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    有氧運動對慢性腦缺血小鼠的PI3K/Akt信號通路的影響

    2017-03-25 13:54張鐘元陳嘉勤陳偉毛海峰周柏存
    教師·中 2017年2期

    張鐘元+陳嘉勤+陳偉+毛海峰+周柏存+屈紅林+李娣+彭琪

    摘 要:目的:探討有氧運動對慢性腦缺血小鼠干預(yù)效果及PI3K/Akt信號通路的影響。方法:參考Yoshizaki建立的小鼠慢性腦缺血模型,選擇KM小鼠為實驗動物,構(gòu)建小鼠慢性腦缺血模型;應(yīng)用神經(jīng)行為學(xué)分析、尼氏染色、免疫組化實驗技術(shù),比較有氧運動對該模型的干預(yù)效果,探討其神經(jīng)保護作用的機制;建模成功后,將小鼠隨機四組:SO組、M組、SW組、TM組。SW組:術(shù)后3~4天適應(yīng)性游泳30分鐘,繼后每天遞增10分鐘,逐漸延長至60分鐘,持續(xù)6周,每周休息1天。TM組:術(shù)后第1周進行3次適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練,每次60分鐘,每周6次,持續(xù)6周。結(jié)論:兩種有氧運動均能對本模型的腦細胞發(fā)揮抗損傷作用,且其干預(yù)效果TM組優(yōu)于SW組;兩種有氧運動可能均通過調(diào)節(jié)PI3K /Akt信號通路的表達,達到抑制細胞凋亡,發(fā)揮其抗腦組織傷害的作用。

    關(guān)鍵詞:有氧運動;慢性腦缺血;PI3K;Akt;信號通路

    慢性腦缺血是指各種原因引發(fā)的長期腦血流灌注不足,為臨床上常見的腦損傷之一,可導(dǎo)致持久或進展性的認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙[1]。

    細胞凋亡又稱程序性細胞死亡,是細胞在某些生理或病理條件下發(fā)生的有序的主動性非炎癥性死亡。研究認(rèn)為,腦缺血后與細胞凋亡有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有有絲分裂原蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K) /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路[2]。Akt又名蛋白激酶B(PKB),為分子量大約為60 kD的蛋白激酶。Akt能使絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)磷酸化,故又稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶。Akt能介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng),是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。因子PI32K激活的Akt可以介導(dǎo)胰島素、多種生長因子、凝血酶等誘發(fā)的細胞生長,能經(jīng)多種途徑促進細胞存活[3]。

    本研究采用結(jié)扎右頸動脈的方法構(gòu)建了小鼠酒精性肝損傷模型,采用跑臺和游泳兩種不同的有氧運動方式干預(yù),通過神經(jīng)行為學(xué)、顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察以上干預(yù)對腦缺血損傷小鼠的影響;采用免疫組化實驗技術(shù),檢測PI3K/Akt信號通路上下游相關(guān)因子的差異表達,探討其神經(jīng)保護作用的機制。

    1.研究方法

    (1)動物模型的構(gòu)建:成年健康雄性KM小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(0.3ml/100g體重),參考Yoshizaki的方法結(jié)扎小鼠右頸動脈構(gòu)建慢性腦缺血損傷小鼠動物模型。

    (2)實驗動物分組以及運動方案:建模成功后,將小鼠隨機分為四組:假手術(shù)組(SO)、模型對照組(M)、游泳組(SW)、跑臺組(TM),每組10只,建模后3—4天對其進行干預(yù)。

    (3)組織形態(tài)學(xué)觀察:實驗結(jié)束后,取小鼠腦組織進行石蠟包埋,尼氏染色,解剖形態(tài)學(xué)觀察。

    (4)神經(jīng)行為學(xué)評估:Clark神經(jīng)功能評分方法,根據(jù)癥狀表現(xiàn)程度分0、1、2、3、4遞增等級,對小鼠步態(tài)、攀爬能力、轉(zhuǎn)圈、胡須反應(yīng)、眼睛、耳朵、毛發(fā)等的情況進行綜合評分。

    (5)免疫組織化學(xué)分析:檢測缺血腦組織中的PI3K、Akt、mTOR的表達,采用SABC法的免疫組織化學(xué)法進行以上因子的定位和半定量表達檢測。在10×20倍光學(xué)顯微鏡下,觀察并計算PI3K、AKT、mTOR的陽性表達面積百分比[4](陽性反應(yīng)面積/測量面積)。

    2.結(jié)果與分析

    (1)小鼠神經(jīng)行為學(xué)評估:分別記錄建模后無干預(yù)和建模后進行有氧干預(yù)的得分(三次評分取平均值)。

    (2)解剖形態(tài)學(xué)觀察:組小鼠尼氏體排列緊密,大且數(shù)量較多,神經(jīng)元受損程度小;M組排列疏、欠規(guī)整,且數(shù)量較少;與M組相比,SW、TM組中尼氏體數(shù)量較多,排列緊密,僅次于SO組,TM排列有規(guī)則較集中,效果優(yōu)于SW組。

    (3)免疫組織化學(xué)分析。圖2顯示:小鼠腦細胞PI3K、Akt主要表達于細胞漿。PI3K表達強弱依次為SO>TM>SW>M組;Akt表達強到弱依次為SO>TM>SW>M組。

    表2可見:小鼠腦組織中PI3K、Akt免疫組化中SO組陽性表達最高,SW組、TM組表達均高于M組(P<0.01),且TM組表達更顯著;與M組的Akt表達相比,SO組的Akt表達具有非常顯著的差異(P<0.01)。

    3.討論

    (1)小鼠腦缺血模型。腦缺血理想的實驗動物模型是實驗研究取得進展的關(guān)鍵性因素之一。由于本實驗需要進行長時間的有氧游泳和跑臺的運動訓(xùn)練,我們對所選小鼠的右頸動脈進行結(jié)扎以構(gòu)模。術(shù)后我們跟蹤觀察小鼠的情況,發(fā)現(xiàn)小鼠右眼半閉或全閉。這說明小鼠建模成功,且其成功率達90%,應(yīng)用此模型可以順利完成本研究。

    (2)有氧運動對小鼠腦缺血干預(yù)的效果。近年來,大量有關(guān)有氧運動康復(fù)訓(xùn)練治療急性缺血性腦血管疾病的動物實驗取得了一定的成果。適當(dāng)?shù)倪\動訓(xùn)練能夠促使腦血管新生,增強抗氧化能力,減輕腦細胞凋亡,促進神經(jīng)元生長等。從本實驗結(jié)果可見,對小鼠建模前、后以及有氧運動干預(yù)后神經(jīng)功能的評分,除M組外,各干預(yù)組都有明顯的變化。腦組織尼氏染色顯示,相比于M組,有氧運動組尼氏小體相對清楚有規(guī)律,TM組尤為顯著,這說明有氧運動對小鼠腦部神經(jīng)元細胞的再生以及保護有著重要的作用,其能促進神經(jīng)干細胞增殖以及分化,促進軸突及樹突的生長。

    (3)有氧運動干預(yù)與PI3K/Akt信號通路表達影響。腦缺血后與細胞凋亡有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有有絲分裂原蛋白激酶( MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K) /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶。PI3K被激活后生成的磷脂產(chǎn)物進一步激活A(yù)kt及其下游的信號的級聯(lián)反應(yīng), 參與生長、發(fā)育、分化和細胞的存活。PI3K激活的Akt可以介導(dǎo)胰島素、多種生長因子、凝血酶等誘發(fā)的細胞生長,能經(jīng)多種途徑促進細胞存活。從小鼠腦組織免疫組織化學(xué)結(jié)果的分析可見,PI3K/Akt的表達情況在游泳組和跑臺組的表達面積遠高于模型對照組、低于假手術(shù)組,且跑臺組表達面積更佳。由此可知,有氧運動對該模型中的鼠腦組織發(fā)揮著保護作用,能抑制細胞的凋亡過程。其抗損傷作用機理可能通過激活PI32K /Akt信號通路的表達,達到抑制細胞凋亡,發(fā)揮腦組織保護的作用。

    4.結(jié)論

    (1)兩種有氧運動均能對本慢性腦缺血小鼠模型的腦細胞發(fā)揮抗損傷作用,且其效果跑臺組優(yōu)于游泳組。

    (2)兩種有氧運動可能均通過調(diào)節(jié)PI32K /Akt信號通路的表達,達到抑制細胞凋亡,發(fā)揮抗腦組織傷害作用。

    參考文獻:

    [1]楊運華.運動對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下胰島素PI3K/Akt/GSK-3信號傳導(dǎo)通路影響的研究進展[J].長江大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013(21):142-145.

    [2]黃秀蘭,崔國輝,周克元.PI3K/Akt信號通路與腫瘤細胞凋亡關(guān)系的研究進展[J].癌癥,2008,27(3):331-336.

    [3]朱裕華,袁紅花,吳連連,等.IGF-1通過PI3K/Akt信號誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化[J].山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2014,52(3): 11-15.

    [4]郭 琳,王 強.PI3K/mTOR信號傳導(dǎo)通路與惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009, 17(8):1585-1589.

    (作者單位:湖南師范大學(xué)體適能與運動康復(fù)湖南省重點實驗室)

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