茶樹(shù)分子遺傳圖譜的研究進(jìn)展

石玉蘭，鄭楚楚，陳 絲，歐淑瓊，彭 靖，王坤波

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

茶樹(shù)分子遺傳圖譜的研究進(jìn)展

石玉蘭，鄭楚楚，陳 絲，歐淑瓊，彭 靖，王坤波*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

簡(jiǎn)要概述了茶樹(shù)分子遺傳圖譜構(gòu)建方法和國(guó)內(nèi)外茶樹(shù)分子遺傳圖譜研究進(jìn)展，并由此提出構(gòu)建高密度茶樹(shù)分子遺傳圖譜的措施，為茶樹(shù)分子遺傳圖譜的構(gòu)建提供參考。

茶樹(shù)；遺傳圖譜；分子標(biāo)記

茶樹(shù)（Camellia sinensis（L.）O. kuntze）屬于山茶科（Theaceae）、山茶屬（Camellia）、茶組（Sect.Thea（L.）Dyer），起源于我國(guó)的西南地區(qū)[1]。二倍體（2n=30）的茶樹(shù)群體在我國(guó)比較常見(jiàn)，但其中仍有茶樹(shù)多倍體。茶樹(shù)染色體著絲點(diǎn)大部分在中部和近中部，有少數(shù)在近端部[2]。山茶花和茶的基因組近似，大概為4000 Mb，約為擬南芥的30倍、毛果楊的10倍。由于世代周期長(zhǎng)、基因組大、遺傳負(fù)荷大和基因型高度異質(zhì)雜合等特性，茶樹(shù)遺傳基礎(chǔ)的研究十分薄弱。我國(guó)茶樹(shù)種植歷史悠久，品種資源豐富，大部分目前的栽培品種選育都來(lái)自于群體品種，常規(guī)育種方法和環(huán)境對(duì)于性狀的影響和干擾是非常復(fù)雜和難以避免的。要選育出一個(gè)茶樹(shù)新品種最少需要花費(fèi)10～20年甚至更長(zhǎng)時(shí)間。因此發(fā)展傳統(tǒng)茶樹(shù)育種研究迫切需要一些新的技術(shù)和理論以實(shí)現(xiàn)快速定向培育。

遺傳圖譜又稱連鎖圖譜，是指通過(guò)遺傳重組所得到的基因位點(diǎn)在染色體上相對(duì)距離的線性圖。遺傳圖譜可以進(jìn)行QTLs定位，得到連鎖目的性狀基因組片段，然后進(jìn)行基因圖位克隆，以為分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定良好基礎(chǔ)[3-5]。比較遺傳圖譜后，就能知道基因組進(jìn)化的信息，接著探索出物種遺傳演化的進(jìn)程[6]。因此，利用DNA 分子標(biāo)記構(gòu)建高密度茶樹(shù)遺傳圖譜對(duì)育種或者遺傳理論研究都意義重大。

1 遺傳圖譜概述

基因遺傳圖譜的構(gòu)建是建立在染色體交換和重組基礎(chǔ)上的。細(xì)胞的減數(shù)分裂，在非同源染色體上的基因獨(dú)立存在，自由組合，連鎖基因在同源染色體的非姐妹染色單體上發(fā)生交換和重組，重組型配子形成，它占總配子數(shù)的比例稱為重組率。重組率的高低取決于染色體交換的頻率，而交換頻率隨基因間距離的增加而增加。因此，它們?cè)谌旧w上的遺傳圖距可以由基因間的重組率來(lái)決定，用重組子來(lái)推算重組率即遺傳作圖，并且轉(zhuǎn)化為遺傳圖譜的距離，然后在連鎖群上把遺傳標(biāo)記依次排序的過(guò)程。經(jīng)典遺傳圖譜主要是使用細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、形態(tài)標(biāo)記以及生化標(biāo)記，構(gòu)建的圖譜可以間接的反映染色體上功能基因的排序，但是受到標(biāo)記數(shù)目的限制，進(jìn)展比較緩慢；分子遺傳圖譜指的是采用DNA分子標(biāo)記來(lái)建立的遺傳圖譜，因?yàn)檫@種標(biāo)記不受外部環(huán)境條件以及所取材料影響，而且數(shù)量相當(dāng)?shù)呢S富，讓構(gòu)建高密度遺傳圖譜成為一種可能[7-10]。分子遺傳圖譜的構(gòu)建包括以下幾個(gè)步驟[11]：（1）構(gòu)建合適的遺傳群體，包括親本的選擇、分離群體類(lèi)型的選擇及群體大小的確定等，根據(jù)遺傳材料間的雜交親和性和親緣關(guān)系，確定最佳親本組合；（2）選配作圖親本的分離群體類(lèi)型以及群體大小等，建立分離群體；（3）利用合適的分子標(biāo)記進(jìn)行分析；（4）測(cè)定標(biāo)記基因型；（5）進(jìn)行連鎖分析，利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行圖譜構(gòu)建。

2 茶樹(shù)遺傳圖譜構(gòu)建現(xiàn)狀

茶樹(shù)為多年生木本植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且異交，但茶樹(shù)遺傳組成高度雜合，可采用F1代作圖群體的“雙假測(cè)交”方法構(gòu)建圖譜?！半p假測(cè)交”作圖的原理為：兩個(gè)高度雜合的親本當(dāng)中的許多遺傳位點(diǎn)，在雜交一代即發(fā)生分離現(xiàn)象，當(dāng)其中一親本為雜合位點(diǎn)，另一親本為純合位點(diǎn)時(shí)，F(xiàn)1代就出現(xiàn)1∶1分離，即為測(cè)交；當(dāng)親本的雙親都是雜合位點(diǎn)時(shí)，雜交一代中出現(xiàn)3∶1分離時(shí)為顯性標(biāo)記；出現(xiàn)1∶1∶1∶1或 1∶2∶1分離時(shí)為共顯性標(biāo)記；因此可用來(lái)構(gòu)建雙親分子連鎖圖和判斷雙親間的同源連鎖群[12]?！半p假測(cè)交”法構(gòu)建遺傳圖譜目前適用于多數(shù)木本植物[13-15]。

一直以來(lái)對(duì)茶樹(shù)遺傳圖譜的研究相對(duì)其他作物比較滯后。1996年，第一張茶樹(shù)遺傳圖譜被田中淳一采用“雙假測(cè)交”的方法報(bào)道，以RAPD標(biāo)記對(duì)藪北×靜-印雜131的F1分離群體作圖，構(gòu)建了部分遺傳圖譜（包含6個(gè)連鎖群），并發(fā)現(xiàn)與炭疽病抗性、抗凍能力、多酚類(lèi)含量、萌芽早晚相連鎖的RAPD標(biāo)記；但其由于連鎖群數(shù)與茶樹(shù)染色體數(shù)差異大以及標(biāo)記數(shù)量受限，因此QTLs定位及連鎖分析的精確度并不高[16]。2002年，Hackett等以SFS150為母本的半同胞F1群體，采用RAPD和AFLP標(biāo)記構(gòu)建的茶樹(shù)遺傳圖譜平均圖距為11.7cM，包含15個(gè)連鎖群，126個(gè)標(biāo)記[17]。2005年，國(guó)內(nèi)第一張茶樹(shù)遺傳圖譜由黃建安等用69份祁門(mén)4號(hào)和潮安大葉茶的雜交F1作為實(shí)驗(yàn)材料，使用AFLP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建，其中母本圖譜的208個(gè)AFLP標(biāo)記分布于17個(gè)連鎖群上，總圖距為2457.7 cM，標(biāo)記間最大距離為42.3 cM，最小距離為1.2 cM，平均間距為11.9 cM；17個(gè)連鎖群中，最大的連鎖群分布有43個(gè)標(biāo)記，圖距達(dá)514.2 cM，標(biāo)記間最大距離為27.5 cM，最小距離為1.9 cM，平均間距為12.2 cM[18]。2006年黃福平等使用16個(gè)ISSR和46個(gè)RAPD標(biāo)記成功構(gòu)建了福鼎大白回交l代遺傳連鎖圖，總圖距是1180.9 cM，標(biāo)記間的平均距離是20.l cM；當(dāng)中連鎖群LG4覆蓋的遺傳距離最大是309.3 cM，其中LG6包含的標(biāo)記數(shù)最多，總共18個(gè)標(biāo)記，平均距離為15.7 cM[19]。2010年Kamunya等采用42個(gè)茶樹(shù)后代，成功構(gòu)建了包含30個(gè)連鎖群的連鎖圖譜，總圖距是1411.ScM，標(biāo)記間的平均距離是14.1 cM；同時(shí)進(jìn)行了茶樹(shù)產(chǎn)量的QTL定位，檢測(cè)出有23個(gè)QTLs位點(diǎn)和產(chǎn)量顯著相關(guān)，其中15個(gè)QTLs遺傳來(lái)自母本，8個(gè)遺傳來(lái)自父本[20]。另外，日本等國(guó)科學(xué)家在雙假測(cè)交的基礎(chǔ)上，采用ISSR、 AFLP、RAPD和SSR標(biāo)記同樣構(gòu)建了茶樹(shù)的一部分遺傳連鎖圖[21]。2012年Taniguchi等利用SSR、RAPD、STS和CAPS標(biāo)記，同時(shí)整合了之前的兩張圖譜，是目前為止標(biāo)記密度最大、基因組覆蓋最全面的茶樹(shù)遺傳圖譜，當(dāng)中以279個(gè)SSR標(biāo)記為主的核心圖譜長(zhǎng)度是1218 cM，但是只有54個(gè)F1單株的作圖群體[22]。2013年馬建強(qiáng)構(gòu)建的雙親遺傳圖譜共15個(gè)連鎖群，與茶樹(shù)染色體數(shù)一致，包含1101標(biāo)記（SSR，373；SNP，728），圖譜覆蓋基因組長(zhǎng)度1632.8 cM，相鄰標(biāo)記間最大距離19.6 cM，最小間距0.1 cM，平均圖距為1.5 cM，連鎖群長(zhǎng)度范圍80.2～184.8 cM[23]。

目前為止構(gòu)建的茶樹(shù)遺傳圖譜有的精確度和密度有限，雖然給茶樹(shù)遺傳與育種研究帶來(lái)了動(dòng)力，但是要展開(kāi)有價(jià)值的應(yīng)用還比較困難，造成的原因主要包括：（1）分離群體較小。衡量遺傳圖譜的質(zhì)量高低是以這些遺傳標(biāo)記在圖譜中位置的精確性為準(zhǔn)而不是取決于標(biāo)記數(shù)目的多少[24]。染色體的同源重組決定了標(biāo)記在圖譜中的位置順序，所以在構(gòu)建圖譜時(shí)就需要一定數(shù)量的作圖個(gè)體以確保檢測(cè)到減數(shù)分裂時(shí)的重組事件，因此作圖群體的大小決定了遺傳圖譜的飽和度，同時(shí)還決定了從隨機(jī)分離結(jié)果可以辨別的最大圖距和兩個(gè)標(biāo)記間檢測(cè)到重組的最小圖距。由于工作量和成本的限制，需150個(gè)左右單株才能構(gòu)建分子標(biāo)記框架圖，在進(jìn)行精細(xì)研究某個(gè)連鎖區(qū)域的時(shí)候，要將作圖群體擴(kuò)大到300個(gè)以上[21,25]。（2） 分子標(biāo)記的數(shù)量不足。用于QTLs初步定位的遺傳圖譜就要求標(biāo)記間平均距離在10 cM以下，如果要進(jìn)行圖位克隆要求平均距離在1 cM以下。（3） 分子標(biāo)記的種類(lèi)。除了少數(shù)報(bào)道的茶樹(shù)遺傳圖譜是利用共顯性SSR標(biāo)記外，其他的圖譜都是用開(kāi)發(fā)成本相對(duì)較低、能夠進(jìn)行快速作圖的RAPD和AFLP標(biāo)記為主，但這類(lèi)標(biāo)記是對(duì)基因組的隨機(jī)擴(kuò)增，重現(xiàn)性和保守性較差，在不同的研究群體中具有一定的差異，因此構(gòu)建的圖譜及利用圖譜解析的QTLs具有組合特異性，無(wú)法進(jìn)行比較分析；同時(shí)在圖譜上發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記間和標(biāo)記與基因間的關(guān)聯(lián)是一種隨機(jī)關(guān)聯(lián)[26-27]；且因其擴(kuò)增片段多位于非編碼區(qū)，不能直接用于分離目標(biāo)基因[28]；使其實(shí)際應(yīng)用推廣受限。

3 構(gòu)建高密度茶樹(shù)遺傳圖譜的方法

現(xiàn)階段已建成的遺傳圖譜與實(shí)際中應(yīng)用需求相差較大，因受基因組覆蓋率和圖距等限制，因此，對(duì)以下幾點(diǎn)的深入研究十分迫切。

3.1 選擇優(yōu)良親本

使用分離群體作為遺傳材料構(gòu)建遺傳圖譜，因?yàn)槿后w親本的選擇將直接影響到遺傳圖譜構(gòu)建的難易程度和圖譜的應(yīng)用范圍。一般情況下，茶樹(shù)為異花授粉植物，任何雜交獲得的親本都可以為遺傳作圖提供足夠的DNA多態(tài)性[29]，除非常相近個(gè)體外。當(dāng)構(gòu)建茶樹(shù)遺傳圖譜時(shí)，盡量選擇DNA多態(tài)性好與親緣關(guān)系遠(yuǎn)的材料作為親本。

3.2 增加分離群體個(gè)數(shù)

擴(kuò)大分離群體的方式目前有兩種：一是為達(dá)到高精度數(shù)量性狀定位的要求，作圖的分離群體采用200～300個(gè)；二是可先隨機(jī)選擇一個(gè)小群體構(gòu)建出框架圖，再進(jìn)行部分加密，以獲得較為理想的遺傳圖譜。

3.3 分子標(biāo)記系統(tǒng)的整合和開(kāi)發(fā)

當(dāng)前所采用的分子標(biāo)記技術(shù)大部分為RAPD、SSR和AFLP。其中RAPD、AFLP為顯性標(biāo)記，較少單獨(dú)使用。其中SSR在基因組中廣泛分布，常被用于遺傳圖譜的構(gòu)建[29-30]，且具有共顯性、多態(tài)性高、重現(xiàn)性好、易檢測(cè)等特點(diǎn)，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1～6 bp[31-32]，Adams等首次提出表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs），是指從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選的克隆進(jìn)行5′或3′端測(cè)序后得到長(zhǎng)為150～500 bp的部分cDNA序列[33]。近年來(lái)，以表達(dá)序列標(biāo)簽為基礎(chǔ)開(kāi)展的茶樹(shù)基因鑒定、物種遺傳演化等研究成效顯著[34]。金基強(qiáng)等在1589條茶樹(shù)的表達(dá)序列標(biāo)簽中，發(fā)掘出分布于346條表達(dá)序列標(biāo)簽中的281個(gè)基因編碼區(qū)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列[35]；Zhao等從2119條茶樹(shù)表達(dá)序列標(biāo)簽中，找到出現(xiàn)頻率為6.8%的180個(gè)基因編碼區(qū)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列[36]。因此現(xiàn)在茶樹(shù)遺傳圖譜研究工作的重點(diǎn)，是尋找可以檢測(cè)多個(gè)等位位點(diǎn)的共顯性標(biāo)記和找到直接來(lái)源于基因表達(dá)序列的等位基因。

3.4 研究適合茶樹(shù)自身特點(diǎn)的方法和作圖理論

作圖時(shí)如果采用有親緣關(guān)系物種的雜交二代或“雙假測(cè)交”的方法將會(huì)丟失大量的遺傳信息，導(dǎo)致圖譜精確度大大降低。由于茶樹(shù)基因型高度雜合，且自交不親和，可用于連鎖分析的子代分離類(lèi)型達(dá)到7種，可配成17種不同的分離類(lèi)型對(duì)[37]。所以研究適合茶樹(shù)自身特點(diǎn)的方法和作圖理論，提高遺傳信息的使用效率對(duì)構(gòu)建高密度茶樹(shù)遺傳圖譜十分重要。

3.5 開(kāi)展比較作圖研究

通過(guò)比較作圖，對(duì)于某物種遺傳圖譜上已定位的新基因，為了大大提高基因定位的效率，可選擇在其親緣關(guān)系近的物種的染色體同源區(qū)段定位相同的基因。比較作圖揭示了物種基因組間的同源性和差異性，也為物種起源及遺傳演化研究提供了新的依據(jù)，而且各物種中可供利用的遺傳標(biāo)記數(shù)量顯著增加[38]。因此，選擇合適的DNA標(biāo)記開(kāi)展比較作圖，也是未來(lái)茶樹(shù)遺傳圖譜研究發(fā)展的一個(gè)重要趨勢(shì)。

綜上，雖然對(duì)茶樹(shù)的遺傳圖譜研究比較滯后，現(xiàn)在得到的遺傳圖譜精密度也不高，構(gòu)建方法也尚不完善，但是隨著理論和技術(shù)的不斷創(chuàng)新，茶樹(shù)遺傳圖譜的研究必將有新的發(fā)展。構(gòu)建遺傳圖譜為提高茶樹(shù)的育種效率。建立高密度的茶樹(shù)分子遺傳圖譜，定位和目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，有利于在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育初期選擇群體中含有目標(biāo)基因的植株，推動(dòng)育種工作和其他應(yīng)用的順利進(jìn)展。

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Research Progress in Genetic Map of Tea Plant (Camellia sinensis)

SHI Yu-lan，ZHENG Chu-chu，CHEN Si，OU Shu-qiong，PENG Jing，WANG Kun-bo*
（Tea science ministry of education key laboratory of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

Genetic maps are important tools in plant genomics and breeding. In this paper, the construction procedure of genetic mapping and research progress in genetic map of tea plant were introduced. Therefore, we proposed improved strategies for the construction of genetic map of tea plant.

Camellia sinensis, Genetic map, Molecular markers

S571.1

A

1009-525X（2017）02-03-07

2017-04-21

2017-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470692、31670691和31500567）

石玉蘭（1993-），女，湖南邵陽(yáng)人，在讀碩士研究生，研究方向：茶葉生物化學(xué)。

*通訊作者：王坤波（1976-），男，湖北十堰人，教授，主要從事茶葉功能成分化學(xué)和茶樹(shù)次生代謝調(diào)控的研究。Email：wkboo163@163.com