單味中藥對(duì)牦牛多殺性巴氏桿菌的體外抑菌試驗(yàn)

李輝明

(青海省同仁縣畜牧獸醫(yī)工作站， 青海 同仁 811399)

牦牛主要分布在海拔3 000～5 000 m的高寒缺氧地區(qū)喜馬拉雅山脈和青藏高原的特有的乳、肉、役、毛等兼用地方家畜品種，牦牛不僅是牧區(qū)主要?jiǎng)趧?dòng)力，還為生產(chǎn)、生活提供可用資源。多殺性巴氏桿菌是一種兩端鈍圓、短桿狀革蘭陰性菌，該菌屬于巴氏桿菌科，巴氏桿菌屬，該菌具有A、B、D、E和F 5個(gè)血清型，多殺亞種、敗血亞種及殺禽亞種3個(gè)亞種。多殺性巴氏桿菌廣泛分布環(huán)境中，是重要的人獸共患病細(xì)菌，可以引發(fā)雞、牛、羊、豬、鹿、貉子、水貂等多種動(dòng)物及人發(fā)病，對(duì)不同動(dòng)物均有不同的致病性，其中，家畜動(dòng)物中以牛、水牛、牦牛、羊、馬等易感，急性呈出血性敗血癥癥狀，感染率和死亡率均較高[1]。牦牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌所引起的以內(nèi)臟器官?gòu)V泛出血、高熱和肺炎為特征的急性敗血性傳染病，臨床上以黏膜和各臟器出血、脾臟和肝臟腫大為主要的特征，慢性病例多在肝臟等局部發(fā)生壞死性病灶或炎性病灶，死亡率通常在20%～30%之間，給我國(guó)的牦牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

目前，牦牛巴氏桿菌病主要通過(guò)抗生素進(jìn)行治療，在牦牛養(yǎng)殖過(guò)程中，由于不合理的使用抗菌藥物，對(duì)牦牛巴氏桿菌產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，治療效果不佳，同時(shí)也造成了大量的藥物殘留[8]。中藥富含多種有效抗菌成分，具有無(wú)殘留、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽疾病防治中[9]。本研究利用平板打孔法和二倍試管稀釋法分別測(cè)定22味中藥對(duì)臨床分離的牦牛致病性多殺性巴氏桿菌體外抑菌效果，篩選出對(duì)牦牛致病性多殺性巴氏桿菌敏感的中藥，為牦牛致病性多殺性巴氏桿菌病的防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株 臨床分離的牦牛致病性多殺性巴氏桿菌菌株，由青海省同仁縣畜牧獸醫(yī)工作站疾病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑及儀器 五味子、金銀花等22味中藥，購(gòu)自同仁縣醫(yī)藥大藥房；7%動(dòng)物血平板、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自北京博奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無(wú)支原體犢牛血清，購(gòu)自山西潤(rùn)生生物材料有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(由上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn))；雙人超凈工作臺(tái)(由上海申順生物科技有限公司生產(chǎn))；7%綿羊脫纖血平板由高壓滅菌鍋、天平、燒杯等常規(guī)的儀器及試劑由青海省同仁縣畜牧獸醫(yī)工作站疾病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 單味中藥藥液的制備 利用水煮法制備22味中藥的藥液，用干燥箱烘干后，稱量50 g，加入8～10倍蒸餾水，浸泡1～2 h后，煮沸后用慢火文煮30 min，12層紗布過(guò)濾后，加入5倍的蒸餾水再煮1次，合并2次水煮藥液，濃縮原藥液濃度為1 g/mL，離心、分裝，121 ℃高壓滅菌15 min后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 試驗(yàn)菌液的制備與計(jì)數(shù) 將牦牛致病性多殺性巴氏桿菌菌株室溫復(fù)蘇，接種于7%動(dòng)物血平板，置37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落接種于含5%犢牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯， 37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，利用平板細(xì)菌計(jì)數(shù)法，對(duì)培養(yǎng)好的牦牛致病性多殺性巴氏桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為106CFU/mL。

2.3 中藥體外抑菌圈直徑的測(cè)定 利用平板打孔法測(cè)定22味中藥體外抑菌圈直徑。在無(wú)菌的條件下取調(diào)整好的菌液0.1 mL(106CFU/mL)均勻涂在7%動(dòng)物血平板上，用直徑6 mm打孔器進(jìn)行打孔，每孔內(nèi)加滿中藥液體，對(duì)照孔加入等量營(yíng)養(yǎng)肉湯，每種藥物重復(fù)3次。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，測(cè)量抑菌圈直徑，取每種藥物重復(fù)3次平均值。判定標(biāo)準(zhǔn)為：10 mm<抑菌直徑為低敏；10 mm≤抑菌直徑<15 mm為中敏；15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏；20 mm≤抑菌直徑為極敏[3]。

2.4 中藥MBC的測(cè)定 利用二倍試管稀釋測(cè)定MBC[10]，取12只編號(hào)的滅菌的試管，每個(gè)試管中加入無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯4 mL，在第1管中加4 mL中藥水提物混勻，取出4 mL混合藥液放入第2管，取出4 mL放入第3管，依此類推，稀釋到第10管，棄去4 mL，第11管為陽(yáng)性對(duì)照，第12管為陰性對(duì)照。在1～11只試管中加入菌液40 μL(106CFU/mL)，每一種藥物3個(gè)重復(fù)，混合均勻后，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，將每個(gè)藥物不同濃度的培養(yǎng)物接種于普通培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)中藥水提物濃度梯度為該藥的MBC。

3 結(jié)果

中藥體外抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果

表1 22味中藥抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果 (mm)

-：無(wú)敏感性，下表同

由表1可知，牦牛致病性多殺性巴氏桿菌對(duì)金銀花、黃連、五味子、板藍(lán)根、透骨草、連翹5種藥物極度敏感，抑菌圈在16.6 mm～18.7 mm之間；對(duì)白頭翁、黃芩、五倍子、訶子、醬敗草、大黃、防風(fēng)、紫花地丁8種藥物中度敏感；對(duì)秦皮、蒲公英2種藥物低敏；對(duì)其他藥物無(wú)敏感性。

表2 22味中藥MBC測(cè)定結(jié)果 (mg/mL)

由表2可知，牦牛致病性多殺性巴氏桿菌對(duì)金銀花、黃連、五味子、板藍(lán)根、透骨草、連翹5種藥物MBC最小，MBC在7.8 mg/mL～15.63 mg/mL之間；對(duì)白頭翁、黃芩、訶子、五倍子、醬敗草、大黃、防風(fēng)、紫花地丁8種藥物的MBC在62.5 mg/mL ～125 mg/mL之間；黃芩、秦皮、蒲公英3種藥物的MBC在250 mg/mL～500 mg/mL，對(duì)其他藥物無(wú)敏感性。

4 討論

牦牛是分布于海拔3 000～5 000 m的高寒缺氧地區(qū)特有的乳、肉、役、毛等兼用地方家畜品種，為青海地區(qū)主要養(yǎng)殖動(dòng)物。近幾年，關(guān)于牦牛的多殺性巴氏桿菌病報(bào)道越來(lái)越多[3]。

因此，多殺性巴氏桿菌病成為了牦牛養(yǎng)殖過(guò)程中常見的傳染性疾病。多殺性巴氏桿菌廣泛存在環(huán)境中，傳播途徑廣泛，是重要的條件致病菌，可以引發(fā)多種動(dòng)物發(fā)病。當(dāng)外界條件發(fā)生改變時(shí)，天氣突變、晝夜溫差大，轉(zhuǎn)群、動(dòng)物的長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)榷喾N應(yīng)激反應(yīng)等，均會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體的抵抗力降低，引發(fā)動(dòng)物的多殺性巴氏桿菌病。當(dāng)動(dòng)物感染了多殺性巴氏桿菌后，通過(guò)咳嗽、噴嚏排出的病原菌引起其他動(dòng)物發(fā)病，因此，該病不容易被控制。多殺性巴氏桿菌疫苗雖然已有研制，在兔的養(yǎng)殖過(guò)程中被廣泛應(yīng)用，但是在牦牛沒(méi)有完全應(yīng)用。

可能由于地域和血清型的差異[4]。牦牛巴氏桿菌主要利用抗生素治療，但是抗生素易產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，降低了治療效果，同時(shí)也造成牦牛肉等畜產(chǎn)品中大量的藥物殘留。因此，利用中藥防治牦牛巴氏桿菌成為新的研究方向。

本試驗(yàn)測(cè)定22味中藥對(duì)牦牛致病性多殺性巴氏桿菌體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示，牦牛致病性多殺性巴氏桿菌對(duì)金銀花、黃連、五味子、板藍(lán)根、透骨草、連翹5種藥物極度敏感，抑菌圈直徑在16.6 mm～18.7 mm之間，MBC在7.8 mg/mL～15.63 mg/mL之間。對(duì)其他藥物存在不同程度的敏感性。常超越等[3]報(bào)道了對(duì)五倍子、白頭翁、黃芩等9種藥物對(duì)雞源致病性多殺性巴氏桿菌高敏。曲徑等[5]研究表明了黃連、黃柏、地榆、艾葉4種藥物對(duì)禽多殺性巴氏桿菌敏感。中藥富含多種活性的化學(xué)抗菌物質(zhì)，但是中藥的抗菌機(jī)理尚未研究明確，有待進(jìn)一步研究中藥的抗菌機(jī)理。本研究為進(jìn)一步研發(fā)復(fù)方中藥制劑防治牦牛致病性多殺性巴氏桿菌病提供理論基礎(chǔ)。