DNA分子定量技術(shù)研究

李博洋

摘 要：核酸的序列、多樣性和豐度分析是現(xiàn)代生物學(xué)的基礎(chǔ)。DNA定量檢測(cè)在腫瘤早期研究、產(chǎn)前檢查、環(huán)境微生物分析、遺傳病研究等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本文介紹了三種核酸定量技術(shù)，包括光度分析法、熒光定量PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)，系統(tǒng)闡述了各項(xiàng)技術(shù)的原理、特點(diǎn)及其應(yīng)用，并對(duì)各方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較，以供廣大科研工作者在實(shí)際檢測(cè)工作中借鑒和運(yùn)用。

關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；定量；DNA檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）02-0255-02

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)是20世紀(jì)最偉大的科學(xué)發(fā)現(xiàn)之一，標(biāo)志著生物學(xué)研究進(jìn)入了分子水平。1985年聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）被提出，極大程度地促進(jìn)了DNA研究的發(fā)展。DNA分子定量檢測(cè)作為生物學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)基本的技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景，包括腫瘤早期研究、產(chǎn)前檢查、環(huán)境微生物分析、遺傳病研究等。目前，DNA分子定量測(cè)量技術(shù)主要包括熒光定量PCR技術(shù)、數(shù)字PCR技術(shù)以及光度分析法。

現(xiàn)將有關(guān)研究情況報(bào)告如下：

1 熒光定量PCR

1.1 熒光定量PCR原理

熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR）簡(jiǎn)稱(chēng)為qPCR，使目前運(yùn)用最廣泛的DNA定量技術(shù)。它的原理為：進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)加入一個(gè)特殊的熒光探針，對(duì)PCR產(chǎn)物標(biāo)記跟蹤。每增加一條DNA序列，就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新的熒光分子，使熒光分子信號(hào)與PCR產(chǎn)物濃度形成一定關(guān)系，再利用相關(guān)軟件分析，計(jì)算待測(cè)序列的初始數(shù)量。

理論上PCR的過(guò)程應(yīng)該為指數(shù)增長(zhǎng)，但實(shí)際上擴(kuò)增曲線(xiàn)并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)圖像，而是S形曲線(xiàn)。原因是，當(dāng)循環(huán)次數(shù)增加時(shí)，引物、Taq酶、DNA模板等濃度逐漸降低，PCR的效率隨之下降，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度也逐漸下降。當(dāng)所有Taq酶飽和之后，PCR即進(jìn)入平臺(tái)期。不同的PCR反應(yīng)由于各種因素的影響，難以精確控制其進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間以及平臺(tái)期高度。因此PCR實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性并不高，結(jié)果存在較大差異。

qPCR通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)來(lái)克服這一弊端。傳統(tǒng)的qPCR認(rèn)為在指數(shù)擴(kuò)增的初始階段，樣品間的細(xì)小誤差并未放大，可認(rèn)作擴(kuò)增效率恒定。達(dá)到閾值前循環(huán)次數(shù)記為CT（cycle threshold），對(duì)每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。對(duì)于任一個(gè)PCR反應(yīng)，到達(dá)循環(huán)閾值時(shí)有：

Nt=N0（1+ E）CT

其中，N0為初始模板的拷貝數(shù)，Nt為第CT個(gè)循環(huán)時(shí)產(chǎn)物的拷貝數(shù)，E為擴(kuò)增效率。對(duì)于特定的PCR反應(yīng)，CT個(gè)循環(huán)的拷貝數(shù)Nt和擴(kuò)增效率E均為定值，因此CT僅由初始模板數(shù)量N0有關(guān)。由此可以得到初始DNA的數(shù)量。

1.2 熒光定量PCR特點(diǎn)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的發(fā)明，極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過(guò)程，并實(shí)現(xiàn)了真正的絕對(duì)定量。這種技術(shù)保證了工作效率，反應(yīng)迅速、靈敏度搞、可重復(fù)性強(qiáng)、特異性號(hào)，結(jié)果清晰。

熒光定量PCR也具有一定缺點(diǎn)：由于在PCR擴(kuò)增的過(guò)程中，有很多因素可能會(huì)影響其擴(kuò)增效率，例如引物濃度、溫度、酶等，因此其擴(kuò)增效率難以保持恒定，導(dǎo)致準(zhǔn)確度下降。同時(shí)，由于qPCR的結(jié)果需要與校準(zhǔn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行對(duì)比，依賴(lài)外標(biāo)，是一種相對(duì)定量的方法。

1.3 熒光定量PCR應(yīng)用

目前主要的應(yīng)用有：（1）臨床疾病診斷及療效評(píng)估，包括艾滋病、結(jié)核、各種肝炎等；優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)，包括血友病、胎兒畸形、性別發(fā)育異常、地中海貧血等；腫瘤診斷，通過(guò)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物或部分腫瘤基因；遺傳病檢測(cè)。（2）動(dòng)物疾病檢測(cè)，包括口蹄疫、禽流感、豬瘟、炭疽芽孢桿菌等。（3）食品安全檢測(cè)，包括食物過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因、微生物等。（4）科學(xué)研究，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

2 數(shù)字PCR

2.1 數(shù)字PCR原理

數(shù)字PCR（digital PCR），簡(jiǎn)稱(chēng)dPCR，是一項(xiàng)核酸定量檢測(cè)的新技術(shù)。不同于傳統(tǒng)的熒光定量PCR，該技術(shù)不依靠任何外標(biāo)實(shí)現(xiàn)直接計(jì)數(shù)目標(biāo)物。將樣本稀釋至達(dá)到單分子水平，平均分配到幾十至幾萬(wàn)個(gè)芯片微反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)。這樣的分配方式可以保證分子獨(dú)立擴(kuò)增，消除了本底信號(hào)的影響，提高了靶標(biāo)擴(kuò)增的靈敏度。擴(kuò)增結(jié)束后采集每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，最后通過(guò)直接計(jì)數(shù)或者泊松分布公式計(jì)算得到樣品的原始濃度或含量。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，記有熒光信號(hào)的單元為1，不含有熒光信號(hào)的單元為0，其中有熒光標(biāo)記的反應(yīng)單元里至少含有一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子。由于擴(kuò)增前進(jìn)行稀釋?zhuān)梢哉J(rèn)為樣品中目標(biāo)DNA的濃度極低，有熒光標(biāo)記的反應(yīng)單元數(shù)等于目標(biāo)分子的拷貝數(shù)。在一般情況下，各個(gè)反應(yīng)單元中可能包含兩個(gè)或以上的目標(biāo)分子，所以采用泊松分布公式計(jì)算。

數(shù)字PCR的分辨率指的是對(duì)目標(biāo)基因的識(shí)別能力，除了與監(jiān)測(cè)設(shè)備的靈敏度、PCR的擴(kuò)增效率有關(guān)之外，極大程度依賴(lài)于反應(yīng)單元的數(shù)目n。理論上，每個(gè)反應(yīng)單元最多存在一個(gè)拷貝的DNA分子，在相同體積的情況下，n=102時(shí)，該方法的最大分辨率為1/100，也就是說(shuō)濃度高于1%的樣本才可以被檢測(cè)出來(lái)；當(dāng)n=104時(shí)，濃度高于0.01%的樣本就可以被檢測(cè)出來(lái)。因此，反應(yīng)單元的數(shù)目越多，數(shù)字PCR的靈敏度越高，準(zhǔn)確度也越高

2.2 數(shù)字PCR設(shè)備

可以看出，dPCR技術(shù)對(duì)操作反應(yīng)器的要求很高。在20世紀(jì)末期，主要使用96孔或384孔平板，然而加樣操作的復(fù)雜性限制了測(cè)量準(zhǔn)度和通量。2003年，Liu等首次采用微流體這一概念，實(shí)現(xiàn)了400個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)，這一數(shù)字在2008年被提升至9180個(gè)。在最近的研究中，Heyries等發(fā)明了一個(gè)百萬(wàn)級(jí)別的微流體狀體，實(shí)現(xiàn)了dPCR技術(shù)的再次突破。該裝置通過(guò)表面張力控制樣品分布情況，達(dá)到每皮升100萬(wàn)個(gè)反應(yīng)。

dPCR具有很高的市場(chǎng)價(jià)值。2006年，美國(guó)Fluidigm公司率先推出第一款dPCR設(shè)備——BioMark系列高通量基因分析芯片系統(tǒng)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的多家公司致力于研發(fā)更高通量和靈敏度的dPCR產(chǎn)品，反映出該新興技術(shù)的巨大潛力。

2.3 數(shù)字PCR特點(diǎn)

數(shù)字PCR技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：操作方便、定量準(zhǔn)確、特異性好、靈敏度高，在循環(huán)閾值CT難以分辨的情況下，具有不可代替性的作用。此外，dPCR還具有高通量性，能夠同時(shí)并行地測(cè)定幾十萬(wàn)到百萬(wàn)級(jí)別的DNA分子序列。

但是，dPCR也具有一定的局限性：盡管通量高，但上萬(wàn)反應(yīng)單元往往針對(duì)同一樣本，因此在普通的基因監(jiān)測(cè)中并無(wú)突出優(yōu)勢(shì)。與此同時(shí)，數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)設(shè)備要求高，高精密儀器和復(fù)雜芯片的運(yùn)用使之價(jià)格昂貴，也因此制約了該項(xiàng)技術(shù)的普及。

2.4 數(shù)字PCR應(yīng)用

在qPCR技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)上，dPCR技術(shù)在某些領(lǐng)域表現(xiàn)出其顯著的卓越性：1）單細(xì)胞基因表達(dá)。由于dPCR技術(shù)具有高精度的優(yōu)點(diǎn)，因此可以準(zhǔn)確測(cè)量單細(xì)胞中的DNA序列。White等設(shè)計(jì)了一套dPCR設(shè)備，可用于捕捉單細(xì)胞并加工處理。Guo等采用該技術(shù)研究受精卵到囊胚水平的單細(xì)胞基因表達(dá)。2）環(huán)境微生物研究。dPCR技術(shù)的高通量性為同時(shí)研究多個(gè)細(xì)菌中多個(gè)基因提供幫助。例如Tadmor等利用該技術(shù)研究病毒宿主，發(fā)現(xiàn)不同的宿主間存在等位基因混合現(xiàn)象。3）單分子測(cè)序。Zernant等利用dPCR尋找ABCA4疾病的基因異常情況；Jones等通過(guò)驗(yàn)證先天性糖基化缺陷基因的序列，提供了先天性糖基化缺陷在分子水平的診斷手段。

3 光度分析法

組成DNA的堿基具有一定的吸光特性，根據(jù)核酸分子的吸光度可以定量計(jì)算DNA濃度。

DNA分子具有吸收250-280nm波長(zhǎng)的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm，吸光值記作OD260，因此一般采用紫外線(xiàn)作為光源。計(jì)算OD260與不同濃度DNA溶液之間的線(xiàn)性關(guān)系，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)值，即可得到結(jié)果。

當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。此時(shí)熒光同時(shí)檢測(cè)一批樣品的OD260、OD280和OD230，計(jì)算其比值來(lái)衡量樣品的純度。

一般認(rèn)定純DNA為OD260/OD280≈1.8（>1.9，表明存在RNA污染；<1.6，表明存在蛋白質(zhì)或酚類(lèi)等污染）。若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無(wú)法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量，可使用其他方法進(jìn)行估算。這種方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，一般應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室。

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