fā)從四個(gè)方面的進(jìn)行闡述：病證結(jié)合防治POP分子流行病學(xué)規(guī)律；病證結(jié)合防治POP臨床試驗(yàn)研究驗(yàn)證；病證結(jié)合防治POP基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究機(jī)制病證結(jié)合防治POP；中醫(yī)理論綜合分析。其研究的優(yōu)勢(shì)在于將中醫(yī)理論和臨床結(jié)合起來，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療POP的系統(tǒng)調(diào)控作用。在揭示滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒治療POP機(jī)制的同時(shí)，也闡明中醫(yī)藥系統(tǒng)調(diào)控骨骼系統(tǒng)的特征。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人體的陰陽平衡是維持健康的因素，中醫(yī)藥作用于人體的機(jī)制在于恢復(fù)人體的穩(wěn)態(tài)。促使人體亢奮的功能得到抑制，而低下的更能得到提升。對(duì)于POP而言，破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收超過成骨細(xì)胞所主導(dǎo)的骨生成是其基本病理改變[20]。因此，藥物能夠抑制骨吸收或者刺激骨生成均能夠用來治療POP[22,23]。目前為止，臨床的藥物大多抑制骨吸收或者刺激骨生成，而能夠同時(shí)調(diào)控骨吸收和骨生成的藥物相對(duì)缺少。按照POP的基本病理改變，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒能夠發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)控的作用，既能夠增加骨生成，也能夠抑制骨吸收，理論而言能夠增強(qiáng)臨床治療POP的效果；另外滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒的優(yōu)勢(shì)是降低副作用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)通過抑制骨吸收治療POP的藥物存在各種各樣的副作用[24,25]。因此，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒治療POP的優(yōu)勢(shì)在于系統(tǒng)調(diào)控，同時(shí)其優(yōu)勢(shì)在于副作用較小。

但是，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒藥物研究還需要解決下面的問題：一、溫腎陽和滋腎陰顆粒均能夠治療POP，兩者存在共同之處，但是兩者有無差別？差別體現(xiàn)在何處？二、溫腎陽和滋腎陰顆粒均能夠刺激骨生成、抑制骨吸收，發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)控作用，但是兩者差異能否在刺激骨生成、抑制骨吸收的體現(xiàn)出來？為何中醫(yī)又強(qiáng)調(diào)滋腎陰和溫腎陽的區(qū)別？三、兩者對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞作用有無差異？這能否是溫腎陽和滋腎陰差異的物質(zhì)基礎(chǔ)？雖然，前期研究我們發(fā)現(xiàn)溫腎陽顆粒改善POP患者癥狀突出，如疼痛和生活質(zhì)量。而滋腎陰顆粒延緩骨丟失癥狀明顯，如骨密度，但是這些區(qū)別是否真正的存在，還需要在未來的藥物機(jī)制研究、藥理學(xué)和臨床研究中加以驗(yàn)證。因此，后續(xù)研究要尋找兩者的共同之處，同時(shí)要尋找兩者差異之處，并闡述其共性和個(gè)性的機(jī)制。

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