肢體缺血后處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠 Caspase-3 和細(xì)胞凋亡的影響

韋家俊 李 浩 廖小明 吳 嵐 王耀輝 劉開祥

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

肢體缺血后處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠 Caspase-3 和細(xì)胞凋亡的影響

韋家俊 李 浩 廖小明 吳 嵐 王耀輝 劉開祥

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

目的 探討肢體缺血后處理(Lpost)對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注區(qū)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3和細(xì)胞凋亡的影響。方法 健康雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、肢體缺血后處理組(Lpost組)，I/R組、Lpost組均行缺血2 h再灌注24 h局灶性腦缺血再灌注模型。Lpost組再灌注前實(shí)施肢體缺血后處理(缺血15 min，灌注15 min)3個(gè)循環(huán)。各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，采用四氮唑紅(TTC) 染色確定腦缺血半暗帶位置，TUNEL 測(cè)定細(xì)胞凋亡，免疫組化測(cè)定 Caspase-3 的表達(dá)變化。結(jié)果 Sham組神經(jīng)缺損評(píng)分為 0 分；與 Lpost 組(1.20 ± 0.41)比較，I/R 組神經(jīng)功能缺損較重(2.40±0.51，P<0.05)；TTC 染色證實(shí)缺血半暗帶位于大腦矢狀裂至外側(cè)裂上1/3的皮質(zhì)組織。與Sham組相比，I/R組、Lpost 組缺血半暗帶內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)、Caspase-3表達(dá)均明顯增加(P< 0.05)，且I/R組表達(dá)明顯增強(qiáng)，高于Lpost組(P<0.05)。結(jié)論 肢體Lpost可減輕腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，緩解神經(jīng)細(xì)胞的壞死，其作用機(jī)制可能與減少 Caspase-3 表達(dá)有關(guān)。

缺血再灌注；肢體缺血后處理；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸蛋白酶-3

肢體缺血后處理(Lpost)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的可以減少腦缺血再灌注損傷的方法。以往研究證實(shí)〔1〕，Lpost 可以減少腦缺血再灌注后的腦梗死體積，但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)參照 Zea Longa 線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，通過(guò)觀察 Lpost 對(duì)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3和細(xì)胞凋亡的影響，探討 Lpost 減少腦缺血再灌注損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 TUNEL 法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試驗(yàn)盒購(gòu)于羅氏公司、DAB顯色試劑盒及Caspase-3兔多克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SPF 級(jí)雄性SD大鼠36只(體質(zhì)量240～260 g)，由廣西醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、肢體缺血后處理組(Lpost組)，I/R 組、Lpost 組均行缺血 2 h再灌注 24 h 局灶性腦缺血再灌注模型。Lpost組阻斷大腦中動(dòng)脈2 h后，于再灌注時(shí)夾閉雙下肢動(dòng)脈15 min，松開15 min，反復(fù)3次。

1.3 局灶性腦缺血再灌注模型的制備 采用改良的MCAO模型制備方法〔2〕，步驟如下：大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg i.p.)麻醉，取頸部左旁正中切口3～4 cm，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCa)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，雙極電凝器凝斷 ECA 及其分支，用動(dòng)脈夾夾閉 ICA、CCA 近心端，在ECA分叉遠(yuǎn)心端用眼科剪斜行剪一倒“V”小口并導(dǎo)入栓線，栓線自左ECA 插入CCA分叉處，固定線栓、調(diào)整方向，將線栓插入左ICA，松開動(dòng)脈夾，緩慢推進(jìn)，稍感阻力即止，此時(shí)插入深度約為18～19 mm。缺血120 min抽出線栓完成MCAO/R模型。Sham組：不做腦缺血，栓線插入深度<9 mm。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 大鼠腦缺血2 h 再灌注24 h，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。參照Longa 等〔3〕神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)神經(jīng)功能缺損為0分；病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直為1分；行走向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分；身體向癱瘓側(cè)跌倒為3分；出現(xiàn)意識(shí)障礙為4分。神經(jīng)功能缺損達(dá)1～3分者視為模型制作成功。

1.5 腦梗死體積測(cè)定 缺血2 h再灌注24 h，各組隨機(jī)取6只大鼠，過(guò)度麻醉后取腦，-4℃ 冷藏10 min，冠狀切面切成均勻的5片，每片約3 mm，置于2% TTC溶液避光溫育、多聚甲醛液固定。梗死灶區(qū)呈白色，正常呈紅色。利用CAD處理軟件，計(jì)算出各缺血側(cè)的總體積和梗死區(qū)的體積，再求梗死區(qū)占半球總體積的百分比。

1.6 TUNEL染色及Caspase-3染色 缺血2 h再灌注24 h，各組隨機(jī)取6只大鼠，用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。夾閉腹主動(dòng)脈，用4℃生理鹽水經(jīng)左心室穿刺灌注，待右心耳充盈后將其剪開，灌注約100 ml后，再用4%多聚甲醛磷酸緩沖液200～300 ml灌洗固定，斷頭取視交叉前后2 mm腦組織，中性甲醛固定48 h，經(jīng)石蠟包埋、切片。按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TUNEL染色，胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。再采用SP法檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)，具體操作均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。兩種染色每張切片觀察10個(gè)高倍鏡視野(×400)，計(jì)算平均每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 Sham組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為0分；與I/R組比較，Lpost組神經(jīng)功能缺損較輕(P<0.05)，見表 1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及 Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與Lpost組比較：2)P<0.05

2.2 腦梗死體積測(cè)定 TTC 染色后，缺血梗死區(qū)腦組織呈白色，主要分布在矢狀裂至外側(cè)裂下2/3的皮質(zhì)以及視交叉前后3 mm之間；矢狀裂至外側(cè)裂上1/3的皮質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)白色向紅色的過(guò)渡，為缺血半暗帶的區(qū)域；正常腦組織被染成紅色。與Lpost組比較，I/R組腦梗死體積較大(P<0.05)，見表 1。

2.3 各組大鼠神經(jīng)元凋亡的比較 Sham組可見少量的凋亡細(xì)胞；與I/R組凋亡細(xì)胞數(shù)(27.83±2.93)%相比，Lpost組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少〔(17.67±2.16)%,P<0.05〕，見圖1。

2.4 Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 Caspase-3主要分布于神經(jīng)元，鏡下見胞質(zhì)、胞核棕黃色著色為陽(yáng)性，見圖2。Sham組僅有少量Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)；與I/R組比較，Lpost組 Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠缺血區(qū)腦組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(×400)

圖2 各組大鼠缺血區(qū)腦組織 Caspase-3的表達(dá)(DAB，×400)

3 討 論

研究表明〔4〕，缺血中心區(qū)神經(jīng)元的壞死和缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡是缺血性腦卒中后神經(jīng)元的死亡主要表現(xiàn)形式。然而，缺血半暗帶的腦組織損傷具有可逆性，如何有效干預(yù)缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡已然成為研究的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果證實(shí)，肢體缺血后處理減少大鼠腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量，且下調(diào)相應(yīng)區(qū)域 Caspase-3 的表達(dá)，從而發(fā)揮缺血再灌注后腦保護(hù)的作用。

Lpost對(duì)缺血腦組織具有保護(hù)作用，但是其保護(hù)機(jī)制尚不明確。Sun等〔5〕在大鼠腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，肢體缺血后處理可通過(guò)神經(jīng)途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lpost 減輕腦缺血損傷可能是通過(guò)協(xié)同缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制介導(dǎo)的。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)作為細(xì)胞凋亡過(guò)程的重要蛋白酶在凋亡的最后實(shí)施過(guò)程中起決定性的作用，而 Caspase-3 作為多種凋亡程序啟動(dòng)的執(zhí)行者，有著非常重要的意義和作用〔6〕。以往研究證實(shí)〔7〕，抑制 Caspase-3 的活性對(duì)缺血性腦損傷具有較明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。Caspase-3作為 Caspases 家族重要的成員，在細(xì)胞內(nèi)以前體的形式存在。研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，激活細(xì)胞凋亡途徑可以介導(dǎo) Caspase-3 前體表達(dá)及活化水平的上調(diào)。本研究結(jié)果提示，Lpost 可以介導(dǎo)局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū) Caspase-3 表達(dá)的下調(diào)，減小腦組織梗死的體積，減輕神經(jīng)功能缺損評(píng)分，抑制神經(jīng)元發(fā)生進(jìn)行性損傷，從而對(duì)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

綜上，肢體缺血后處理可以減輕局灶性腦缺血再灌注缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)的作用，有利于缺血半暗帶的轉(zhuǎn)歸，其機(jī)制可能與下調(diào)缺血半暗帶 Caspase-3 的表達(dá)有關(guān)。

1 韓 冬，白 洋，馬 爽，等.缺血后處理對(duì)大鼠缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(8)：1854-5.

2 王耀輝，李國(guó)輝，馮華坤，等.線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的體會(huì)與評(píng)價(jià)〔J〕.中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2013；16(10)：1686-8.

3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

4 張紅明，曾子玲，李曉燕.線粒體依賴的凋亡通路與缺血性腦卒中〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2013；15(7)：778-80.

5 Sun XC，Li WB，Li QJ，etal.Limb ischemic preconditioning induces brain ischemic tolerance via p38 MAPK〔J〕.Brain Res，2006；1084(1)：165-74.

6 Dejonckheere E，Vandenbroucke R，Libert C.Matrix metalloproteinases as drug targets in ischemia/reperfusion injury〔J〕.Drug Discovery Today，2011；16(17)：762-78.

7 高維娟，張 霞，劉莎莎.大鼠腦缺血再灌注后海馬 CA1 區(qū) Caspase-3 的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(24)：6202-4.

8 莊 嚴(yán)，王丹丹，柳忠蘭，等.吸煙對(duì)大鼠局灶性腦缺血后Caspase-3表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(1)：156-8.

〔2015-10-10修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢(mèng)園)

廣西省自然科學(xué)基金(2012jjAA40148)；桂林市科技開發(fā)項(xiàng)目(0110119-1-6)

韋家俊(1976-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管疾病研究。

R743

A

1005-9202(2017)04-0804-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.009