人鼠嵌合肝小鼠模型的建立及在HBV致病研究中的應(yīng)用

傅忠星，楊 帆，王 靈，張宏偉，曹廣文

人鼠嵌合肝小鼠模型的建立及在HBV致病研究中的應(yīng)用

傅忠星，楊 帆，王 靈，張宏偉，曹廣文

病毒性肝炎一直是全球范圍內(nèi)一個沉重的肝病負擔，其中以乙型肝炎最為嚴重。由于HBV僅感染靈長類動物，因此其所致肝病很難在動物模型中被復制。人鼠嵌合肝小鼠模型是指將人源肝細胞移植入免疫缺陷的肝損傷小鼠肝內(nèi)而形成的嵌合體小鼠。由于小鼠肝內(nèi)嵌合有人肝細胞，可以在其體內(nèi)模擬HBV的感染，利于進行進一步的機制研究。目前該模型主要以白蛋白啟動子調(diào)控尿激酶（Alb-uPA）小鼠模型和延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fah-/-）小鼠模型為基礎(chǔ)，在人源肝組織和外周血中均可檢測到HBV，并已應(yīng)用于HBV突變、HBV基因功能、抗病毒藥物效果以及HBV與免疫系統(tǒng)的相互作用等方面的研究。本文就傳統(tǒng)HBV感染動物模型的利弊、人鼠嵌合肝小鼠模型的研究進展和改進方法進行綜述。

小鼠模型；乙型肝炎病毒；免疫缺陷小鼠；人源化小鼠；人鼠嵌合肝

HBV引起的乙型肝炎作為一種傳染性強、致癌率高的疾病，多年來一直危害著人類的健康，引起全球疾病負擔的加重。HBV感染不僅能夠引起急、慢性病毒性肝炎，而且能夠誘導肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝細胞癌（hepatocellular cancer, HCC）的產(chǎn)生。世界上3/4以上的HCC患者和約1/3的LC患者是由HBV慢性感染所致[1-2]，而每年因肝衰竭和HBV相關(guān)肝癌死亡的病例超過100萬[3]。針對HBV進行預防和控制，明確HBV具體致病機制對于減輕全球疾病負擔具有重要的意義[4]。

多年來，研究者針對HBV開展了大量的研究，但是HBV的致病過程涉及范圍廣泛，單一的肝組織細胞培養(yǎng)實驗不足以支持該病的相關(guān)研究，因此，對HBV感染動物模型的需求與日俱增。然而在自然狀態(tài)下，HBV感染宿主的范圍有限，僅侵襲靈長類動物（人類和黑猩猩），大大限制了構(gòu)建HBV感染動物模型的可能性。前期的一些研究分別利用不同的動物模型進行HBV相關(guān)的研究。但是，由于這些動物模型均無法充分模擬HBV在自然狀態(tài)下對人體的感染過程，使得通過動物模型證實HBV在肝臟急性炎癥、慢性纖維化和癌癥的發(fā)生發(fā)展過程的作用難以實現(xiàn)[5]。缺乏可用于探索肝炎病毒感染、復制、致病機理的動物模型阻礙了人們對HBV致病機制的深入認識和治療方式的發(fā)展。所以，尋找一種簡便、有效、穩(wěn)定的HBV感染的動物模型是目前研究的主要方向之一。近年來研究人員用人的原代肝細胞直接移植到模型動物體內(nèi)形成人源化鼠嵌合肝動物模型，逐漸獲得了認可。本文在總結(jié)所有HBV動物模型研究的基礎(chǔ)上對人鼠嵌合肝小鼠模型及其所取得的進展進行綜述。

1 傳統(tǒng)乙型肝炎動物模型及其弊端

1.1 黑猩猩模型 黑猩猩在實驗條件下可被HBV感染，由于其是與人類親緣關(guān)系最接近的靈長類動物，且感染病毒亞型與接種亞型一致，表現(xiàn)出與人類急性乙型肝炎相似的免疫反應(yīng)，是研究HBV感染過程中宿主抗病毒反應(yīng)以及評價疫苗和藥物療效的最佳模型[6]。通過黑猩猩模型，發(fā)現(xiàn)HBV感染的肝細胞損傷主要由免疫介導，且特異性CD8+T細胞在病毒清除和病理損傷中起關(guān)鍵作用[7]。但是，黑猩猩感染HBV后癥狀較人類輕，很少發(fā)展為急性重型肝炎，且慢性率也較人類低，加上黑猩猩等非人靈長類動物多屬瀕危物種，其在研究方面的應(yīng)用受到很大限制。若使用黑猩猩作為模型，其花費過于龐大，無論從倫理還是從經(jīng)濟因素來考慮，現(xiàn)階段不適合用靈長類動物模型作為研究模型[8]。

1.2 樹鼩模型 樹鼩在系統(tǒng)進化上與靈長類關(guān)系密切，且在接種HBV后能在肝臟中檢測到HBV的感染和復制，在疾病后期發(fā)展成為肝細胞癌，為HBV致癌這一過程提供了動物實驗依據(jù)[9-10]。然而樹鼩感染過程多為一過性，其體內(nèi)HBV感染過程的短暫性使其不適于HBV慢性感染的研究，也不利于慢性乙型肝炎治療措施的評價，對于該模型還須深入探索[11]。

1.3 土撥鼠模型 土撥鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus, WHV）與HBV同屬嗜肝DNA病毒。WHV感染的土撥鼠可發(fā)生慢性感染并易發(fā)生HCC[12]。WHV模型是研究慢性乙型肝炎感染機制、免疫病理學和免疫治療的有效模型，但由于其遺傳背景與HBV遺傳背景差異明顯，從該模型得到的結(jié)論并不能完全真實的反映HBV在人體內(nèi)的狀態(tài)[13]。

1.4 鴨模型 鴨乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus, DHBV）和WHV、HBV同屬嗜肝DNA病毒。DHBV感染鴨后，基因組主要以共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的形式存在，且在細胞內(nèi)高度穩(wěn)定[14]。DHBV感染模型分布廣泛、價格經(jīng)濟、易飼養(yǎng)且實驗中易于操作，曾被廣泛應(yīng)用于HBV基因突變、細胞表面病毒受體、病毒清除機制以及篩選新的抗病毒藥物的研究。但是，鴨與人類的遺傳背景差異較大，免疫背景不明確，檢測手段相對缺乏，加之上述肝炎病毒與HBV的種屬差異，所觀察到的現(xiàn)象并不能完全真實的反映人類感染HBV的情況[15]。

1.5 小鼠模型

1.5.1 轉(zhuǎn)基因小鼠模型 轉(zhuǎn)基因小鼠模型是最常見的HBV小鼠模型，通過導入不同的HBV片段，研究人員分別構(gòu)建出不同類型的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠[16-17]。HBV雖然不能感染轉(zhuǎn)基因小鼠，但HBV全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟可復制和分泌HBV，該模型在研究HBV的復制及其與宿主的相互作用方面發(fā)揮了一定的作用[18]。此外，利用轉(zhuǎn)基因鼠模型可以確定特定序列的特定作用，如高表達HBx抗原的轉(zhuǎn)基因鼠雖然沒有任何的肝臟疾病特征，但卻最終產(chǎn)生腫瘤，說明HBx有可能是HBV發(fā)揮致癌作用的關(guān)鍵因素[19-20]。

HBV轉(zhuǎn)基因鼠模型的主要缺陷在于HBV產(chǎn)生于基因組中轉(zhuǎn)入的1段HBV序列，病毒無法徹底被清除。此外，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠由于是在胚囊中注射，免疫系統(tǒng)對其基因產(chǎn)物不識別，無法模擬出肝臟炎癥，無法進行炎癌轉(zhuǎn)化研究，無法模擬人類乙型肝炎的免疫病理變化，因此與HBV自然感染存在一定差異[21]。

1.5.2 高壓水動力小鼠模型 高壓水動力小鼠模型采用高壓水動力將含HBV基因組的表達質(zhì)粒經(jīng)尾靜脈注射入小鼠，可觀察到病毒復制與抗原表達，在提高HBV基因組在小鼠肝臟的表達效率的同時避免了免疫耐受。但是隨著小鼠體內(nèi)出現(xiàn)HBV特異性抗體和細胞毒性T淋巴細胞，HBV的復制僅能維持半個月左右，使水動力模型HBV復制持續(xù)時間較短、感染細胞數(shù)量有限，尚無法模擬慢性HBV感染病程，重復性較差。因此該模型對HBV慢性感染機制研究及藥物篩選等方面存在明顯的不足[22]。

1.5.3 病毒載體介導小鼠模型 利用腺病毒載體包裝HBV基因組，可以有效的感染小鼠體內(nèi)肝細胞。然而，該小鼠模型沒有經(jīng)過自然感染，且無法對小鼠肝細胞進行體內(nèi)再感染，無法反映人體免疫系統(tǒng)的清除作用與HBV感染作用之間的關(guān)系。因此，對于構(gòu)建HBV感染模型的作用有限[23-24]。此外，腺病毒感染本身在小鼠體內(nèi)具有誘導免疫反應(yīng)的作用，對實驗結(jié)果會產(chǎn)生一定的影響[25-26]。

2 常見人鼠嵌合肝小鼠模型構(gòu)建

人鼠嵌合肝小鼠模型是指利用同時具有免疫缺陷和肝細胞損傷死亡特性的小鼠模型，將其作為人類疾病體內(nèi)研究的替代品，把人源肝細胞移植入小鼠的肝內(nèi)而形成的嵌合體小鼠。由于小鼠體內(nèi)整合有人肝細胞，因此研究者可以在動物水平模擬HBV對人肝細胞的感染作用并進一步開展機制的研究。對于人鼠嵌合肝小鼠模型的構(gòu)建，有兩點要求必須滿足：①小鼠肝臟必須要進行誘導性損傷，從而為人源性肝細胞的植入創(chuàng)造良好的再生環(huán)境；②小鼠體內(nèi)的免疫系統(tǒng)應(yīng)當適應(yīng)人源性肝細胞的存在，從而使其在小鼠體內(nèi)可以長期生存。目前常見的人鼠嵌合肝小鼠模型主要有兩種，一種是白蛋白啟動子調(diào)控尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子（albumin promoter/enhancer-regulated- urokinase plasminogen activator, Alb-uPA）小鼠為基礎(chǔ)的人鼠嵌合肝模型，另外一種則是以延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, Fah）敲除（Fah-/-）小鼠模型為基礎(chǔ)的人鼠嵌合肝模型。

2.1 Alb-uPA小鼠為基礎(chǔ)的人鼠嵌合肝模型 AlbuPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型是第一種被用于研究人鼠嵌合肝研究的小鼠基本模型，該小鼠攜帶uPA，并受Alb增強子/啟動子調(diào)控。1995年，Rhim等[27]將該模型構(gòu)建出來并用其來研究大鼠肝細胞的功能狀態(tài)。通過小鼠Alb的啟動子調(diào)控小鼠體內(nèi)uPA的表達，使得該小鼠血漿中的尿激酶型血漿素原激活劑活動度增高，從而引起小鼠肝細胞的損傷，為后續(xù)移植入外源性肝細胞并促進其生長創(chuàng)造了條件。由于uPA轉(zhuǎn)基因具有強烈促進外源性肝細胞再生的能力，研究人員將其與免疫缺陷鼠如重組體激活基因2（recombinant activation gene-2, Rag2）基因敲除（Rag2-/-）小鼠或重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunode fi ciency, SCID)小鼠進行雜交，從而獲得滿足人鼠嵌合肝模型構(gòu)建的小鼠模型。根據(jù)與uPA小鼠模型所雜交的免疫缺陷小鼠類型的不同，研究人員分別獲得了uPA/ Rag2-/-小鼠和uPA/SCID小鼠。Rag2-/-小鼠無法正常表達Rag2，從而缺少正常的T、B淋巴細胞。將uPA小鼠與Rag2-/-小鼠雜交獲得的uPA/Rag2-/-小鼠模型既具備肝細胞進行性死亡的特性，又處于免疫缺陷狀態(tài)。該小鼠模型在2001年被首次應(yīng)用于人鼠嵌合肝的構(gòu)建并進行HBV感染研究。在移植入人源肝細胞的小鼠中被證實能表達人源白蛋白，且免疫組織化學等實驗顯示人源性肝細胞在小鼠肝細胞中的構(gòu)成比可以高達15%，表明人肝細胞可以整合入該小鼠模型的肝臟中，且能保持細胞分裂與正常功能的維持[28]。

盡管人源性肝細胞可以在uPA/Rag2-/-小鼠體內(nèi)生長繁殖，但是該模型仍然不能滿足研究人員的需要。在2004年，Tateno等[29]首次將uPA小鼠與SCID小鼠雜交獲得uPA/SCID小鼠模型，人源肝細胞移植入該小鼠模型的成功率可以高達92%，且小鼠中保留的人肝細胞保留有正常的藥理反應(yīng)，此外，人肝細胞對病變的小鼠肝組織進行了大規(guī)模的替換，并形成了具有功能的膽小管[30]。因此，該小鼠模型除了可以被應(yīng)用于構(gòu)建HBV感染模型外，還可以進一步研究HBV致病機制和抗HBV的藥物。

2.2 Fah-/-小鼠模型為基礎(chǔ)的人鼠嵌合肝模型 Fah-/-小鼠最初用于研究I型遺傳性酪氨酸血癥。Fah是酪氨酸分解代謝過程最后一步的關(guān)鍵酶，可將延胡索酰乙酰乙酸分解為延胡索酸和乙酰乙酸。其功能缺失可導致其上游底物馬來酰乙酰乙酸和延胡索酰乙酰乙酸的蓄積，引起廣泛的肝細胞壞死和肝損傷。2-硝基-4-三氟甲苯-1，3環(huán)乙垸碘（NTBC）可以抑制Fah上游4-對羥基苯丙酮酸雙氧化酶的活性，減少毒性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，雖然不能從根源上解決Fah基因缺失對肝的損傷，卻可以有效維持Fah-/-小鼠的生存[31-32]。

Grompe等[31]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脾注射野生型同種系小鼠肝細胞可在停用NTBC的Fah-/-小鼠肝臟內(nèi)定植，恢復小鼠異常的肝功能。從此Fah-/-小鼠肝損傷模型在研究外源細胞在肝臟的定植狀況中得到了廣泛應(yīng)用，與uPA誘導的肝損傷模型相比，F(xiàn)ah-/-肝損傷模型存在以下兩方面優(yōu)勢：①小鼠的肝損傷程度和移植后的選擇壓力可通過在飲水中添加NTBC的方式予以調(diào)節(jié)，簡化了小鼠的飼養(yǎng)與手術(shù)；②Fah-/-小鼠是基因片段（外顯子5）的缺失導致的，而不是插入突變，不存在恢復到野生型的可能，因此可以在任何時間段進行移植。

Azuma等[33]率先應(yīng)用裸鼠、NOD/SCID小鼠、Rag1-/-小鼠和Rag2-/-/Il-2rγ-/-小鼠與Fah-/-小鼠雜交，結(jié)果顯示，F(xiàn)ah-/-裸鼠與Fah-/-/Rag1-/-小鼠均無法成功再植人源肝細胞，而Fah-/-/NOD/SCID小鼠雖有很低的移植成功率，但是大多數(shù)小鼠在停用NTBC后會迅速出現(xiàn)肝損傷并死亡。僅在Fah-/-Rag2-/-/Il2rg-/-（FRG）小鼠中人源肝細胞再植成功，移植成功率為10%～60%，但是在移植前須要采用表達uPA的腺病毒進行預處理。同年，Bissig等[34]于移植前采用甲磺酸萘莫司他和氯膦酸鹽對FRG小鼠進行處理，分別抑制小鼠的補體系統(tǒng)和肝臟的Kupffer細胞后，在未經(jīng)表達uPA的腺病毒預處理的情況下經(jīng)脾臟移植人源肝細胞后，將移植成功率提高到45%～100%。

3 常見人鼠嵌合肝小鼠模型的應(yīng)用

3.1 Alb-uPA小鼠模型的應(yīng)用 HBV的致病過程涉及到復雜的體內(nèi)反應(yīng)，單純使用細胞、小鼠模型不足以在體外實驗中證明其具體的致病機制，因此，人鼠嵌合肝模型可以在體外模擬人體感染HBV的重要性不言而喻。通過在嵌合肝小鼠模型腹腔內(nèi)接種感染HBV的血清或細胞，部分人源性肝細胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)cccDNA，而后者隨著時間的推移，使得小鼠體內(nèi)其他人源性肝細胞也會被HBV所感染，并可以在外周血中的檢測到穩(wěn)定水平的HBV含量，最終完成構(gòu)建HBV感染人源性肝細胞的動物模型[35]。此外，有研究者將整合有1.4倍長度HBV DNA的HepG2細胞注射入小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)小鼠外周血中的HBV含量也會明顯升高，因此利用該小鼠模型來模擬人體感染HBV的過程是切實可行的[36]。除了構(gòu)建HBV感染模型，嵌合肝模型還可以幫助我們進一步明確不同HBV對于人體的影響。通過接種不同乙型肝炎患者的血清，可以在體外詳細地研究HBV不同的亞型及自然突變，從而為HBV致病過程的研究提供更加可靠的數(shù)據(jù)[37-38]。利用該技術(shù)，研究人員分別研究了HBV不同片段的具體作用，發(fā)現(xiàn)HBeAg對于病毒的感染和復制并沒有明顯的作用，而HBx蛋白對于HBV的復制則是不可或缺的[36,39]。

近十年來在藥物實驗方面，Alb-uPA小鼠為基礎(chǔ)的人鼠嵌合肝模型是驗證抗HBV藥物并探索其作用機制的一個重要的技術(shù)平臺。研究人員利用該小鼠模型對部分抗HBV藥物進行的檢測，發(fā)現(xiàn)拉米夫定和聚乙二醇干擾素α可以顯著減少小鼠外周血中的病毒水平[36,40]。同時，相關(guān)研究人員利用該模型驗證不同類型的干擾素對HBV的抑制作用并不相同，其中干擾素α則可以通過抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性從而實現(xiàn)抗HBV作用[41-42]。除此之外，研究人員發(fā)現(xiàn)HBV在感染過程中，可以通過激活NK細胞依賴的自然免疫反應(yīng)來引起肝細胞DNA的異常甲基化[43]。而在代謝研究方面，最近的一項研究證實，HBV通過與細胞受體結(jié)合，可以改變肝細胞對膽汁鹽的吸收并影響膽汁酸代謝相關(guān)基因的表達[44]。此外，有研究者嘗試將最新的miRNA微陣列檢測（miRNA芯片）與該小鼠模型結(jié)合。將HBV感染者的肝細胞移植入該小鼠模型培育8周，隨后對其進行高通量檢測，研究者發(fā)現(xiàn)部分miRNA發(fā)揮抑制HBV復制的作用[45]。此外，尚有其他研究證實，miRNA93可以調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達水平，從而決定HBV誘導HCC產(chǎn)生的易感性[46]。相關(guān)結(jié)果的發(fā)現(xiàn)為我們將來結(jié)合人源嵌合肝動物模型與測序技術(shù)提供了新的思路。

3.2 Fah-/-小鼠模型的應(yīng)用 Bissig等[47]將從感染D亞型HBV的黑猩猩血清中提取的HBV經(jīng)尾靜脈注射入FRG小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠嵌合肝組織中HBV cccDNA、HBV RNA和HBV DNA復制中間體的水平均呈穩(wěn)步上升趨勢，免疫組織化學染色實驗顯示，小鼠體內(nèi)人源肝細胞均可穩(wěn)定表達HBcAg。更重要的是，在人源化水平較低的小鼠（人ALB水平0.04～0.16 ng/ml）體內(nèi)同樣也可檢測到HBV的復制，即很少量的肝細胞就可以支持HBV的復制。說明HBV可以在FRG嵌合人源肝組織中進行復制，而且其復制能力與小鼠肝臟人源嵌合程度無關(guān)。

Fah-/-小鼠模型廣泛可控性肝損傷的特點除了應(yīng)用于構(gòu)建人鼠嵌合肝模型外，還可應(yīng)用于“睡美人”轉(zhuǎn)座子（sleeping beauty transposon, SB transposon）轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建?！八廊恕鞭D(zhuǎn)座子與病毒載體相比較具有明顯優(yōu)勢，其結(jié)構(gòu)簡單，對外源基因的影響較小，對插入片段的長度限制較小，可隨機將外源基因轉(zhuǎn)移并整合入小鼠體細胞基因組中的AT位點[48-49]。利用SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可將HBV序列（如有致癌能力的preS、X片段）整合到小鼠肝臟染色體上，并穩(wěn)定表達，即實現(xiàn)了HBV片段在體內(nèi)高效的轉(zhuǎn)座，解決了目前轉(zhuǎn)基因動物制作領(lǐng)域存在的基因整合率低、表達效率低、隨機整合、制作成本高等技術(shù)瓶頸問題[50-51]。將Fah基因與所要研究的HBV片段連入表達SB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒，通過高壓水尾靜脈注射入Fah-/-小鼠體內(nèi)后逐漸停用NTBC，得以存活下來的小鼠即為轉(zhuǎn)入外源HBV片段的轉(zhuǎn)基因小鼠，可以模擬HBV在體內(nèi)整合入宿主DNA后的致癌效應(yīng)。例如，Bard-Chapeau等[52]將HBV的S片段通過SB轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入Fah-/-小鼠肝內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了2881個基因在HCC發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用，其中42.5%與人HCC組織的基因改變相對應(yīng)。Keng等[53]將HBV的X片段和已知的人抑癌基因一同通過SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)導入Fah-/-小鼠，初步探索了HBx介導的β-caternin相關(guān)的致癌機制。

4 人鼠嵌合肝小鼠模型的改進

4.1 Alb-uPA小鼠模型的改進 為了達到更好的人肝細胞移植效果，有研究者分別嘗試將SCID/ beige小鼠和NOG小鼠分別與Alb-uPA小鼠雜交，所獲得的小鼠模型具有更好的研究條件，已用于證明研究干擾素α對HBV的作用機制等研究[54-56]。由于uPA基因過表達會在小鼠體內(nèi)引起不可控的出血，須要在小鼠出生后1個月以內(nèi)移植人肝細胞，保證小鼠的存活。該技術(shù)難度大，移植窗口期短，容易引發(fā)實驗的失敗。因此，有學者利用四環(huán)素誘導調(diào)控系統(tǒng)（Tet-on）和腺病毒轉(zhuǎn)入uPA基因的方法實現(xiàn)了對uPA基因的調(diào)控性表達[57]。除此之外，有研究者將Alb-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的啟動子替換為主要尿蛋白（major urinary protein, MUP）的啟動子，該Mup-Upa轉(zhuǎn)基因小鼠的肝損傷出現(xiàn)時間更晚，從而延長了移植窗口期，提高了實驗的成功率[58]。

4.2 Fah-/-小鼠模型的改進 FRG小鼠繁殖力有限，且在生長過程和手術(shù)移植過程中有很高的死亡率，無法應(yīng)用于大規(guī)模研究。因此，有學者選取繁殖能力和手術(shù)耐受性均較強的Fah-/-/Rag2-/-小鼠，應(yīng)用NK細胞抑制劑GM1和免疫抑制劑他克莫司（FK506），改善該小鼠對異種移植物的排斥，人源肝細胞移植成功率與FRG小鼠接近。與FRG小鼠相比，F(xiàn)ah-/-/Rag2-/-小鼠繁殖力強，生長過程中和手術(shù)后死亡率低，并且同樣可以感染HBV，該方法具有良好的應(yīng)用價值[59]。以往FRG小鼠須要通過Fah-/-小鼠和Rag2-/-/Il-2rg-/-小鼠雜交獲得，須要進行多次雜交和回交，費時費力。近年來興起的如鋅指蛋白酶、CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)因可以直接在體外受精獲得的受精卵中進行基因編輯而受到廣泛關(guān)注。Benjamin等[60]對NOD Rag1-/-IL2rg（NRG）小鼠的受精卵應(yīng)用鋅指蛋白酶敲除Fah基因5號外顯子，得到的小鼠同F(xiàn)ah-/-小鼠與NRG小鼠雜交得到的FNRG小鼠相比，有著相同的人源肝細胞再植率，并且可以在一定程度上模擬HBV感染對抗病毒藥物的反應(yīng)。Lineberger等[61]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，僅耗時16周就實現(xiàn)了NRG小鼠中Fah基因的敲除，相比于傳統(tǒng)方法省時省力。

4.3 TK-NOG小鼠模型的構(gòu)建 TK-NOG小鼠模型也是一種新型人鼠嵌合肝小鼠模型，其主要利用胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase, TK）構(gòu)建完成的模型與NOD/SCID基因缺陷小鼠雜交獲得TKNOG小鼠。該模型可以使小鼠體內(nèi)的人肝細胞發(fā)揮長達8個月之久的正常功能，成功地應(yīng)用于各種研究藥物代謝的遺傳多樣性方面[62-63]。通過比較TK-NOG小鼠和uPA-SCID小鼠發(fā)現(xiàn)，注射人HBV感染血清的TK-NOG和uPA-SCID小鼠均發(fā)生病毒血癥，且恩替卡韋和干擾素治療藥物的效果在兩個鼠標模型中都是相似的。因此，TK-NOG小鼠也可用于研究肝炎病毒病毒學和評估抗病毒藥物[64]。TK-NOG小鼠存在以下3個主要的優(yōu)勢：①不須使用外源性藥物，移植后的人源化肝組織及其功能可以長期保持穩(wěn)定；②TK-NOG小鼠較穩(wěn)定，未出現(xiàn)系統(tǒng)性的肝臟疾病、腎臟疾病、出血等問題；③人肝細胞在TK-NOG小鼠肝臟中重建后繼續(xù)增加GCV的用量可以保證較高的移植成功率[63]。

4.4 具備人免疫系統(tǒng)的人源嵌合肝小鼠模型 上述3類小鼠模型中，僅能檢測到HBV的復制，并無法檢測到HBV導致的肝細胞炎癥和壞死，其原因在于HBV本身不會破壞肝細胞，其導致的免疫反應(yīng)才是HBV導致肝細胞炎癥和壞死關(guān)鍵。以上3類小鼠模型缺乏能特異性識別HBV的免疫系統(tǒng)，因此無法模擬人體感染HBV后免疫反應(yīng)對肝臟的影響。有學者提出同時移植人源肝細胞和造血干細胞，可以在小鼠體內(nèi)模擬人體免疫系統(tǒng)的想法，但在構(gòu)建人源肝/造血系統(tǒng)雙移植小鼠時，會遇到2個關(guān)鍵問題：①同一個人的造血干細胞和肝細胞很難獲取，而如果移植不同個體的造血干細胞和肝細胞，移植的免疫系統(tǒng)會排斥非同體肝細胞，由于人的肝臟在胚胎時期兼具造血功能，因此胎肝中同時存在的胎肝成纖維細胞和造血干細胞因為不會產(chǎn)生排異反應(yīng)，是理想的供體細胞來源；②沒有現(xiàn)成的兩系統(tǒng)同時成功異種移植的受體小鼠模型，即最適合肝異種移植的小鼠模型不適合造血干細胞移植，人源造血干細胞移植的小鼠模型包括NOG、NSG（NOD/SCID/γC-/-/SzJ）和Rag2/IL-2Rγc雙敲小鼠模型，而如將其與人源嵌合肝小鼠模型雜交，得到的多基因敲除小鼠繁殖力和生存力無法得到保證[65]。Gutti等[65]選取Alb-uPA/NOG小鼠，先后或同時移植同一胎肝來源的肝成纖維細胞和造血干細胞，結(jié)果顯示異種移植的胎肝成纖維細胞在小鼠肝臟成功定植，但人源ALB和CK-18+細胞水平在移植10周后均開始下降，說明胎肝成纖維細胞可以在鼠肝定植但無法持續(xù)生長，而造血干細胞則可以穩(wěn)定定植并生長。制瘤素M（oncostatin M, OSM）在肝細胞的分化過程中可以起到關(guān)鍵作用，Billerbeck等[66]發(fā)現(xiàn)小鼠OSM與人OSM之間沒有交叉反應(yīng)性，因此在移植后向小鼠血液直接注入人OSM或通過高壓水尾靜脈注射注入人OSM表達質(zhì)粒，可以提高人源胎肝成纖維細胞生長的競爭力，適應(yīng)小鼠肝臟微環(huán)境的能力更強，由此在RFG小鼠模型基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了具有人免疫系統(tǒng)的人源嵌合肝小鼠模型，并且在該小鼠血中不僅可檢測到人T細胞和人B細胞，還可檢測到人NK細胞和人單核細胞（經(jīng)典造血干細胞移植小鼠模型并不能產(chǎn)生這兩種免疫細胞），且在HBV感染后NK細胞的數(shù)量會顯著提升，說明該小鼠可能有更強的人細胞免疫功能，但該小鼠模型能夠產(chǎn)生人NK細胞和人單核細胞的機制尚不清楚。

5 展 望

傳統(tǒng)HBV動物模型的構(gòu)建為研究HBV的生物學特性、病毒與宿主的相互作用、病毒致病機制和開發(fā)防治HBV的疫苗和藥物等方面的問題提供了良好的基礎(chǔ)。但不能否認的是，由于HBV的自身特性和動物模型在生理結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)和病理變化等方面存在的差異，傳統(tǒng)的實驗動物模型已經(jīng)無法為我們后續(xù)的研究提供強有力的科學支撐，其實驗結(jié)果不能準確地推導到人群之中。

人源嵌合肝小鼠模型的出現(xiàn)打破了這一僵局，通過在免疫缺陷小鼠體內(nèi)植入人源肝細胞，研究者可以在動物水平有針對性的模擬HBV對人肝細胞的感染作用并進行進一步的機制研究，并為抗HBV藥物的研發(fā)與評估打下基礎(chǔ)。此外，干細胞在該小鼠模型中的應(yīng)用同樣展示出了光明的前景。已有研究者通過將人源干細胞嵌合入該小鼠模型，從而構(gòu)建了HIV和HBV共同感染的小鼠研究模型，為后續(xù)的研究打開了新的思路[65]。現(xiàn)階段人源化人鼠嵌合肝HBV感染模型現(xiàn)在面臨的問題主要是制備過程復雜、技術(shù)要求高、實驗周期較長。但是隨著科學技術(shù)的發(fā)展，相信相應(yīng)問題均會迎刃而解，且在已有研究的基礎(chǔ)上，最終有希望應(yīng)用于臨床，發(fā)揮自身特有的優(yōu)勢，幫助HBV患者進行更加精確的個性化治療。

[1] Zhang HW, Yin JH, Li YT, et al. Risk factors for acute hepatitis B and its progression to chronic hepatitis in Shanghai, China［J］. Gut, 2008, 57(12):1713-1720.

[2] Yin J, Li N, Han Y, et al. Effect of antiviral treatment with nucleotide/nucleoside analogs on postoperative prognosis of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma: a two-stage longitudinal clinical study［J］. J Clin Oncol, 2013, 31(29):3647-3655.

[3] Xie J, Zhang Y, Zhang Q, et al. Interaction of signal transducer and activator of transcription 3 polymorphisms with hepatitis B virus mutations in hepatocellular carcinoma［J］. Hepatology, 2013, 57(6):2369-2377.

[4] 曹廣文. “ 癌癥進化發(fā)育假說”的提出及其對癌癥特異性防治的作用［J］. 第二軍醫(yī)大學學報，2015，36(4):349-361.

[5] 王貴強，王福生，成軍，等. 《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）［J］. 傳染病信息，2015，28(6):321-340.

[6] 盧姍姍，徐東平，李進. HBV前S/S基因突變的研究進展［J］.傳染病信息，2016，29(2):112-116.

[7] Thimme R, Wieland S, Steiger C, et al. CD8(+) T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection［J］. J Virol, 2003, 77(1):68-76.

[8] Barker LF, Chisari FV, McGrath PP, et al. Transmission of type B viral hepatitis to chimpanzees［J］. J Infect Dis, 1973, 127(6):648-662.

[9] Walter E, Keist R, Niederost B, et al. Hepatitis B virus infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo［J］. Hepatology, 1996, 24(1):1-5.

[10] 楊悅，許智慧，劉妍，等. HBV動物模型研究進展［J］. 傳染病信息，2016，29(4):236-241.

[11] Yan RQ, Su JJ, Huang DR, et al. Human hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma. I. Experimental infection of tree shrews with hepatitis B virus［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 1996, 122(5):283-288.

[12] Jacob JR, Sterczer A, Toshkov IA, et al. Integration of woodchuck hepatitis and N-myc rearrangement determine size and histologic grade of hepatic tumors［J］. Hepatology, 2004, 39(4):1008-1016.

[13] Kosinska AD, Liu J, Lu M, et al. Therapeutic vaccination and immunomodulation in the treatment of chronic hepatitis B: preclinical studies in the woodchuck［J］. Med Microbiol Immunol , 2015, 204(1):103-114.

[14] Reaiche GY, Le Mire MF, Mason WS, et al. The persistence in the liver of residual duck hepatitis B virus covalently closed circular DNA is not dependent upon new viral DNA synthesis［J］. Virology, 2010, 406(2):286-292.

[15] Cova L, Zoulim F. Duck hepatitis B virus model in the study of hepatitis B virus［J］. Methods Mol Med , 2004, 96:261-268.

[16] Babinet C, Farza H, Morello D, et al. Specific expression of hepatitis B surface antigen (HBsAg) in transgenic mice［J］. Science, 1985, 230(4730):1160-1163.

[17] Guidotti LG, Matzke B, Schaller H, et al. High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice［J］. J Virol , 1995, 69(10):6158-6169.

[18] 叢麗媛，李愛民，吳慶軍，等. 慢性乙型肝炎病毒感染者細胞免疫功能與血清HBV DNA的關(guān)系［J］. 傳染病信息，2010 23(4):218-220.

[19] Kim CM, Koike K, Saito I, et al. HBx gene of hepatitis B virus induces liver cancer in transgenic mice［J］. Nature, 1991, 351(6324):317-320.

[20] Koike K, Moriya K, Iino S, et al. High-level expression of hepatitis B virus HBx gene and hepatocarcinogenesis in transgenic mice［J］. Hepatology, 1994, 19(4):810-819.

[21] Akbar SK, Onji M. Hepatitis B virus (HBV)-transgenic mice as an investigative tool to study immunopathology during HBV infection［J］. Int J Exp Pathol, 1998, 79(5):279-291.

[22] Liu F, Song Y, Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA［J］. Gene Ther, 1999, 6(7):1258-1266.

[23] Huang LR, Wohlleber D, Reisinger F, et al. Intrahepatic myeloidcell aggregates enable local proliferation of CD8(+) T cells and successful immunotherapy against chronic viral liver infection［J］. Nat Immunol, 2013, 14(6):574-583.

[24] Yang D, Liu L, Zhu D, et al. A mouse model for HBV immunotolerance and immunotherapy［J］. Cell Mol Immunol, 2014, 11(1):71-78.

[25] Huang LR, Gabel YA, Graf S, et al. Transfer of HBV genomes using low doses of adenovirus vectors leads to persistent infection in immune competent mice［J］. Gastroenterology, 2012, 142(7):1447-1450.

[26] Hartman ZC, Kiang A, Everett RS, et al. Adenovirus infection triggers a rapid, MyD88-regulated transcriptome response critical to acute-phase and adaptive immune responses in vivo［J］. J Virol, 2007, 81(4):1796-1812.

[27] Rhim JA, Sandgren EP, Palmiter RD, et al. Complete reconstitution of mouse liver with xenogeneic hepatocytes［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(11):4942-4946.

[28] Dandri M, Burda MR, Torok E, et al. Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus［J］. Hepatology, 2001, 33(4):981-988.

[29] Tateno C, Yoshizane Y, Saito N, et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs［J］. Am J Pathol, 2004, 165(3):901-912.

[30] Meuleman P, Libbrecht L, De Vos R, et al. Morphological and biochemical characterization of a human liver in a uPA-SCID mouse chimera［J］. Hepatology, 2005, 41(4):847-856.

[31] Grompe M, al-Dhalimy M, Finegold M, et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice［J］. Genes Dev, 1993, 7(12A):2298-2307.

[32] Overturf K, Al-Dhalimy M, Tanguay R, et al. Hepatocytes corrected by gene therapy are selected in vivo in a murine model of hereditary tyrosinaemia type I［J］. Nat Genet, 1996, 12(3):266-273.

[33] Azuma H, Paulk N, Ranade A, et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-mice［J］. Nat Biotechnol, 2007, 25(8):903-910.

[34] Bissig KD, Le TT, Woods NB, et al. Repopulation of adult and neonatal mice with human hepatocytes: a chimeric animal model［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(51):20507-20511.

[35] Volz T, Allweiss L, Ben MM, et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus［J］. J Hepatol, 2013, 58(5):861-867.

[36] Tsuge M, Hiraga N, Takaishi H, et al. Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically engineered hepatitis B virus［J］. Hepatology, 2005, 42(5):1046-1054.

[37] Tanaka Y, Sanchez LV, Sugiyama M, et al. Characteristics of hepatitis B virus genotype G coinfected with genotype H in chimeric mice carrying human hepatocytes［J］. Virology, 2008, 376(2):408-415.

[38] Sugiyama M, Tanaka Y, Kato T, et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens［J］. Hepatology, 2006, 44(4):915-924.

[39] Tsuge M, Hiraga N, Akiyama R, et al. HBx protein is indispensable for development of viraemia in human hepatocyte chimeric mice［J］. J Gen Virol, 2010, 91(Pt7):1854-1864.

[40] Allweiss L, Volz T, Lutgehetmann M, et al. Immune cell responses are not required to induce substantial hepatitis B virus antigen decline during pegylated interferon-alpha administration［J］. J Hepatol, 2014, 60(3):500-507.

[41] Belloni L, Allweiss L, Guerrieri F, et al. IFN-alpha inhibits HBV transcription and replication in cell culture and in humanized mice by targeting the epigenetic regulation of the nuclear cccDNA minichromosome［J］. J Clin Invest, 2012, 122(2):529-537.

[42] Nakagawa S, Hirata Y, Kameyama T, et al. Targeted induction of interferon-lambda in humanized chimeric mouse liver abrogates hepatotropic virus infection［J］. PLoS One, 2013, 8(3):e59611.

[43] Okamoto Y, Shinjo K, Shimizu Y, et al. Hepatitis virus infection affects DNA methylation in mice with humanized livers［J］. Gastroenterology, 2014, 146(2):562-572.

[44] Oehler N, Volz T, Bhadra OD, et al. Binding of hepatitis B virus to its cellular receptor alters the expression profile of genes of bile acid metabolism［J］. Hepatology, 2014, 60(5):1483-1493.

[45] Kohno T, Tsuge M, Murakami E, et al. Human microRNA hsamiR-1231 suppresses hepatitis B virus replication by targeting core mRNA［J］. J Viral Hepat, 2014, 21(9):e89-e97.

[46] Ohno M, Otsuka M, Kishikawa T, et al. Specific delivery of microRNA93 into HBV-replicating hepatocytes downregulates protein expression of liver cancer susceptible gene MICA［J］. Oncotarget, 2014, 5(14):5581-5590.

[47] Bissig KD, Wieland SF, Tran P, et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment［J］. J Clin Invest, 2010, 120(3):924-930.

[48] 楊富強，饒桂榮. 乙型肝炎治療性疫苗研究進展［J］. 傳染病信息，2015，28(2):65-69.

[49] Hou X, Du Y, Deng Y, et al. Sleeping Beauty transposon system for genetic etiological research and gene therapy of cancers［J］. Cancer Biol Ther, 2015, 16(1):8-16.

[50] Bissig KD, Wieland SF, Tran P, et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment［J］. J Clin Invest, 2010, 120(3):924-930.

[51] Chayama K, Hayes CN, Hiraga N, et al. Animal model for study of human hepatitis viruses［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2011, 26(1):13-18.

[52] Bard-Chapeau EA, Nguyen AT, Rust AG, et al. Transposon mutagenesis identifies genes driving hepatocellular carcinoma in a chronic hepatitis B mouse model［J］. Nat Genet, 2014, 46(1):24-32.

[53] Keng VW, Tschida BR, Bell JB, et al. Modeling hepatitis B virus X-induced hepatocellular carcinoma in mice with the Sleeping Beauty transposon system［J］. Hepatology, 2011, 53(3):781-790.

[54] Lutgehetmann M, Bornscheuer T, Volz T, et al. Hepatitis B virus limits response of human hepatocytes to interferon-alpha in chimeric mice［J］. Gastroenterology, 2011, 140(7):2074-2083.

[55] Suemizu H, Hasegawa M, Kawai K, et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 377(1):248-252.

[56] Gutti TL, Knibbe JS, Makarov E, et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice［J］. Am J Pathol, 2014, 184(1):101-109.

[57] Song X, Guo Y, Duo S, et al. A mouse model of inducible liver injury caused by tet-on regulated urokinase for studies of hepatocyte transplantation［J］. Am J Pathol, 2009, 175(5):1975-1983.

[58] Tesfaye A, Stift J, Maric D, et al. Chimeric mouse model for the infection of hepatitis B and C viruses［J］. PLoS One, 2013, 8(10):e77298.

[59] He Z, Zhang H, Zhang X, et al. Liver xeno-repopulation with human hepatocytes in Fah-/-Rag2-/-mice after pharmacological immunosuppression［J］. Am J Pathol, 2010, 177(3):1311-1319.

[60] Winer BY, Huang T, Low BE, et al. Recapitulation of treatment response patterns in a novel humanized mouse model for chronic hepatitis B virus infection［J］. Virology, 2017, 502:63-72.

[61] Li F, Cowley DO, Banner D, et al. Efficient genetic manipulation of the NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null mouse by combining in vitro fertilization and CRISPR/Cas9 technology［J］. Sci Rep, 2014, 4:5290.

[62] Hasegawa M, Kawai K, Mitsui T, et al. The reconstituted ′humanized liver′in TK-NOG mice is mature and functional［J］. Biochem Biophys Res Commun , 2011, 405(3):405-410.

[63] 任曉楠，周曉輝. 用于肝臟疾病研究的人源化小鼠模型概述［J］. 中國實驗動物學報，2014，(05):95-99.

[64] Kosaka K, Hiraga N, Imamura M, et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 441(1):230-235.

[65] Gutti TL, Knibbe JS, Makarov E, et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice［J］. Am J Pathol , 2014, 184(1):101-109.

[66] Billerbeck E, Mommersteeg MC, Shlomai A, et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells［J］. J Hepatol , 2016, 65(2):334-343.

（2017-04-01收稿 2017-04-15修回）

（本文編輯 閆晶晶）

Establishment and application of human liver chimeric mouse models in HBV-induced pathogenesis

FU Zhong-xing, YANG Fan, WANG Ling, ZHANG Hong-wei*, CAO Guang-wen*
Fu Zhong-xing and YUNG Fan are the first authors who coutributed equally to the article Department of Epidemiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China.

Viral hepatitis, especially hepatitis B, has long been heavy burden of liver disease worldwide. However, due to its host spectrum exclusively being primates, HBV infection is hard to be replicated in animal models. Human liver chimeric mouse models are generated from immunodeficient and liver defected mice transplanted with human hepatocytes. Due to chimerism with human hepatocytes, the mouse models can be infected by HBV and liver disease models can be generated. The mechanism by which HBV causes liver diseases can be elucidated accordingly. The models are constructed mainly on the basis of Alb-uPA mouse model and Fah-/-mouse model. HBV can be detected both in the human chimeric liver tissue and peripheral blood of the models. The models have been applied for the investigation of HBV mutations, HBV gene functions, anti-HBV agent effects, the interactions between HBV and immune system. This article reviews the advantages and disadvantages of those HBV infection models and emphasizes the advances and improvement in human liver chimeric mouse models.

mouse models; hepatitis B virus; immunodeficiency mice; humanized mice; human liver chimeric mouse model

R-332；R373.21

A

1007-8134(2017)02-0075-07

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.02.003

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2015CB554005，2015CB554006）；國家自然科學基金重大研究計劃集成項目（91529305）；國家自然科學基金重點國際合作項目（81520108021）；國家自然科學基金面上項目（81673250）

200433 上海，第二軍醫(yī)大學流行病學教研室（傅忠星、楊帆、王靈、張宏偉、曹廣文）前兩位作者對本文有同等貢獻，均為第一作者

張宏偉，E-mail: hwzhang@smmu.edu.cn; 曹廣文，E-mail: gcao@smmu.edu.cn

*Corresponding author. ZHANG Hong-wei, E-mail: hwzhang@smmu.edu.cn; CAO Guang-wen, E-mail: gcao@smmu.edu.cn